2.6. Expressió de caspasa-3 i caspasa-6

El glicòsid de cistanche també pot augmentar l'activitat de la SOD en els teixits del cor i del fetge, i reduir significativament el contingut de lipofuscina i MDA a cada teixit, eliminant eficaçment diversos radicals reactius d'oxigen (OH-, H₂O₂, etc.) i protegint contra els danys de l'ADN causats. per radicals OH. Els glucòsids feniletanoides de Cistanche tenen una forta capacitat d'eliminació dels radicals lliures, una capacitat reductora superior a la de la vitamina C, milloren l'activitat de SOD en la suspensió d'esperma, redueixen el contingut de MDA i tenen un cert efecte protector sobre la funció de la membrana espermàtica. Els polisacàrids de Cistanche poden millorar l'activitat de SOD i GSH-Px en eritròcits i teixits pulmonars de ratolins senescents experimentalment causats per D-galactosa, així com reduir el contingut de MDA i col·lagen al pulmó i el plasma, i augmentar el contingut d'elastina. un bon efecte d'eliminació de DPPH, allarga el temps d'hipòxia en ratolins senescents, millora l'activitat de SOD al sèrum i retarda la degeneració fisiològica del pulmó en ratolins senescents experimentalment Amb la degeneració morfològica cel·lular, els experiments han demostrat que Cistanche té la bona capacitat antioxidant. i té el potencial de ser un fàrmac per prevenir i tractar malalties de l'envelliment de la pell. Al mateix temps, l'echinacòsid a Cistanche té una capacitat significativa per eliminar els radicals lliures de DPPH i té la capacitat d'eliminar espècies reactives d'oxigen i prevenir la degradació del col·lagen induïda pels radicals lliures, i també té un bon efecte reparador sobre el dany anònic dels radicals lliures de timina.

Feu clic aquí per conèixer Cistanche Tubulosa per a l'antioxidant

【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】

Els ratolins TgAPP van mostrar un augment de l'expressió gènica de la caspasa {{0}} (figura 8C1, H1), que va ser significativa i superior al 30 per cent en comparació amb l'hipocamp dels ratolins WT (figura 8H1; p <0, 05). Pel que fa a l'expressió de caspasa-6, no es van observar diferències entre ratolins transgènics i no transgènics (figura 8C2, H2).

Els tractaments amb quercetina i rutina van ser capaços de reduir els nivells d'ARNm de caspasa{{{0}} a l'hipocamp d'una manera estadísticament significativa (figura 8H1; p < 0.05), amb percentatges d'inhibició al voltant del 17 per cent. i 27 per cent per a ratolins femelles i mascles, respectivament. A l'escorça cerebral, només es van observar diferències significatives en el tractament amb rutina en homes (figura 8C1; p <0, 05).

Pel que fa als tractaments amb caspasa-6, quercetina i rutina no van exercir cap efecte estadísticament significatiu a l'escorça o a l'hipocamp (figura 8C2, H2), tot i que en aquest últim la caspasa-6 dels mascles TgAPP va mostrar una tendència a disminució (figura 8H2).

2.7. Marcadors d'inflamació

Els resultats obtinguts per a l'expressió gènica dels mediadors inflamatoris IL-1, TNF- i IFN- es mostren a la figura 9.

A la TgAPP, hi va haver un augment significatiu de l'expressió gènica IL{{0}} d'un 20 per cent a l'escorça i l'hipocamp en ambdós sexes en comparació amb els ratolins WT (Figura 9C1, H1; p <0,05). Pel que fa al TNF-, encara que es mostren nivells més alts d'ARNm a TgAPP, no són estadísticament significatius en els ratolins WT (figura 9C2, H2). Pel que fa a l'IFN-, hi va haver un augment d'un 30 per cent en la seva expressió en els homes, que només va ser estadísticament significatiu a l'escorça (figura 9C3; p <0, 05).

Els tractaments amb quercetina i rutina, tant en femelles com en homes, van poder disminuir l'expressió IL{{{0}} a l'escorça cerebral i a l'hipocamp en comparació amb els ratolins TgAPP de control (Figura 9C1, H1; p <{{8} }}.05), obtenint valors similars als dels ratolins WT, i especialment inferiors a l'hipocamp dels ratolins mascles (figura 9H1; p <0,05).

L'efecte global dels dos tractaments amb flavonoides sobre l'expressió IL{{0}} no es va observar amb TNF- ni amb INF-. Així, els mascles TgAPP, després del tractament amb quercetina, van experimentar una disminució significativa del TNF- hipocampal (figura 9H2; p <0.05) i de l'expressió cortical d'IFN- (figura 9C3; p <0.05).

