Resum:La quercetina s'ha estudiat àmpliament pels seus efectes contra la malaltia d'Alzheimer (MA) i contra l'envelliment. Els nostres estudis anteriors han trobat que la quercetina i en la seva forma de glucòsid, la rutina, poden modular la funció del proteasoma a les cèl·lules del neuroblastoma. El nostre objectiu és explorar els efectes de la quercetina i la rutina sobre l'homeòstasi redox intracel·lular del cervell (glutatió reduït/glutatió oxidat, GSH/GSSG), la seva correlació amb l'activitat de l'enzim 1 (BACE1) que escindi l'APP al lloc i la proteïna precursora de l'amiloide (APP) expressió en ratolins transgènics TgAPP (que porten el transgen APP de mutació sueca humana, APPswe). Sobre la base que la proteïna BACE1 i el processament de l'APP estan regulats per la via ubiquitina-proteasoma i que la suplementació amb GSH protegeix les neurones de la inhibició del proteasoma, vam investigar si una dieta que conté quercetina o rutina (30 mg/kg/dia, 4 setmanes) disminueix diverses primers signes d'AD. Les anàlisis de genotipatge d'animals es van realitzar mitjançant PCR. Per determinar l'homeòstasi redox intracel·lular, es van adoptar mètodes espectrofluoromètrics per quantificar els nivells de GSH i GSSG mitjançant o-ftalaldehid i es va determinar la relació GSH/GSSG. Els nivells de TBARS es van determinar com a marcador de peroxidació lipídica. Les activitats enzimàtiques de SOD, CAT, GR i GPx es van determinar a l'escorça i l'hipocamp. L'activitat de BACE1 es va mesurar mitjançant un substrat específic de la secretasa conjugat a dues molècules informadores (EDANS i DABCYL). L'expressió gènica dels principals enzims antioxidants: APP, BACE1, una proteïna 10 que conté dominis de desintegrina i metaloproteinasa (ADAM10), caspasa-3, caspasa-6 i citocines inflamatòries es van determinar mitjançant RT-PCR. En primer lloc, la sobreexpressió d'APPswe en ratolins TgAPP va disminuir la relació GSH/GSSG, va augmentar els nivells de malonaldehid (MDA) i, en general, va disminuir les principals activitats enzimàtiques antioxidants en comparació amb els ratolins de tipus salvatge (WT). El tractament de ratolins TgAPP amb quercetina o rutina va augmentar GSH/GSSG, va disminuir els nivells de MDA i va afavorir la capacitat antioxidant de l'enzim, especialment amb la rutina. En segon lloc, tant l'expressió d'APP com l'activitat de BACE1 es van reduir amb quercetina o rutina en ratolins TgAPP. Pel que fa a ADAM10, va tendir a augmentar en ratolins TgAPP amb tractament amb rutina. Pel que fa a l'expressió de caspasa-3, la TgAPP va mostrar un augment que va ser el contrari amb la rutina. Finalment, l'augment de l'expressió dels marcadors inflamatoris IL-1 i IFN- en ratolins TgAPP es va reduir tant per la quercetina com per la rutina. Col·lectivament, aquestes troballes suggereixen que, dels dos flavonoides, la rutina es pot incloure en una dieta del dia a dia com a forma de teràpia adjuvant en la MA.

Feu clic a Antioxidant Cistanche Chemist Warehouse

【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】

Paraules clau:quercetina; rutina; glutatió; APPswe; BACE1; Malaltia d'Alzheimer

1. Introducció

La disminució de la funció cognitiva és un símptoma fonamental de neurodegeneració clínica estrictament relacionat amb l'edat [1]. L'impacte de la nutrició en el declivi cognitiu associat a l'edat és un tema cada cop més creixent, ja que és un factor vital que es pot modificar fàcilment. Els canvis patològics en el cervell observats durant el declivi cognitiu tenen lloc molt abans de qualsevol manifestació clínica, que es produeix principalment en la vellesa. Això proporciona un període més llarg per establir estratègies de prevenció sobre el declivi cognitiu relacionat amb l'edat i la demència, que és un problema de salut pública important [2]. Durant molts anys, s'ha dut a terme una investigació intensiva sobre compostos d'origen natural, que es troben en les dietes del dia a dia, en teràpia de millora cognitiva [3].

