Pingping Zou

Pingping Zoua,†, Yuelin Songb,†, Wei Leia, Jun Lib, Pengfei Tua,b,

Yong Jiang,⁎

Laboratori clau d'acetat de fàrmacs naturals i biomimètics, Escola de Ciències Farmacèutiques, Universitat de Pequín, Pequín 100191, Centre de recerca modern de la Xina per a la medicina tradicional xinesa, Escola de Matèria Mèdica xinesa, Universitat de Medicina Xinesa de Pequín, Pequín 100029, Xina

Rebut el 17 de maig de 2017; revisat el 20 de juny de 2017; acceptat el 17 de juliol de 2017

Resum: Cistanche deserticola(CD) és una de les dues plantes font autoritzades deCistanches Herba, una planta medicinal molt coneguda. Aquí, es va utilitzar l'espectroscòpia de RMN 1H per caracteritzar el perfil químic i distingir les diferents parts, així com per proposar un nou flux de treball de processament per a CD. L'assignació del senyal es va aconseguir mitjançant múltiples tècniques espectroscòpiques de RMN d'una i dues dimensions en combinació amb bases de dades disponibles i compostos autèntics. Les parts superiors de la planta es van distingir de les parts inferiors combinant el conjunt de dades espectroscòpiques de RMN 1H amb anàlisi estadística multivariant. Es va demostrar que un nou mètode de processament amb guionets al vapor amb liofilització era superior al vapor juntament amb l'assecat al forn o a la liofilització directa mitjançant una caracterització metabolòmica basada en 1H RMN. Glicòsids feniletanoides, principalment equinacòsid iacteòsid, es van eliminar i es van confirmar com els marcadors químics responsables de mostrar la superioritat del nou flux de treball de processament, mentre que els metabòlits primaris en sèrie, especialment els hidrats de carboni i els metabòlits del cicle de l'àcid tricarboxílic, es van trobar com a molècules primàries que regeixen la discriminació entre les parts superior i inferior de la planta. Col·lectivament, l'espectroscòpia de RMN 1H es va demostrar com una eina analítica versàtil per caracteritzar el perfil químic i per guiar l'explotació en profunditat del CD proporcionant informació qualitativa i quantitativa completa.

PARAULES CLAU:Cistanchedeserticola; Metabolòmica basada en RMN 1H; flux de treball de processament; Diferents parts;Glicòsid feniletanoide; Metabòlits del cicle de l'àcid tricarboxílic;Echinacòsid; Acteòsid

Per a més informació poseu-vos en contacte amb:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola té molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més

1. Introducció

Cistanches Herba(CH, nom xinès: Roucongrong), arxivat inicialment aMatèria mèdica xinesa de Shen Nong, ha estat àmpliament considerada com una de les plantes tòniques i medicinals comestibles més conegudes, i honrada com "Ginseng dels deserts"^1,2. Com una de les dues plantes d'origen oficial de CH,Cistanche deserticola(CD, Orobanchaceae) és una planta holoparàsita i es distribueix principalment al nord i nord-oest de la Xina.^2,3. S'ha utilitzat àmpliament per als tractaments de la deficiència renal caracteritzada per la impotència, el dolor als lloms i els genolls, l'esterilitat femenina i el restrenyiment en les pràctiques medicinals tradicionals xineses durant segles.^3–5. No obstant això, les fonts salvatges de CD estan al límit de l'extinció en els darrers anys a causa de la collita excessiva, i ha estat catalogada com una de les plantes de classe II que necessita protecció a la Xina.¹. A més, el CD ofereix una contribució important al control del desert. Per tant, és crític, però difícil, utilitzar aquest material a base d'herbes de manera més eficaç.

Estudis científics sobreCistancheplantes iniciades a la dècada de 1980⁶. Les investigacions fitoquímiques van revelar l'existència de diversos tipus químics,e.g., glicòsids feniletanoides (PhG), iridoides, lignans, àcids grassos, alditols i hidrats de carboni, dins de CD⁷. Entre ells, els PhG s'esmenten amb més freqüència a causa del seu ampli espectre d'activitats biològiques, com ara antioxidació, antienvelliment, antifatiga, antiinflamació, millora de la immunitat corporal, millora de l'aprenentatge i la memòria dels ratolins amb malaltia d'Alzheimer, etc.¹. Recentment, els PhG estan cridant cada cop més l'atenció com a nous candidats potencials a fàrmacs per tractar trastorns neurodegeneratius. En particular, s'ha desenvolupat una amalgama del total de PhGs trobats a CH com a nou fàrmac, registrat com a totalCistancheglucòsidcàpsula (Memoregain^®) per al tractament de la demència vascular⁸. L'equinacòsid, el constituent més abundant i eficaç dels PhG totals, presenta efectes anti-apoptòtics sobre les cèl·lules neuronals SHSY5Y després de l'apoptosi induïda per TNF i reverteix els dèficits en els ratolins de la malaltia de Parkinson.⁹. A més, un altre compost actiu primari, l'acteòsid (també conegut com a verbascòsid) és capaç d'antagonitzar l'apoptosi a les neurones.¹⁰per defensar-se de la neurotoxicitat a les cèl·lules PC12 induïda per 1-metil-4-fenilpiridi o glutamat¹¹i per millorar els dèficits de memòria induïts per escopolamina².