2.8. Avaluació de les neurones en degeneració i les seves projeccions

No es van observar signes característics de neurodegeneració a l'edat en què es van provar els ratolins transgènics TgAPP, en comparació amb els ratolins WT, ni els tractaments amb quercetina i rutina van mostrar cap canvi durant 4 setmanes en comparació amb TgAPP (Figura S1, dades suplementàries).

2.9. Expressió dels receptors de glutamat ionotròpics

No es van trobar diferències significatives en l'expressió del receptor, comparant els valors obtinguts per als ratolins control TgAPP amb els obtinguts per als ratolins WT. Tampoc hi va haver efectes notables sobre l'expressió d'aquests receptors ionotròpics en presència de tractament amb quercetina o rutina (taula S5, dades suplementàries).

3. Discussió

L'objectiu del nostre estudi era avaluar l'impacte de dos flavonoides, la quercetina i la rutina, en les primeres etapes de la patogènesi de l'AD, independentment del seu efecte sobre la neurodegeneració i/o la funció cognitiva. L'escorça i l'hipocamp van ser les zones del cervell que s'analitzaven, ja que són les estructures cerebrals més afectades a l'AD. Cal tenir en compte que la quercetina i la rutina es van administrar mitjançant una dieta formulada que contenia qualsevol dels dos flavonoides, per imitar, en un model animal AD, la ingesta d'una dieta humana saludable, que contenia un ingredient actiu.

En particular, el transgène APPswe al ratolí C57B6 va exercir un impacte significatiu en la relació GSH/GSSG, els nivells de MDA, la capacitat d'enzims antioxidants, l'expressió APP, l'activitat BACE1 i l'expressió de caspasa -3 i IL-1. Tot i que les mutacions de l'APP en humans generalment donen lloc a l'AD típica, estan predominantment vinculades a la patologia amiloide exclusiva dels ratolins transgènics d'APP i no hi ha cap neurodegeneració notable [14, 15], ja que no es van observar signes característics en els nostres ratolins transgènics TgAPP, contràriament a els ratolins WT (dades complementàries, figura S1). La contratinció amb 40 -6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de les neurones de l'hipocamp ens va permetre observar la morfologia nuclear, ja que aquest compost és un colorant fluorescent per als àcids nucleics. No vam observar nuclis fragmentats o lobulars, típicament apoptòtics; ni vam observar cap diferència notable comparant les seccions histològiques de l'hipocamp de la línia transgènica de control TgAPP respecte a les seccions WT; ni vam observar cap diferència entre els tractaments amb quercetina i rutina respecte als ratolins control TgAPP.

Al panell de característiques bioquímiques de l'AD a analitzar, ens vam centrar principalment a determinar la relació GSH/GSSG en qualsevol de les dues dietes de flavonoides, ja que l'esgotament dels nivells de GSH representa un dels marcadors bioquímics primerencs més importants de l'AD [16,17] ] i s'ha observat durant la seva patogènesi i progressió de la malaltia. La mesura dels nivells de GSH cerebral [18] i, més recentment, els nivells de GSH en sang [19] han estat prometedors com a marcadors diagnòstics per a les primeres etapes de l'AD. A més, també s'han fet esforços per complementar les botigues endògenes de GSH per si mateixes o els seus precursors [20–22]. En el nostre estudi, es va observar una disminució del poder reductor cel·lular (GSH/GSSG) en els ratolins TgAPP respecte als animals WT, tant en mascles com en femelles, i en ambdues àrees del cervell. A l'escorça i l'hipocamp dels ratolins WT i TgAPP, la proporció GSH/GSSG era menor en els mascles que en les femelles. Les dietes de quercetina i rutina van augmentar significativament la relació GSH/GSSG en comparació amb els ratolins TgAPP no tractats, i aquest augment va ser més pronunciat a l'hipocamp. Els canvis en els nivells de GSH i GSSG i la relació GSH/GSSG després del tractament amb quercetina o rutina dels homes, pel que fa a l'augment del poder redox, van ser més destacats que en les dones. Els resultats de les nostres determinacions poden revelar una base important subjacent a les diferències associades al sexe en els ratolins Tg2576 en la susceptibilitat al dany oxidatiu de les macromolècules, d'una banda, ja que el sistema de glutatió és un reductor versàtil en múltiples funcions biològiques i en l'impacte de la prevenció. D'altra banda, les dietes de flavonoides en la restauració del seu estat fisiològic. Com veurem al llarg d'aquesta discussió, hem establert l'augment de la relació GSH/GSSG com l'eix principal que podria explicar el conjunt d'efectes observats en els ratolins TgAPP.