Una de les malalties neurodegeneratives relacionades amb l'edat més freqüents és la malaltia d'Alzheimer (MA), que es caracteritza per dos signes neuropatològics: plaques amiloides (A) i embolics neurofibril·lars. Pel que fa a la investigació en animals, els models animals poden simular la fase asimptomàtica de la MA modificant la proteïna precursora A (APP), per exemple [4,5].

Notablement, s'han examinat diversos fitoquímics bioactius derivats de plantes associats amb diversos beneficis per a la salut i un risc reduït de moltes malalties per formar complexos no covalents amb el pèptid amiloide (A) [3].

Tot i que nombroses medicines tradicionals i productes dietètics naturals han mostrat un gran progrés cap a la mitigació de la patologia de la MA, som plenament conscients de les limitacions dels models animals de la MA, ja que els efectes prometedors d'aquestes substàncies no sempre són replicables en estudis humans [6]. Tanmateix, a causa de la dificultat d'analitzar el teixit cerebral en humans, especialment en etapes molt primerenques de progressió, són necessaris estudis en models de rosegadors. Com a resultat, aquests models experimentals poden donar suport al desenvolupament d'agents d'usuari a partir de medicines tradicionals i compostos naturals segurs per retardar la progressió de les malalties neurodegeneratives. Per tant, la prova de compostos naturals, que es troben en les dietes diàries, per a la prevenció de malalties i la protecció contra el risc de la MA, hauria de ser una prioritat.

Entre aquests importants agents naturals dietètics hi ha la quercetina, que és el principal flavonoide polifenòlic en diverses fruites i verdures [7]. La quercetina està present principalment en la seva forma de glucòsid, és a dir, la rutina. Per la seva banda, la rutina (quercetina-3-O-rutinósida) ha mostrat efectes profunds sobre les diferents funcions cel·lulars que sustenten diverses condicions patològiques, a saber, antimicrobianes, anticancerígenes, antitrombòtiques, cardioprotectores i neuroprotectores. Aquests efectes farmacològics s'associen principalment amb les activitats antiinflamatòries i antioxidants de la rutina. A causa de la seva capacitat per creuar la barrera hematoencefàlica i/o els seus metabòlits, s'ha demostrat que la rutina pot alterar els símptomes tant cognitius com de comportament de les malalties neurodegeneratives [8].

Els nostres estudis anteriors han trobat que tant els flavonoides, la quercetina com la rutina, afecten diverses vies de senyalització i xarxes moleculars associades a la modulació de les funcions del proteasoma a les cèl·lules del neuroblastoma [9]. A més, s'ha demostrat que l'expressió BACE1 i el processament d'APP estan regulats per la via ubiquitina-proteasoma [10] i que la suplementació amb glutatió reduït (GSH) protegia les neurones de la inhibició del proteasoma [11]. L'esgotament de GSH al cervell és una troballa freqüent en pacients amb malalties neurodegeneratives, com la MA, i pot causar neurodegeneració abans de l'aparició de la malaltia [12]. La ubiquitinació de BACE1 i el bloqueig de la via ubiquitina-proteasoma inhibeix la degradació de BACE1 i, en conseqüència, condueix a una major producció de l'activitat enzimàtica de BACE1 [10].

A partir d'aquestes troballes, i que els hàbits dietètics i la suplementació poden afectar l'estat redox cel·lular, vam voler explorar els efectes d'una dieta que conté quercetina o rutina sobre l'homeòstasi redox intracel·lular del cervell (GSH/GSSG), la seva correlació amb l'activitat BACE1, i expressió d'APP en models de ratolins d'AD (que porten mutació humana sueca Amyloid Precursor Protein APP transgene, APPswe).

Finalment, com que hi ha proves convincents de l'efecte dels suplements de flavonoides en la millora de dominis cognitius específics i/o de les troballes de la ressonància magnètica [13], vam intentar imitar, en animals, una intervenció proporcionant una dieta saludable que contingui quantitats moderades d'un potencial actiu particular. ingredient (quercetina o rutina) com a estratègia eficaç per prevenir l'expressió de marcadors d'AD.