Similar aCordycepsiGinseng, el CD ha estat molt consumit i valorat com a aliment saludable. És probable que els beneficis reals i percebuts de la CD tinguin un paper determinant en el preu del fàrmac cru. Atesa la gran quantitat de drogues brutes de CD, les rodanxes són més populars al mercat. En general, la inactivació enzimàtica i la privació d'aigua són els dos passos clau durant el processament de llesques medicinals. Els mètodes d'assecat convencionals de CD inclouen l'aïllament, l'assecat al forn, la salaó i l'emmagatzematge al celler. No obstant això, els productes d'aquests processos solen patir un aspecte mal vist i un baix contingut de PhG, la qual cosa dificulta l'amplia aplicació i el consum de CD. L'any 2007, el nostre grup va proposar una nova tècnica de processament de CD que preservava de manera espectacular el contingut d'echinacòsid iacteòsiden rodanxes¹⁴. No obstant això, com que els productes d'aquest procés encara pateixen un aspecte desagradable, actualment es descriu una metodologia de processament per millorar l'aspecte i preservar encara més el contingut de PhG en els materials processats.

Fins ara s'han aplicat eines analítiques en sèrie per a l'anàlisi química de CD, inclosa la cromatografia de capa fina, la cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) juntament amb diversos detectors, com ara el detector de matriu de díodes (DAD), el detector de dispersió de la llum evaporativa (ELSD), detector de captura d'electrons (ECD) i espectròmetre de masses en tàndem (MS/MS). Els PhG, en particular l'echinacòsid i l'acteòsid, s'han adoptat amb més freqüència com a marcadors de qualitat¹. L'empremta digital d'aquest fàrmac a base d'herbes també s'ha desenvolupat mitjançant HPLC-DAD i HPLC-DAD-MS/MS^15,16. No obstant això, continua sent un repte avaluar la qualitat de la CD a causa del seu perfil químic extremadament complex. En termes generals, els enfocaments dirigits a diversos analits no són capaços d'oferir una visió química holística dels extractes bruts, tot i que es pot obtenir abundant informació qualitativa i quantitativa a partir de LC-MS/MS. A més, les estratègies analítiques relacionades amb l'HPLC poden estar limitades per grans quantitats de dissolvents, preparació de mostres tediosa i/o procediments que requereixen temps. Per tant, per a una anàlisi química òptima es requereix una nova eina analítica apta per al propòsit que sigui capaç de proporcionar informació completa del conjunt de compostos. Afortunadament,¹L'espectroscòpia de RMN H s'ha demostrat exactament com una eina atractiva "tot en un" que és capaç d'oferir no només un conjunt de dades qualitatius sinó també informació quantitativa per a una àmplia gamma de metabòlits primaris i secundaris amb una preparació senzilla de mostres i una adquisició ràpida.^17–20. Fins ara, àmplies aplicacions de¹S'ha llançat l'espectroscòpia de RMN H per a la determinació simultània, el perfil químic i la metabolòmica de matrius complexes.

Tot i que s'han dut a terme diverses investigacions sobre aquesta preciosa herba medicinal, el seu perfil químic global és en gran part desconegut. Com que el CD és una planta paràsit, les parts inferiors haurien de ser les responsables de transmetre les substàncies nutritives, principalment metabòlits primaris, des de l'hoste cap a les parts superiors, mentre que el metabolisme energètic vigorós, com la flor, sol produir-se a les parts superiors. Per tant, és raonable suposar que es produeixen diferències pel metaboloma de diferents parts. Per tant, en l'estudi actual, pretenem 1) caracteritzar de manera exhaustiva el perfil químic de l'ús de CD¹Espectroscòpia de RMN H combinada amb diverses mesures de RMN bidimensionals (2D); 2) aclarir les diferències entre la part superior i la inferior, i 3) proposar un nou flux de treball de processament mitjançant¹Estudi metabolòmic basat en RMN H. S'espera que les troballes obtingudes proporcionin pautes sòlides per a una millor explotació d'aquesta herba medicinal, en particular per a l'ús de diferents peces i tècniques de processament.