Recentment s'ha proposat que la relació GSH/GSSG, en lloc de funcionar simplement com a tampó redox, funcionaria com un mecanisme regulador principal, permetent que les proteïnes assoleixin la seva conformació i funcionalitat natives controlant estretament l'equilibri tiol-disulfur de la cèl·lula. proteoma. En resum, el sistema de glutatió sorgeix com a essencial per preservar un proteoma sa, demostrant que la interrupció de l'homeòstasi redox del glutatió (és a dir, genèticament o farmacològicament) augmenta l'agregació de proteïnes a causa de les alteracions en l'eficàcia de l'autofàgia [23]. Per tant, les estratègies destinades a mantenir l'homeòstasi redox del glutatió poden tenir potencial terapèutic en malalties associades a l'agregació de proteïnes, com la MA. Estretament relacionada amb la preservació del proteoma hi ha la maquinària de degradació ubiquitina-proteasoma, que està implicada en la patogènesi de l'AD. El proteasoma degrada selectivament múltiples substrats que són crucials per mantenir l'homeòstasi neuronal, inclòs el catabolisme de proteïnes oxidades i agregades. BACE1 pateix ubiqüitinació i s'ha demostrat que bloquejar la via ubiquitina-proteasoma inhibirà la degradació de BACE1 i, en conseqüència, augmentarà la producció de l'activitat enzimàtica de BACE1, el producte C99 de més divisió i augmentarà tant en A 1-40 com en A { {8}} en cèl·lules neuronals i no neuronals [10]. Els nostres estudis anteriors han trobat que tant els flavonoides, la quercetina com la rutina, afecten diverses vies de senyalització i xarxes moleculars associades a la modulació de la funció del proteasoma a les cèl·lules del neuroblastoma [9]. A més, s'ha demostrat que les neurones complementades amb glutatió reduït (GSH) van recuperar l'activitat del proteasoma i van reduir la formació d'agregats [11] ja que la funció del proteasoma està regulada per l'estat redox [24]. Per tant, l'augment de la relació GSH/GSSG experimentat pels animals en tenir una dieta de quercetina o rutina és coherent amb la modulació del proteasoma per la quercetina i la rutina, demostrada anteriorment ex vivo.

Com s'ha esmentat anteriorment, el desequilibri redox condueix a proteïnes molt modificades oxidativament que tendeixen a acumular-se i crear agregats que donen lloc a un deteriorament del proteasoma [25]. Així, donat el paper crucial de l'estrès oxidatiu en la patogènesi de l'AD, es van avaluar biomarcadors d'estrès oxidatiu, inclosa la peroxidació lipídica (nivells de MDA) i els enzims antioxidants, a l'escorça i l'hipocamp dels ratolins TgAPP i WT. SOD, CAT, GR i GPx són els enzims antioxidants més importants que actuen contra els radicals lliures d'oxigen i regulen el metabolisme dels radicals lliures al cos i juguen un paper en el sistema d'eliminació de radicals lliures, protegint les cèl·lules del cos de la peroxidació lipídica. . En el nostre estudi, com a conseqüència de la sobreexpressió d'APP, es va observar una disminució generalitzada de les activitats enzimàtiques antioxidants en els ratolins TgAPP en comparació amb els ratolins WT, sent estadísticament significativa per a CAT. D'acord amb la reducció dels nivells de GSH, la peroxidació lipídica es va incrementar significativament en els ratolins TgAPP. Tot i que la font de l'estrès oxidatiu en l'AD humana és molt complexa i multifactorial, la patologia amiloide desenvolupada en ratolins sembla ser suficient per iniciar el procés patològic que condueix a un augment de l'estrès oxidatiu al cervell [26]. Els animals tractats amb rutina van experimentar un augment de l'activitat CAT a l'escorça i l'activitat GR a l'hipocamp, tant en mascles com en femelles. Només els animals tractats amb rutina van experimentar canvis en l'expressió gènica de CAT i GR a l'escorça i l'hipocamp tant en mascles com en femelles i GPx a l'hipocamp de ratolins femelles. En aquest context, s'ha demostrat que diversos compostos naturals afecten la diafonia entre el proteasoma i la regulació redox. Més precisament, la quercetina és un activador Nrf2 conegut [27] que presenta propietats antioxidants mitjançant l'estimulació de la funció del proteasoma, promovent una major resistència a l'estrès oxidatiu i confereix una major longevitat cel·lular [28].