2. Resultats

2.1. Genotipat de ratolins

La colònia de ratolins TgAPP es va desenvolupar al nostre laboratori a partir de mascles heterozigots Tg2576 i femelles de tipus salvatge. Es va realitzar el genotipat de ratolins per detectar individus transgènics. De tots els ratolins provats, aproximadament el 40 per cent es va trobar que eren transgènics (TgAPP).

Els productes de PCR obtinguts es van separar mitjançant electroforesi en gels d'agarosa a l'1,5 per cent en tampó 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA) a 70 V (tensió constant) i després es van fer imatges tenint-los amb GelRed (Millipore). El perfil d'amplificació dels ratolins transgènics i WT es mostra a la figura 1.

2.2. Glutatió

Per avaluar l'homeòstasi redox intracel·lular a les neurones en ratolins TgAPP, es van quantificar els nivells de GSH i GSSG i es va determinar la relació GSH/GSSG com a marcador del poder reductor cel·lular tant en mascles com en femelles (figura 2).

En l'avaluació de l'efecte del transgène sobre el sistema de glutatió, es va observar una disminució del poder reductor cel·lular (GSH/GSSG) en els ratolins TgAPP respecte als animals WT, tant en mascles com en femelles i ambdues àrees del cervell (figura 2C3, H3), especialment a l'hipocamp. Tant en els ratolins WT com en els TgAPP, la relació GSH/GSSG va ser significativament més baixa en els mascles que en les femelles (figura 2C3, H3; p <0.05). Mentre que a les dones TgAPP aquesta disminució és el resultat de nivells més baixos de GSH (figura 2C1, H1), en els homes de TgAPP s'atribueix principalment a un augment dels nivells de GSSG (figura 2C2, H2).

Els canvis en els nivells de GSH i GSSG dels ratolins TgAPP, respectivament, després del tractament amb quercetina o rutina, són més destacats en els mascles que en les femelles. Sembla que la quercetina tendeix a augmentar els nivells de GSH (figura 2C1, H1; p <{3}}.05) i la rutina per reduir els nivells de GSSG (figura 2C2, H2; p <0, 05).

Els tractaments amb quercetina i rutina, tant en mascles com en femelles, van poder revertir la caiguda de la proporció GSH/GSSG a l'hipocamp (figura 2H3) on la recuperació del poder redox va ser significativa enfront dels ratolins TgAPP no tractats. En els mascles, aquest índex va aconseguir valors similars als dels ratolins WT a l'hipocamp (H3). A les femelles, encara que aquesta proporció no s'eleva a la dels ratolins WT, el tractament amb quercetina i rutina la va millorar significativament en comparació amb la dels ratolins TgAPP en els seus hipocamps (H3: quercetina, p <0.{{). 6}}01; rutina, p < 0,05).

2.3. Substàncies reactives a l'àcid tiobarbitúric (TBAR)

Els nivells de TBAR es van determinar com a marcador de peroxidació lipídica. Utilitzant corbes de calibratge, els resultats es van expressar com a concentració de malondialdehid (MDA) (figura 3).

Després de la sobreexpressió d'APP, es va observar un augment significatiu dels nivells de MDA en comparació amb els ratolins WT tant a l'escorça (figura 3C) com a l'hipocamp (figura 3H) i tant en mascles com en femelles (p <{2}}.001) .

A les femelles TgAPP, tant els tractaments amb quercetina com amb rutina gairebé van restaurar els nivells de MDA als mateixos que els dels ratolins WT (figura 3C, H). En els mascles TgAPP, de la mateixa manera, tant els tractaments amb quercetina com amb rutina restableixen els nivells de MDA als mateixos que els dels ratolins WT a l'escorça (figura 3C) i es redueixen encara més a l'hipocamp (figura 3H). Tant en ratolins WT com en TgAPP, no tractats i tractats amb dieta amb flavonoides, els nivells de MDA depenien del sexe (figura 3C, H; p <0.05), excepte els ratolins TgAPP tractats amb quercetina a l'hipocamp.

2.4. Activitat enzimàtica i expressió d'enzims antioxidants

Per abordar si la regulació de l'activitat enzimàtica o l'expressió gènica dels principals enzims antioxidants, o ambdues, es produeix amb una dieta de quercetina o rutina, es va realitzar la determinació de l'activitat enzimàtica i els nivells d'ARNm.

La figura 4 mostra les activitats enzimàtiques de SOD, CAT, GR i GPx, determinades en ratolins femelles i mascles, a l'escorça cerebral (figura 4a) i a l'hipocamp (figura 4b).