2. Experimental

2.1. Materials vegetals

Es van recollir dotze lots de materials frescos (CD1–CD12, taula S1, informació suplementària) de les regions autònomes de Mongòlia Interior, Xinjiang i Ningxia a la Xina. Els orígens botànics de tots els materials bruts van ser autenticats com

Metabolòmica basada en RMN 1HCistanche deserticola 649C. deserticolad'un dels autors, el Prof. Pengfei Tu. Tots els exemplars de val es dipositen a l'herbari del Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine de la Universitat de Pequín (Beijing, Xina).

2.2. Química i reactius

Metanol-d4 (CD3OD, abundància de deuteri, 99,8 per cent d'àtoms D), aigua deuterada (D2O, abundància de deuteri, 99,8 per cent d'àtoms D) i 3-trimetilsilil [2,2,3,3- d4 de sodi ] propionat (TSP-d4) es va obtenir dels laboratoris d'isòtops de Cambridge (Andover, MA, EUA). El metanol de grau analític es va comprar a Beijing Chemical Works (Beijing, Xina).

Els compostos autèntics, inclosos l'equinacòsid, l'acteòsid i el manitol, es van purificar anteriorment de CD al nostre laboratori14, i Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) va subministrar sacarosa, -galactosa, juntament amb -glucosa. Es va determinar que les pureses de totes les referències eren més del 98 per cent mitjançant anàlisis HPLC-UV i 1H RMN.

2.3. Preparació de la mostra

Tots els materials bruts (CD1–CD11) excepte el CD12 es van tallar a les parts superiors (GU) i les parts inferiors (GD) al centre de les tiges senceres, i totes les parts es van tallar en rodanxes fines (aproximadament 6- mm). -gruixuda cadascuna). Posteriorment, totes les rodanxes de CD1–CD12 es van cuinar al vapor successivament durant 10 min i es van assecar al forn a 6{{40}} graus durant 48 h per obtenir mostres de tipus a. Altres dos mètodes de processament, inclòs la liofilització directa i la liofilització 10-min seguida de la liofilització seqüencial, es van dur a terme per a algunes mostres seleccionades, com ara CD1-GU, CD4-GU, CD4-GD, CD11-GD i CD12, per oferir dos conjunts addicionals de mostres processades (mostres de tipus b i c). Les descripcions detallades de totes les mostres es mostren a la taula S1. Abans de l'extracció, totes les llesques processades es van triturar en pols amb un molí de mostres (model YF102, Ruian Yongli Pharmacy Machinery, Xina) i es van tamisar a través d'un sedàs de 80 malles. Els materials vegetals polveritzats es van pesar amb precisió (aproximadament 200 mg per a cadascun) i es van extreure amb 50- vegades de metanol aquós al 50% (p/v) en un bany d'aigua ultrasònic (25 graus) durant 40 min. Després, es va afegir metanol aquós al 50 per cent per compensar el pes perdut durant l'extracció. Cada extracte es va centrifugar a 10,000xg a 10 graus durant 10 min i es va filtrar a través d'una membrana de 0,22 μm. Posteriorment es van evaporar alíquotes (2 ml) del sobrenedant i es van assecar posteriorment mitjançant un assecat al buit a 30 graus durant 30 min. Els residus secs de cada mostra es van reconstituir mitjançant una barreja de 0,5 ml (1:1, v/v) de CD3OD i tampó fosfat en D2O que contenia un 0,05 per cent de TSP-d4 (pH 7,4) i després la solució es va transferir a un tampó de 5 mm. (id) Tub de RMN (Norell ST500-7) per a assajos de RMN. Cada mostra es va analitzar per triplicat.

2.4. Mesures de RMN

Tots els espectres de RMN 1H, RMN 13C i RMN 2D es van registrar en un espectròmetre Varian Unity Plus 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, EUA) a una freqüència de protons de 499,91 MHz equipat amb Criosonda TCI i sistema de gradient Z. Es van aplicar paràmetres idèntics tant per a extractes com per a compostos de referència per obtenir espectres comparables. Per a les mesures de RMN 1H, es van adquirir 256 exploracions amb els paràmetres següents: amplada de l'espectre, 8012,6 Hz (16 ppm); amplada del pols, 11,05 μs (angle d'inflexió de 90 graus); temps d'adquisició, 2,04 s; retard de relaxació (d1), 2 s; i temperatura, 298 K. Es va utilitzar CD3OD per bloquejar la freqüència de camp, i els desplaçaments químics de tots els espectres es van alinear mitjançant el senyal de TSP-d4 a δ 0.00. Es va adoptar un procediment humit per suprimir la intensitat del senyal H2O que residia al voltant de δ 3,3021. Es va aplicar una funció exponencial amb un factor d'ampliació de línia (LB) de 0,3 Hz i les dades es van omplir de zero per donar almenys cinc punts de dades per sobre de la mitja amplada per a cada ressonància per garantir una integració precisa i fiable. Els senyals de decaïment per inducció lliure (FID) van ser transformats de Fourier (FT) i tots els espectres es van esmenar i corregir manualment mitjançant un programa de línia base polinomi automatitzat.