L'expressió específica del teixit de BACE1 és fonamental per al processament normal d'APP i la seva expressió de desregulació pot tenir un paper en la patogènesi de l'AD. BACE1 s'expressa predominantment a les neurones de l'hipocamp, l'escorça i la capa granular cerebel·losa [10]. Cal assenyalar que estudis anteriors han demostrat que els ratolins transgènics APP mutants suecs havien augmentat significativament els nivells cerebrals d'A en estat estacionari [29], cosa que suggereix que BACE1 té un paper essencial en la via amiloidogènica en la patogènesi de la MA i és un bon objectiu terapèutic. per al tractament de la MA. En el nostre estudi, vam observar una reducció significativa de l'activitat de BACE1 amb tractaments amb quercetina i rutina, que podria contribuir a la disminució de la deposició d'A en ratolins. Argumentem que, més que només funcionar com a inhibidors de BACE1 de l'enzim, la quercetina i la rutina, podria exercir una reducció de l'activitat de BACE1 relacionada amb un augment de la relació GSH/GSSG, basant-se en la hipòtesi de millorar la recuperació de l'activitat del proteasoma. En aquest sentit, se sap que l'orientació dels inhibidors de BACE1 al lloc de clivage d'APPswe (mutació sueca) es produeix abans que arribi a la membrana plasmàtica, mentre que APPwt (tipus salvatge) es processa en un endosoma precoç que s'origina a la superfície cel·lular. Per tant, BACE1 que escinda APPwt de vegades s'uneix a l'inhibidor BACE1 a la superfície cel·lular abans del processament de l'APP, però, l'enzim que processa APPswe no és [30]. És per aquest motiu que la localització aberrant del processament d'APPswe podria reduir significativament la potència de la quercetina i la rutina com a inhibidors de BACE1. Per tant, estem més inclinats a donar suport que la disminució de l'activitat de BACE en aquest model in vivo no es deu tant a la inhibició de l'enzim sinó a l'augment de la relació GSH/GSSG. En qualsevol cas, la reducció de l'activitat de BACE1 es podria interpretar com un intent putatiu de reduir la producció d'amiloide en els ratolins TgAPP. Pel que fa a l'efecte més notable de la quercetina i la rutina a l'hipocamp sobre l'atenuació de l'activitat BACE1, val la pena assenyalar que l'escorça té una densitat de neurones significativament més alta que l'hipocamp [31], i el deteriorament selectiu del proteasoma en el fenotip patològic de la MA fa que el còrtex més vulnerable i afectat que l'hipocamp [32].

Després de determinar l'efecte dels tractaments sobre l'activitat de l'enzim BACE1, ens va interessar avaluar la seva expressió. Curiosament, no es van trobar diferències significatives en l'expressió de BACE1 entre els ratolins TgAPP en comparació amb els ratolins WT, i no es van observar canvis notables amb el tractament amb quercetina o rutina. Per tant, sembla que l'augment de l'activitat de l'enzim BACE1 no està associat a un augment de l'expressió. En aquest context, és destacable que Apelt et al. [14] va trobar un augment de l'activitat cortical de BACE1 en ratolins Tg2576 entre els 9 i els 13 mesos, mentre que el nivell d'expressió de la proteïna BACE1 i l'ARNm no va canviar amb l'edat. A més, s'han trobat proves que recolzen que l'amiloide fibril·lar A 1-42., en lloc de l'amiloide soluble A 1-42, pot regular a l'alça l'expressió de la proteïna BACE1 i, per tant, petites modificacions en la proporció d'isoformes amiloides poden modular les conformacions de l'agregat amiloide i el dany cel·lular. 33]. Així, l'absència de canvi en l'expressió de BACE1 després d'un augment de la seva activitat que hem trobat pot explicar la prevalença de l'amiloide soluble A 1-42 sobre l'isoforma de l'amiloide fibril·lar A 1-42 al nostre model de ratolí TgAPP.

Després de la determinació de l'expressió gènica dels enzims implicats en el processament de l'APP, es va avaluar l'efecte de la quercetina i la rutina sobre l'enzim -secretasa implicat en el processament no amiloidogènic de l'APP. Ens vam centrar en ADAM10 perquè és la isoforma constitutiva més important fisiològicament de -secretasa. ADAM10 contraresta la generació de plaques A oligomèriques neurotòxiques mitjançant l'escissió d'APP dins del domini A per produir sAPP i fragments C-terminals (-CTF) [34,35]. Tot i que els canvis en l'expressió ADAM10 trobats al nostre estudi no van ser estadísticament significatius, es va observar una lleugera disminució de l'expressió ADAM10 en els ratolins TgAPP en relació amb els ratolins WT. Predominantment, el tractament amb rutina va mostrar una tendència a augmentar l'expressió del gen ADAM10 a les dues àrees cerebrals objecte d'estudi. Postina et al. [36] va demostrar que la regulació de l'ADAM10 de tipus salvatge a l'hipocamp d'un model de ratolí AD va mediar la secreció de sAPP, donant lloc a la inhibició de la generació de plaques A. L'efecte de la quercetina s'ha estudiat en un model de rata AD induïda per clorur d'alumini que mostra una millora significativa de la -secretasa (ADAM10 i ADAM17) a l'hipocamp en comparació amb els no tractats. Això indica que la quercetina té el potencial d'augmentar la via no amiloidogènica mitjançant l'activació dels gens -secretasa [37]. Les dades preclíniques reforcen la hipòtesi que augmentar els nivells de sAPP cerebrals és una estratègia potencial per millorar els símptomes relacionats amb l'AD i atenuar els dèficits sinàptics. ADAM10 i BACE1 competeixen per l'escissió de l'APP, per tant, potenciar l'activitat d'ADAM10 podria inhibir la generació d'amiloide neurotòxic. A més, sAPP pot prevenir l'activació de la via de senyalització de l'estrès JNK, donant lloc a l'activació de l'activitat de fosforilació induïda per NF-κB, que condueix a la degradació del proteasoma [38]. Per tant, la formació i l'acumulació d'agregats proteics relacionats amb la malaltia es redueixen significativament i es millora l'activitat del proteasoma cel·lular, proporcionant així evidència d'una funció de sAPP en la regulació de la proteòstasi [39]. A més, s'ha demostrat que sAPP regula específicament la síntesi del receptor AMPA de glutamat i el seu tràfic [40]. En el nostre estudi, vam explorar si el lleuger augment de l'expressió ADAM10 després del tractament amb rutina exerceix alguna influència en la transmissió sinàptica glutamatèrgica. Com es mostra a la secció de dades complementàries, no es van observar efectes significatius sobre l'expressió d'aquest receptor ionotròpic a les dietes de quercetina i rutina, potser a causa d'un feble augment de l'expressió ADAM10, que no és suficient per a la regulació del receptor AMPA (dades suplementàries). , Figura S2 i Taula S5).