Com a conseqüència de la sobreexpressió d'APP, només es va observar una disminució significativa de l'activitat CAT en els ratolins TgAPP en comparació amb els ratolins WT tant a l'escorça (Figura 4a (C2); p <0.05) com a conseqüència de la sobreexpressió d'APP. l'hipocamp (Figura 4b(H2); p <0,05).

El tractament amb quercetina no va produir cap variació significativa en les activitats enzimàtiques en comparació amb els ratolins TgAPP, en mascles o femelles, a les àrees cerebrals estudiades. En canvi, els animals tractats amb rutina van experimentar un augment de l'activitat CAT a l'escorça (Figura 4a (C2)) i de l'activitat GR a l'hipocamp (Figura 4b (H3)) tant en mascles com en femelles (p < 0 .05). A més, la rutina va augmentar l'activitat CAT de l'hipocamp en els mascles TgAPP (figura 4b (H2)) i l'activitat GPx a les dones (figura 4b (H4)).

La figura 5 mostra l'expressió gènica dels principals enzims antioxidants, SOD, CAT, GR i GPx, determinada en ratolins femelles i mascles, a l'escorça cerebral (figura 5a) i a l'hipocamp (figura 5b).

No s'observen diferències en l'expressió gènica entre els ratolins TgAPP i WT per als principals enzims antioxidants (figura 5a, b). Els mascles TgAPP tractats amb rutina van mostrar un augment significatiu de l'expressió de CAT a l'hipocamp (Figura 5b (H2)). Pel que fa al GPx de l'hipocamp, es va observar un patró similar al CAT, tot i que l'augment no va ser significatiu (Figura 5b (H4)).

2.5. Processament APP: BACE1 i ADAM10

Els resultats de l'activitat de l'enzim BACE1 tant a l'escorça cerebral com a l'hipocamp en mascles i femelles es mostren a la figura 6, expressats com a percentatges d'activitat dels ratolins TgAPP no tractats.

A la figura 6, es va trobar que l'activitat de l'enzim BACE1 en ratolins TgAPP augmentava al voltant d'un 10 per cent en comparació amb els ratolins WT, tant a les àrees cerebrals investigades com en ambdós sexes, i es va trobar que era estadísticament significativa (p <0,05).

L'augment de l'activitat observat en els ratolins transgènics es va reduir tant amb tractaments amb quercetina com amb rutina, tant a l'escorça com a l'hipocamp. No obstant això, encara es pot observar que l'efecte rutinari va ser lleugerament superior al de la quercetina en els homes.

Un cop coneguda l'activitat de BACE1, vam decidir dur a terme l'estudi de l'expressió gènica de l'APP, principal característica del model animal transgènic, i dels seus principals enzims de processament: BACE1 i ADAM10. La figura 7 mostra els resultats obtinguts en ratolins femelles i mascles, tant a l'escorça com a l'hipocamp.

En ambdós sexes, es va observar un augment significatiu de l'expressió d'APP superior al 85 per cent en els ratolins WT, demostrant la sobreexpressió del gen tant a l'escorça cerebral (figura 7C1; p <0.05) i a l'hipocamp (figura 7H1; p <0.05). Els tractaments amb quercetina i rutina van poder reduir aquesta expressió en més d'un 45 per cent (p <0, 05) tant per a ratolins masculins com femenins a les dues àrees cerebrals investigades (figura 7C1, H1), amb els efectes més destacats a l'hipocamp ( Figura 7H1).

Pel que fa a l'expressió de la proteïna BACE1, tot i que l'activitat de BACE1 es va alterar, no hi va haver diferències significatives entre ratolins transgènics i no transgènics, independentment del sexe i del tractament amb flavonoides examinats.

Així, vam avaluar l'expressió ADAM10 implicada en el processament no amiloidogènic de l'APP. Tot i que els canvis en l'expressió d'ADAM10 en ratolins TgAPP en comparació amb els ratolins WT no van ser estadísticament significatius, es va observar una lleugera disminució. Pel que fa als tractaments amb flavonoides, la rutina va mostrar una tendència creixent en l'expressió d'ADAM10, tant en homes com en dones i en ambdues zones del cervell (Figura 7C3, H3).

【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】