Per ajudar a la caracterització química i l'assignació de senyals,

13C RMN i diverses anàlisis de RMN 2D, com ara 1H–1H

L'espectroscòpia de correlació (1H–1H COSY), l'espectroscòpia de coherència quàntica única heteronuclear (HSQC) i l'espectroscòpia de correlació d'enllaços múltiples heteronuclears (HMBC) també es van adquirir per a una mostra representativa (CD1-GUI) mitjançant aquests programes predeterminats. L'amplada espectral de COSY va ser δ 0.5–1{0.0 en ambdues dimensions i increments de 128t1 per a cada t1. Es van afegir setze transitoris amb un retard de relaxació d'1,00 s amb 822 dades complexes.

Les constants òptimes d'acoblament heteronuclear d'un enllaç i d'enllaç n per a HSQC i HMBC eren de 146 i 8 Hz, respectivament. Els intervals es van establir com a –0,5–10.0 ppm a la dimensió F2 i 0–200 ppm a la dimensió F1, respectivament.

2.5. Anàlisi estadística multivariant del conjunt de dades espectroscòpiques de RMN

Els espectres de RMN 1H es van processar mitjançant el programari MestReNova (versió 5.2.5, Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Espanya). Cada espectre es va escalar a la intensitat total i es va reduir a regions integrades de la mateixa amplada (0.{02 ppm) entre la regió de δ 0,50–9,50 després d'excloure les regions de δ 4,70–

5.02 i δ 3,26–3,36 per ometre els senyals residuals d'aigua i metanol, respectivament. L'anàlisi de components principals (PCA) amb l'escala de Pareto (Par) i l'anàlisi discriminant de mínims quadrats parcials ortogonals (OPLS-DA) amb l'escala de variància unitària (UV) es van realitzar amb el programari SIMCA-P 12.0 (Umetrics, Umeå, Suècia).

2.6. Determinació simultània d'equinacòsid i acteòsid mitjançant HPLC-UV

Per validar les conclusions de les tres tècniques de processament, es va utilitzar un sistema HPLC Agilent de la sèrie 1260 que consta d'un desgasificador, una bomba quaternària, un mostreig automàtic, un forn de columna i un detector de matriu de díodes (Agilent Technologies, Santa Clara). , CA, EUA) es van utilitzar per a la determinació simultània d'echinacòsid i acteòsid en totes les mostres de tipus a, b i c. Es va seleccionar una columna Agilent Zorbax SB-C18 (250 mm × 4,6 mm, mida de partícula 5 μm, Agilent Technologies) protegida per la columna de protecció corresponent (10 mm × 4,6 mm, mida de partícula 5 μm) per dur a terme separacions cromatogràfiques. El protocol de preparació de la mostra, la fase mòbil i el programa d'elució van seguir les descripcions arxivades a la Farmacopea Xinesa (edició 2010)3 amb petites modificacions. En resum, es va realitzar una extracció assistida per ultrasons durant 30 min amb metanol aquós al 50 per cent; Es va adoptar metanol aquós al 30 per cent com a fase mòbil per a l'elució isocràtica a un cabal d'1,0 ml/min, i el forn de columna es va mantenir a

30 graus. La longitud d'ona de detecció es va establir a 330 nm i el volum d'injecció es va establir en 10 μL.

3. Resultats i discussió

3.1. Optimització d'extracció i paràmetres espectroscòpics

Per obtenir espectres de RMN 1H d'alta qualitat per a totes les mostres, es van optimitzar acuradament diversos paràmetres mitjançant una mostra representativa (CD1-GUI). En primer lloc, el dissolvent d'extracció es va seleccionar entre un 30 per cent de metanol aquós, un 50 per cent de metanol aquós i metanol. Els resultats van indicar que el metanol aquós al 50% va donar una resposta global més gran que els altres dos, d'acord amb el protocol d'extracció autenticat a la Farmacopea Xinesa (edició 2015)3. Es va triar l'extracció assistida per ultrasons a causa del seu funcionament convenient amb rendiments comparables als de l'extracció de reflux calent i l'extracció de Soxhlet (dades no mostrades). Després, es va comparar la durada assistida per ultrasons entre 40 i 60 min, i el bany d'aigua ultrasònic de 60 min no va mostrar una potència d'extracció superior a 40 min; per tant, es van establir 40 minuts per a l'aparell d'ultrasons per estalviar temps.