Cal tenir en compte que els estudis in vitro han demostrat una gran varietat de substrats d'ADAM10 [41] i, per tant, es poden trobar efectes indesitjables obtinguts per l'orientació inespecífica d'ADAM10-en la proliferació del càncer, l'adhesió cel·lular, la promoció. de precursor i inflamació de cèl·lules T/NK, etc. [42]. Per evitar aquesta limitació, el nostre estudi suggereix una estratègia destinada a promoure l'alliberament de sAPP de manera més fisiològica. Aquest enfocament es pot basar en una ingesta a llarg termini d'un ingredient actiu (quercetina o rutina), que es consumeix mitjançant una dieta humana saludable. Tanmateix, calen estudis addicionals per esbrinar si l'augment d'ADAM10 depèn de la dosi dels flavonoides i si els possibles efectes beneficiosos superen els efectes secundaris putatius.

Pel que fa a l'expressió d'APPswe, tot i que la inserció del transgène APP humà al genoma del ratolí garanteix que APPswe estigui sobreexpressat des del naixement, s'ha informat que els nivells d'ARNm d'APP i de proteïnes de l'hipocamp presenten fluctuacions significatives durant el desenvolupament animal, sent màxims quan els ratolins són asimptomàtic (1-mes d'edat) i que disminueix quan es produeix la simptomatologia completa [43]. Malgrat aquest problema, l'expressió d'APP tant a l'escorça com a l'hipocamp va ser significativament més alta en comparació amb la dels ratolins WT del nostre estudi. Un tractament addicional amb quercetina o rutina va poder reduir significativament aquesta expressió tant per als ratolins mascles com per a les femelles, a les dues zones del cervell. Aquestes troballes estan en línia amb les informades per Augustin et al. [44] que va estudiar un extracte estandarditzat de Ginkgo biloba (Egb761), ric en flavonols com la quercetina, en ratolins TgAPP femelles de 4-mes d'edat, trobant una disminució dels nivells d'ARNm i proteïnes d'APP. Tenint en compte que la regulació de la traducció de l'APP als ratolins Tg2576 es produeix en les etapes prodròmiques i primerenques dels símptomes [45], és probable que la restauració de la traducció de l'APP per quercetina o rutina hagi tingut lloc als nostres ratolins TgAPP i, probablement, en un primer moment. estadi simptomàtic, que resulta en una reducció dels nivells corticals i hipocampals d'APP, activitat BACE1 i activació de la caspasa-3.