D'altra banda, es va comparar {{0}},5 mL de CD3OD-fosfat tampó en D2O (1:1, pH 7,4) amb 0,5 mL de CD3OD-D2O (1: 1), i els resultats van mostrar que la fortificació amb tampó fosfat podria evitar la variació i la migració del perfil espectral. Una alíquota de 2,0 ml de l'extracte es va concentrar successivament, es va reconstituir i es va sotmetre a una anàlisi de RMN per oferir una resposta adequada per a la majoria de senyals. A més, es va observar que el mètode humit era millor que un programa de presaturació per reduir la intensitat màxima de l'aigua residual (al voltant de δ 4, 8) a l'espectre. També vam trobar que l'increment del nombre d'escaneig va ser beneficiós per a la millora de la relació senyal-soroll (S/N), que va ser molt útil per a la detecció sensible (en particular per als components de traça). Tanmateix, com que aquest enfocament era perjudicial per a la mesura ràpida, finalment es van aplicar 256 exploracions per a cada assaig de RMN 1H per aconseguir una sensibilitat acceptable.

3.2. Assignació del senyal de l'espectre de RMN 1H

La identificació de components químics en CD es va aconseguir analitzant conjuntament els espectres de RMN 1H, RMN 13C i RMN 2D (Fig. 1 i informació suplementària Figs. S1-S10) i comparant-los amb mostres de compostos autèntics, així com fent referència a l'accessibilitat. bases de dades, com ara MMCD . Les assignacions plausibles dels senyals en 1H RMN es mostren a la figura 1. Els valors de canvi químic per a les identitats putatives es resumeixen a la taula S2 (informació suplementària).

Les característiques estructurals dels PhG del gènere Cistanche s'han descrit a la literatura1. A causa de la gran similitud estructural entre els PhG, per exemple, equinacòsid versus acteòside, els senyals de protons de les fraccions feniletanoides es superposen àmpliament en l'espectre de RMN 1H. Aquest solapament va plantejar un problema analític desafiant per discriminar de manera fiable entre aquests senyals. En l'estudi actual, els senyals pertanyents a l'echinacòsid i l'acteòsid, que són els ingredients primaris de la planta original, es van assignar sense ambigüitats amb l'ajuda de compostos de referència i diversos espectres de RMN (taula S2, figura 1 i figures S1-S6). El senyal de diagnòstic a δ 7,73 (d, J 16.0 Hz) va indicar la distribució de Castano-

costat B/D o altres PhG substituïts amb feruloil (taula S2 i fig. 1)22. A més, també es van observar PhG de tipus cis (PhG substituïts de cumaroil o cafeoil de tipus cis) a l'extracte basat en la presència de δ 6,95 (d, J 12.0 Hz) a l'espectre (Taula S2 i Fig. . 1).

Es van detectar diversos senyals evidents a la regió de δ 8.0–9,5. Els senyals a δ 9,15, 8,88 i 8,09 es van assignar provisionalment a la nicotinamida (taula S2 i figura 1), i 13C RMN així com 2D

Els espectres de RMN (Figs. S4-S6) també van donar suport a aquesta tasca. El senyal a δ 8,48 es va assignar de manera plausible a l'àcid fòrmic, mentre que els senyals a δ 8,13 i 8,11 es van generar a partir d'adenosina i adenina, respectivament (taula S2 i figura 1). Els senyals d'hidrats de carboni solen estar situats a la regió entre δ 3.00 i 5,50. Òbviament, la sacarosa era el disacàrid més abundant a la CD, mostrant ressonàncies significatives a δ 4.04, 4.18 i 5.41 (taula S2 i figures 1 i S7). Els senyals evidents pertanyents als protons anomèrics de -galactosa, -glucosa i -glucosa van ressonar a δ 5,24, 5,20 i 4,60, respectivament (taula S2, figures 1 i S8, S9). L'aparició de manitol es va revelar mitjançant l'observació del senyal a δ 4.00 així com mitjançant la comparació amb el compost de referència (taula S2, figures 1 i S10). El senyal de diagnòstic de 1-O-etil-glucòsid es va observar a 1,16 ppm fent referència a HMDB. Aminoàcids, incloent leucina (0,93 ppm), isoleucina/valina (0,98 ppm), treonina (1,27 ppm), alanina (1,49 ppm), lisina (1,71 ppm), glutamina (2,30 ppm), àcid asparagina (2,96 ppm), prolina (4,09 ppm), tirosina (7,12 ppm) i fenilalanina (7,33 ppm) es van assignar provisionalment mitjançant la comparació dels seus respectius comportaments espectroscòpics de diagnòstic amb els arxivats a HMDB (taula S2 i figura 1). Els iridoides i els lignans es van esmentar anteriorment com els homòlegs químics importants de la CD. A l'espectre representatiu de RMN 1H (Fig. 1), es van observar els senyals de siringaresinol (un derivat de lignan) i 8-àcid epilogànic (un derivat iridoide) a δ 7, 02 i 0, 98, respectivament. A més, els senyals multiplets oscil·laven entre δ 6,56-6,64 es podrien assignar provisionalment a cítrics A, alascaniòsid A o glucòsid d'alcohol dehideodiconiferyl (tots els derivats de lignan), mentre que els senyals entre δ 6,18-6,33 també podrien ser generats per iridoides (taula S2 i Fig. 1). A més, l'aparició d'alguns àcids carboxílics alifàtics a la CD, incloent l'àcid fumàric, l'àcid maleic, l'àcid màlic, l'àcid isocítric, l'àcid cítric, l'àcid cetoglutàric, l'àcid pirúvic, l'àcid succínic, l'àcid acètic i un altre àcid gras, es van caracteritzar provisionalment per la observació dels senyals de diagnòstic a δ 6,54, 6,02, 4,27, 3,04, 2,73, 2,52, 2,49, 2,42, 1,97 i 1,33, seqüencialment (taula S2 i fig. 1). A més, alguns senyals, com ara un senyal multiplet al voltant de 3,80 ppm i un singlet a 1,97 ppm22, es van considerar com les característiques dels grups metoxi i acetil (Taula S2 i Fig. 1), respectivament, que són els substituts comuns dels derivats del fenil. , especialment PhGs en aquest cas. Mentrestant, el senyal a 1,06 ppm es podria assignar provisionalment al residu de ramnosa. És ben sabut que l'espectroscòpia de RMN 1H pot proporcionar informació quantitativa directa perquè la intensitat del senyal de protons és proporcional a la concentració molar de l'analit19. Per tant, la comparació quantitativa preliminar es podria realitzar per als ingredients del CD. Òbviament, els hidrats de carboni, en particular la sacarosa, van donar les respostes més altes en l'espectre representatiu (Fig. 1). Com a planta holoparàsita que creix sota terra durant gairebé tot un cicle de vida, la fotosíntesi no és necessària i no està disponible per a la CD; per tant, no és d'estranyar que no s'hagi trobat cap metabòlit primari implicat en la fotosíntesi, com el participant del cicle Kelvin (també conegut com a cicle C3), a l'espectre23. Al contrari, es va detectar una gran quantitat de molècules que participen en el cicle de l'àcid tricarboxílic (cicle TCA, també conegut com a cicle de l'àcid cítric i cicle de Krebs), com l'àcid cítric, l'àcid cetoglutàric, l'àcid pirúvic i l'àcid succínic, indicant que el vigorós centre central. El metabolisme del carboni (CCM) es produeix a la planta original. D'altra banda, els PhG es van observar com la família química dominant entre diversos metabòlits secundaris, mentre que els lignans i els iridoides només van aportar contribucions menors a tot el perfil espectral.

3.3. Assaig de precisió d'espectroscòpia de RMN 1H

La precisió espectroscòpica juga un paper clau en la fiabilitat de la caracterització de la metabolòmica. En l'estudi actual, la precisió de tota la metodologia es va assajar preparant una mostra representativa (CD1-GUI) per quintuplicat i analitzant-la posteriorment en dos dies consecutius. Els espectres obtinguts mostraven una gran similitud general superposant tots els espectres, cosa que suggereix que el protocol de preparació de la mostra i la mesura de RMN 1H eren reproduïbles i que la mostra es podria mantenir estable en almenys dos dies.