A més, s'ha informat en altres llocs que en els ratolins Tg2576 (en absència de pèrdua neuronal) hi ha un augment de l'activació de la caspasa-3 a l'hipocamp [46], tal com es va trobar al nostre estudi, a l'inici del deteriorament de la memòria. , juntament amb una reducció de les espines dendrítiques abans de la deposició d'amiloide extracel·lular [46]. Hi ha proves que recolzen els papers no apoptòtics de les caspases al sistema nerviós sense mort neuronal [47], i l'activitat de la caspasa-3 s'ha localitzat a les espines dendrítiques on pot elevar els nivells de calcineurina. Al seu torn, es creu que la desfosforilació de la subunitat GluR1 dels receptors semblants a AMPA, desencadenada per la calcineurina, provoca una disfunció postsinàptica. Els nostres valors d'expressió de caspasa-3, com a conseqüència de la transgènesi, estan d'acord amb els obtinguts per altres investigadors que van informar d'un augment de l'expressió de caspasa-3 a nivell de les espines dendrítiques a l'hipocamp dels ratolins TgAPP. [48]. Com que l'APP conté tres llocs de clivatge diferents per a la caspasa-3 en la seva seqüència d'aminoàcids, dos dels quals es troben al nivell del domini extracel·lular i un a la porció intracel·lular C-terminal de la cua de l'APP [49], hidròlisi d'APP per caspasa-3 pot alterar el processament proteolític de l'APP a favor de la via amiloidogènica [50], donant lloc a l'alliberament d'un pèptid citotòxic derivat del C-terminal de 31 aminoàcids de longitud (C31), per exemple [51]. Això suggereix que, com que la caspasa-3 pot mediar l'amplificació de l'alliberament de fragments tòxics de l'APP, reduir l'expressió de caspasa-3 per la quercetina o la rutina pot permetre l'eliminació de la proteïna agregada. A més, com s'ha esmentat anteriorment, hem explorat la influència tant de l'augment com de la disminució de l'expressió de la caspasa-3 en la transmissió sinàptica glutamatèrgica, basada en la capacitat de la caspasa activada per calcineurina-3 per desfosforilar la subunitat GluR1. dels receptors AMPA a nivell postsinàptic. Aquestes modificacions moleculars alteren la transmissió sinàptica glutamatèrgica i la plasticitat neuronal a nivell de les espines dendrítiques de l'hipocamp [48]. Teòricament, la inhibició farmacològica de l'activitat de la caspasa-3 en els ratolins TgAPP podria salvar els fenotips semblants a l'AD d'un mecanisme que provoca la fallada sinàptica. Tanmateix, malgrat l'augment de l'expressió de caspasa-3 al nostre ratolí TgAPP, no vam trobar diferències significatives en l'expressió del receptor AMPA en comparació amb la dels ratolins WT, com s'ha esmentat anteriorment. Pot ser que els canvis en l'expressió de la caspasa -3 no siguin prou destacats per produir modificacions significatives en l'expressió del receptor AMPA (dades complementàries, figura S2 i taula S5).

Pel que fa als valors de l'expressió de la caspasa-6, no es van trobar diferències significatives entre els ratolins TgAPP i WT. L'activació de la caspasa -6 s'ha identificat com un important mediador de l'estrès neuronal que escinda proteïnes importants del citoesquelet (Tau i -tubulina), interrompent així la degradació ubiquitina-proteasoma de proteïnes mal plegades i diverses densitats postsinàptices que regulen l'actina. proteïnes [52]. L'expressió sense canvis de la caspasa -6 del nostre estudi està d'acord amb l'absència de signes característics de neurodegeneració a l'edat en què es van avaluar aquests ratolins transgènics, en comparació amb els ratolins WT (dades complementàries, figura S1).

S'ha observat un augment marcat dels mediadors neuroinflamatoris en pacients amb MA, principalment al voltant de les plaques senils [53–55]. Els astròcits són el principal proveïdor de GSH a la microglia i les neurones. Durant la inflamació crònica i l'estrès oxidatiu, els astròcits alliberen mediadors inflamatoris tòxics i radicals lliures, accelerant l'activació de la microglia i la neurodegeneració [56]. Val la pena assenyalar que la disminució del glutatió intracel·lular està relacionada amb l'activació de les vies inflamatòries, p38 MAP-quinasa, Jun-N-terminal kinase (JNK), NF-κB, a la microglia humana i els astròcits [57]. En aquest sentit, vam decidir quantificar els nivells d'IL-1, IFN- i TNF- en el nostre model animal i determinar l'efecte de la quercetina i la rutina sobre ells. Com és sabut, la inflamació afavoreix el processament defectuós del pèptid A i de l'APP, afavorint l'agregació del pèptid A i, al seu torn, modificant la reactivitat d'A [58]. Així, en el nostre estudi, vam observar que els ratolins TgAPP havien augmentat els nivells d'ARNm dels mediadors proinflamatoris IL-1, TNF- i IFN-, en comparació amb els ratolins WT, demostrant que la sobreexpressió d'APPswe podria induir cascades neuroinflamatòries. desencadenant una sèrie de vies moleculars a la glia i les neurones, que activarien la resposta inflamatòria. La quercetina i la rutina van poder atenuar l'expressió del gen IL-1 tant en homes com en dones i en les àrees cerebrals estudiades. Diverses proves donen suport a l'efecte antiinflamatori que exerceix la quercetina a nivell del SNC, ja que pot inhibir l'activació de factors de transcripció com el factor nuclear-kappa B (NF-κB) [59], implicat en la inducció d'iNOS, i per tant, disminueix l'alliberament de mediadors com IL-1, TNF- i IFN- [60]. Pel que fa a l'impacte del GSH en la resposta inflamatòria, cal assenyalar que el GSH està implicat en el manteniment dels nivells òptims de citocines de manera que l'expressió de citocines proinflamatòries (TNF-, IL{28}} i IL). -6) s'incrementen a causa de l'esgotament de GSH, mentre que l'expressió de citocines antiinflamatòries (és a dir, IL-10) es va mantenir inalterada. Aquesta alteració de l'homeòstasi de GSH es produeix a causa de la regulació de les vies de senyalització NF-κB i JNK que podrien ser la via apoptòtica factible cap a la mort de les cèl·lules neuronals [61]. En el nostre estudi, la baixa regulació de NF-κB per la quercetina i la rutina podria ser un mecanisme plausible per recuperar l'homeòstasi GSH/GSSG i, per tant, la causa de l'equilibri entre les citocines proinflamatòries i antiinflamatòries. Finalment, com que el promotor BACE1 té un lloc d'unió de NF-κB, l'activació de NF-κB induïda per la inflamació facilita la regulació de l'expressió de BACE1 i, posteriorment, augmenta la producció d'A [62]. Així, si es produeix una baixa regulació de NF-κB a les dietes de quercetina i rutina, l'activitat de BACE1 disminuiria com a resultat de la regulació de l'alliberament de citocines proinflamatòries i no antiinflamatòries.