3.4. Discriminació de la part superior i inferior de la planta

Fins ara, cap evidència ha demostrat que les parts superiors de la CD siguin equivalents a les parts inferiors pel que fa al perfil químic i a les propietats farmacològiques. Amb l'objectiu d'aclarir si l'acumulació de metabòlits primaris o secundaris es va produir en determinades parts de CD, es van tallar les tiges suculentes senceres a la part superior i inferior, ambdues posteriorment processades, extretes i mesurades mitjançant espectroscòpia 1H RMN. La figura 2 mostra els espectres representatius d'ambdues parts. En general, la majoria de senyals de les parts inferiors eren més altes que les de les parts superiors. En l'interval de δ 6.0–9,5, no es va poder trobar cap senyal únic a cap de les parts; tanmateix, la intensitat global d'aquests senyals a les parts inferiors era lleugerament superior a les de les parts superiors, cosa que suggereix que els derivats aromàtics es podrien enriquir en el domini proper al punt paràsit23. Les parts inferiors també eren riques en àcids grassos, certs aminoàcids i algunes altres substàncies d'emmagatzematge d'energia perquè la resposta global del senyal de la regió alifàtica (δ 0.5–3.{{10}). }) a les parts inferiors era superior a la de les parts superiors. A més, es podrien observar algunes diferències òbvies dins de la regió del sucre (δ 3.0–5.0), i la majoria dels senyals situats en el rang de δ 3.0–. 5.0 per a les parts superiors eren superiors a les de les parts inferiors, la qual cosa indica que els hidrats de carboni, oligosacàrids notables, es podien acumular a les parts superiors. Per tal de destacar les diferències entre les parts superiors i les inferiors i també identificar els principals contribuents encarregats de la seva discriminació, es va aplicar l'anàlisi de dades multivariant per processar el conjunt de dades espectroscòpics de les diferents parts. Inicialment es va aplicar un enfocament no supervisat anomenat PCA, que només utilitza la informació d'una matriu, per classificar totes les mostres segons els espectres característics d'1H RMN. Tanmateix, es va produir una superposició extensa per a aquestes dues parts diferents (dades no mostrades). Posteriorment, es va posar en marxa OPLS-DA, un enfocament supervisat, per afinar la separació entre diferents grups així com per entendre les variables que porten la informació de separació de classes. OPLS-DA va aconseguir una bona separació per a les diferents parts del CD. Les figures 3A i B mostren la trama de puntuació i la trama S d'OPLS-DA, respectivament. Tant la bondat general de l'ajust (R2Y¼{{30}},910) com el coeficient global de validació creuada (Q2Y¼0,981) eren propers a 1,0. Per tant, el model de separació original era estadísticament sòlid amb una alta predictibilitat. Òbviament, les parts superiors es podien distingir de les parts inferiors quan les mostres es van etiquetar amb dos grups, i la trama S va donar els senyals que potencialment van contribuir a la diferenciació. En general, es van distribuir més punts a la regió corresponent a les parts inferiors de la trama S, on es van distribuir continguts més alts d'àcids grassos (δ 1,32–1,35) i factors del cicle TCA (com l'àcid succínic a δ 2,42); tanmateix, la part superior (el grup dret a la figura 3A) era rica en alguns hidrats de carboni (principalment δ 3,70–4,10, figura 3B). Els biomarcadors potencials proporcionats per la trama S eren molt coherents amb la comparació dels espectres de les dues parts mitjançant l'observació directa i la superposició. Està ben definit que els metabòlits es sintetitzen de maneres específiques de teixits, òrgans i desenvolupament mitjançant enzims de biosíntesi específics i després s'emmagatzemen, de vegades en alts continguts en els dominis productors, corresponents a les seves diverses funcions per a tota la planta. Per exemple, tant els tipus com el contingut de ginsenòsids presenten variacions significatives entre els rizomes, arrels, fulles i seguidors de Panax notoginseng24. Pel que fa a la CD, des del punt de vista qualitatiu, els perfils de metabòlits secundaris van mostrar una gran similitud entre les parts superiors i les parts inferiors. Com que les parts inferiors de les plantes senceres actuen com a paper de transmissió de substàncies nutritives, la majoria de les quals són metabòlits primaris, per exemple, hidrats de carboni, des de l'hoste, Haloxylon ammodendron fins als punts de metabolisme vigorós, el que indica que els metabòlits primaris més abundants haurien de produir-se en el parts inferiors. A més, la hidròlisi extensiva de polisacàrids a oligosacàrids i, posteriorment, a monosacàrids, que finalment es podrien biotransferir en alguns àcids carboxílics alifàtics, hauria de produir-se àmpliament a les parts superiors. Com que en aquest estudi es va utilitzar un 50 per cent de metanol aquós per a l'extracció i va ser capaç d'extreure molècules baixes hidròfiles en lloc de macromolècules (per exemple, polisacàrids), no és d'estranyar observar que l'acumulació de factors del cicle de TCA i àcids grassos es va demostrar a la part inferior. parts. Tanmateix, es va trobar que alguns oligosacàrids, els productes hidrolítics dels polisacàrids, estaven enriquits a les parts superiors. D'altra banda, es van observar diferències menors per als PhG entre diferents parts des del punt de vista quantitatiu i, en general, es va observar una lleugera acumulació de PhG a les parts inferiors23,25. Es va informar que el floema haustorium és probablement l'òrgan sintètic secundari dels PhG en CD23; per tant, les parts inferiors, que estan a prop del punt paràsit, haurien de ser riques en PhG.

3.5. Proposta d'un nou mètode de tractament de CD

Òbviament, les rodanxes medicinals pertanyents a mostres de tipus c eren superiors pel que fa a bon aspecte, color blanquinós, lleugera i textura nítida. La figura 4 mostra els espectres de RMN 1H representatius d'aquests tres tipus de mostres. Després de mesures paral·leles, però, es van obtenir diferents perfils espectrals per a aquelles rodanxes medicinals processades. Mitjançant l'observació directa i la superposició, es van poder observar diferències evidents. En primer lloc, a la regió de δ 6.00–8.00, on es van incloure principalment els senyals pertanyents a PhGs i alguns altres derivats fenòlics, les respostes de les mostres de tipus c (Fig. 4C) van ser força superior als altres dos tipus. En segon lloc, les respostes de la majoria de hidrats de carboni i participants de TCA en mostres de tipus b (Fig. 4B) eren gairebé equivalents a les de les mostres de tipus c (Fig. 4C), però molt superiors a les de les mostres de tipus a (Fig. 4A). . En tercer lloc, els continguts de glucosa (δ 5,20 per a -glucosa i δ 4,60 per a -glucosa) a les mostres de tipus b (Fig. 4B) eren lleugerament superiors als de les mostres de tipus c (Fig. 4C). Finalment, es van detectar més àcids grassos en les mostres de tipus a i c que en mostres de tipus b (Fig. 4). Sobretot, els derivats del fenol més abundants, com aquest, que han estat àmpliament considerats com els ingredients efectius en CD, es van trobar en les mostres processades per un nou mètode (mostres tipus c), en comparació amb a-i b- mostres tipus. A més, també es van trobar abundants metabòlits primaris, com ara hidrats de carboni, participants TCA i àcids grassos en mostres de tipus c. Posteriorment, es van realitzar les comparacions de totes les mostres mitjançant anàlisi de dades multivariant amb l'objectiu de destacar les similituds i les diferències entre aquests tres tipus de rodanxes medicinals. Es va realitzar PCA amb escalat Par i OPLS-DA amb escala UV per processar el conjunt de dades espectroscòpics de RMN, successivament (dades no mostrades). No es va aconseguir una separació significativa mitjançant PCA; tanmateix, els diagrames de puntuació d'OPLS-DA per a aquests tres grups (punts verds, blaus i vermells a la figura 5A) van mostrar una classificació clara, cosa que indica que aquests tres grups de mostra eren significativament diferents pel que fa als seus perfils metabòlics. El

degradació dels PhG iniciada pels enzims de la planta original o per l'emmagatzematge a alta temperatura. Com a conseqüència, les rodanxes processades (mostres de tipus c) utilitzant el nou mètode van ser avantatjoses tant amb un aspecte agradable com amb un contingut més efectiu de compostos. Per validar els resultats esmentats anteriorment per a les tres tècniques de processament, es va utilitzar el mètode HPLC-UV que estava ben desenvolupat i autenticat a la Farmacopea Xinesa (edició 2015)3 per determinar simultàniament els continguts d'echinacòsid i acteòsid, que van tenir un paper important en distingir els tres tipus de productes elaborats anteriorment. El contingut mitjà d'echinacòsid en mostres de tipus a, b i c va ser de 8,33, 4,10 i 16,19 mg/g, respectivament, mentre que els continguts d'acteòsids eren d'1,57, 1,14 i 3,66 mg/g, respectivament. Òbviament, els continguts de PhG en els materials de tipus c eren de 2 a 4 vegades superiors als de les mostres de tipus a i b, coincidint bé amb els resultats de la metabolòmica basats en 1H RMN. Entre les tècniques analítiques disponibles que s'utilitzen generalment en estudis de metabolòmica, s'ha reconegut que els mètodes basats en RMN i MS són alternatives favorables. L'espectroscòpia RMN, en particular la RMN 1H, posseeix superioritats insuperables respecte a altres tècniques, com ara la no selectivitat, la preparació còmoda de la mostra i la facilitat de detecció simultània de diversos grups de metabòlits en un temps de mesura relativament curt. Fins ara, la metabolòmica basada en 1H RMN s'ha utilitzat per autenticar plantes17 per comparar herbes analògiques18, per diferenciar l'hàbitat26 i per caracteritzar la degradació de les herbes26. Aquí, es va aplicar 1H RMN per distingir les diferents parts de CD i també per proposar un nou flux de treball de procés, cosa que indica que l'espectroscòpia 1H RMN és una eina analítica flexible i robusta per oferir directrius significatives per a l'explotació de CD, així com d'altres. herbes medicinals proporcionant informació qualitativa i quantitativa completa de matrius d'extractes complicades.