4. Material i Mètodes

4.1. Animals d'experimentació

Es va utilitzar un ratolí transgènic (Tg2576, B6; SJL-Tg (APPswe) 2576 Kha) que expressa la doble mutació sueca de la proteïna precursora de l'amiloide humana (hAPP) com a model animal de l'AD experimental [14]. El ratolí és una línia heterozigota que expressa la isoforma humana A PP695 amb la doble mutació sueca (K670N/M671L; Lys670→Asn i Met671→Leu) sota el control del promotor de la proteïna prió del hàmster [63]. Com a resultat, aquest ratolí presenta nivells de proteïna precursora d'amiloide humana (A PP), sis vegades més grans que els nivells d'A PP d'un ratolí. A més, aquest ratolí mostra nivells més alts d'A 40 i A 42. Els dipòsits d'A comencen als 9 mesos d'edat [63]. Dins de l'hipocamp i l'escorça Tg2576, l'expressió transgènica APPswe és principalment neuronal [64].

Com a control negatiu, es van utilitzar ratolins de tipus salvatge (WT) de la mateixa colònia [65,66]. La colònia de ratolí Tg2576 (B6; SJL-Tg (APPswe) 2576 Kha) es va desenvolupar al nostre laboratori a partir de mascles heterozigots Tg2576 i femelles de tipus salvatge. Els pares transgènics van ser donats per la doctora Diana Frechilla de la Divisió de Neurociència del Centre d'Investigació Mèdica Aplicada de la Universitat de Navarra (Pamplona, ​​Espanya) [67].

Els animals es van allotjar en gàbies ventilades individualment i es van mantenir a 22-24 ◦ C en un cicle de llum/foscor de 12- h amb un 50-60 per cent d'humitat. Els protocols d'animals van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals (IACUC) de la Universitat Complutense de Madrid i estaven totalment d'acord amb la Directiva Europea 2010/63/de protecció dels animals utilitzats amb finalitats científiques i la legislació espanyola sobre Benestar Animal ( Reial Decret 53/2013, d'1 de febrer de 2013).

4.2. Anàlisis de genotipatge de ratolins

La transgenicitat es va determinar dins dels 30 dies del naixement mitjançant biòpsia de la cua. Les anàlisis de genotipatge d'animals es van realitzar mitjançant PCR. Tenint en compte que Tg2576 (TgAPP) és una línia heterozigota, es va utilitzar el gen d'inserció (PrP, de la proteïna priònica) com a control de reacció positiu. L'ADN genòmic es va extreure de cues de ratolí digerides amb proteinasa K (0,1 µg/µL) en tampó NID (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM MgCl2, 0,05 per cent de gelatina, 0,45 per cent de NP-40 i 0,4 per cent de Tween 20) a 56 ◦C durant 3 h i agitat. Els fragments d'ADN es van precipitar amb isopropanol i es van rentar amb etanol al 70%. Els precipitats d'ADN es van dissoldre en 30 µL de tampó TE (10 mM Tris-1 mM EDTA). La puresa i la concentració d'ADN es van determinar a 260 i 280 nm.

Els gens PrP i APP es van amplificar mitjançant PCR. Les seqüències d'encebadors utilitzades per cridar els ratolins transgènics van ser les següents: PrP endavant: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP revers: GTGGATACCCCCTCCCCCAGCCTAGACC; APP inversa: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. Els passos de la reacció PCR van ser els següents: desnaturalització a 94 ◦ C durant 90 s, 39 cicles a 60 ◦ C durant 60 s i 72 ◦ C durant 90 s, després extensió final a 72 ◦ C durant 7 min.

En tots els casos, es van considerar controls negatius (sense motlle d'ADN) i controls positius del gen APP. Els productes de PCR obtinguts es van separar mitjançant electroforesi en gels d'agarosa a l'1,5 per cent en tampó 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya) a 70 V (tensió constant) i després es van fer imatges tenint-los amb GelRed (Millipore).

4.3. Tractaments amb animals

Els ratolins TgAPP i els seus companys de camada de tipus salvatge, tots dos d'entre 6 i 7 setmanes amb un pes corporal inicial de 16,2 ± 0,8 g, es van classificar aleatòriament en els quatre grups següents (n=8/grup): ( a) TgAPP no tractada; ( b ) TgAPP tractat amb quercetina; (c) TgAPP tractat amb rutina; i (d) tipus salvatge no tractat. Com que es van estudiar ratolins mascles i femelles, es van establir dos grups de grups. A l'edat de 45 setmanes, els ratolins van començar a ser tractats amb quercetina o rutina durant 4 setmanes.

La quercetina (3,30,40,5,7-pentahidroxiflavona) i l'hidrat de rutina (quercetina-3-O-rutinoside hidrat) eren superiors o iguals al 95 per cent de puresa i es van comprar a Sigma-Aldrich. Cadascun dels flavonoides es va incorporar a una dieta estàndard (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Espanya) a una concentració de 200 ppm, corresponent a una ingesta de 30 mg de flavonoide/kg de pes corporal/dia. Els ratolins no tractats van rebre exclusivament la dieta estàndard no complementada. Es van proporcionar dietes i aigua per a la ingesta ad libitum.

4.4. Preparació del teixit cerebral per a assaigs bioquímics i histològics

Al final del tractament, els ratolins van ser dejunats durant la nit, van ser sacrificats mitjançant la luxació cervical i es va eliminar ràpidament tot el cervell. El cervell es va esbandir amb solució salina a 4 ◦ C i es va eliminar amb cura la membrana aracnoïdal. A continuació, es van aïllar l'hipocamp i l'escorça. Les mostres es van emmagatzemar immediatament a -80 ◦ C fins a un nou ús.

El cervell sencer d'alguns animals es va utilitzar per a l'obtenció de seccions histològiques, per a les quals, un cop sacrificats mitjançant la luxació cervical, els cervells es van congelar per immersió en isopentà a -80 ◦C. Immediatament després, es van fer seccions coronals del cervell (30 µm de gruix) des del bulb olfactiu fins al cerebel, a una distància de 120 µm en un criostat (Leica CM1850, Nussloch, Alemanya). Tot el procediment es va realitzar a -20 ◦C. Les seccions histològiques es van recollir en diapositives i es van mantenir a -80 ◦ C fins a l'anàlisi (vegeu Mètodes suplementaris).

4.5. Glutatió

Per a les proves de glutatió, les mostres d'escorça cerebral i d'hipocamp es van homogeneïtzar en un tampó d'extinció redox -5 per cent d'àcid acètic de triclorur (RQB-5 per cent de TCA) (prèviament bombollejat amb N2 durant 15 min sobre gel) a una concentració de 25 mg/mL (p/v). Les mostres es van tornar a suspendre per sonicació durant 10 s, després es van centrifugar a 12, 000 × g durant 10 min a 4 ◦ C i es van recollir els sobrenedants.

Aleshores, en el sobrenedant obtingut, es van adoptar mètodes espectrofluoromètrics per determinar els nivells de GSH i GSSG mitjançant el mètode d'o-ftalaldehid, descrit per Senft et al. [68]. Els valors de GSH i GSSG es van corregir per a una reacció espontània en absència d'una mostra biològica. En ambdós casos, els sobrenedants es van incubar durant 30 min a temperatura ambient i després es va mesurar la fluorescència mitjançant un lector de microplaques FLUOSTAR (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Alemanya), amb el filtre d'excitació ajustat a 360 nm (amplada de banda 5 nm) i el filtre d'emissió establert a 460 nm (amplada de banda 5 nm). La concentració de GSH i GSSG a cada mostra es va interpolar a partir dels estàndards de GSH coneguts. Les concentracions tant de GSH com de GSSG es van expressar com a nmol GSH/mg de proteïna, la qual cosa va permetre el càlcul de la relació redox de glutatió GSH/GSSG.

Els pellets restants es van vortexar fins que es van dissoldre completament en 240 µL de NaOH 0,1 M per mesurar la concentració de proteïnes pel mètode d'àcid bicinconínic (BCA), utilitzant albúmina sèrica bovina com a estàndard.

【Per a més informació:george.deng@wecistanche.com/WhatApp:86 13632399501】