Un nou biomaterial antioxidant natural de les fulles de Cinnamomum Osmophloeum Kanehira reprimeix la melanogènesi i protegeix contra el dany de l'ADN

Contacte: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1* i Chi-Yue Chang 2

Resum:Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) és una espècie d'arbre autòcton a Taiwan. Composicions químiques,antioxidantactivitat, bolettirosinasaEs va examinar la inhibició, la repressió de la síntesi de melanina i la protecció contra el dany de l'ADN de l'hidrosol de les fulles de COK per destil·lació amb vapor. Hem realitzat 1,1-difenil-2-captura de radicals picrilhidrazil, quelat d'ions metàl·lics, potència reductora i assajos de capacitat antioxidant equivalent de Trolox (TEAC) i vam determinar les correlacions entre el contingut fenòlic total i les activitats antioxidants. Els resultats van demostrar que les propietats antioxidants de l'hidrosol COK estan estretament correlacionades amb els seus continguts de fenol. A més, els components principals de l'hidrosol, és a dir, el cinamaldehid i el benzaldehid, tenien efectes anti-tirosinasa depenents de la dosi contra les activitats de la monofenolasa i la difenolasa. L'anàlisi GC-MS va revelar que els components bioactius principals de l'hidrosol eren el trans-cinamaldehid (87,7 per cent). benzaldehid (7,0 per cent) i acetat de cinamil (5,3 per cent). A més, vam trobar que l'hidrosol amb presència de benzaldehid és més potent que el cinamaldehid pur i millora eltirosinasaactivitat inhibidora de l'hidrosol. En les anàlisis cinètiques, Lineweaver–Burk dibuixa i replot va demostrar que l'hidrosol de COK és un inhibidor de tipus mixt. A més, vam trobar que dosis molt baixes d'hidrosol de COK reprimien la síntesi induïda per l'hormona estimulant dels melanòcits del factor de transcripció associat a la microftàlmia, la qual cosa conduïa a una disminució de la síntesi de melanina a les cèl·lules del melanoma B16-F10. Aquests resultats van demostrar que la producció d'hidrosol a partir de fulles de COK mitjançant la destil·lació de vapor pot proporcionar una font segura i eficaç depell-blanqueigagents per a aplicacions cosmètiques i farmacèutiques, ambantioxidant, anti-tirosinasa, anti-melanogènesi i activitats protectores de l'ADN.

Paraules clau: antioxidantactivitat; Cinnamomoum ​​osmophloeum; hidrosol;tirosinasaactivitat inhibidora;blanqueig; Efectes protectors de danys a l'ADN

Feu clic aCistanchetija i producte per blanquejar la pell

1. Introducció

Els trastorns de la pell humana com el lentigo, les taques de l'edat, el melasma i els melanomes malignes s'han relacionat amb la formació i acumulació de melanina [1]. La inhibició de les tirosinases i la melanogènesi poden millorar els trastorns dermatològics i la síndrome d'hiperpigmentació. A més, el mercat global d'agents per blanquejar la pell i productes cosmecèutics s'ha expandit recentment perquè moltes persones de pell més fosca prefereixen el color més clar [2]. Per tant, eficaç i segurtirosinasai els inhibidors de la síntesi de melanina es consideren importants per a la prevenció de la malaltia de la pigmentació i altres problemes de salut humana relacionats amb la melanina [3,4]. A més, els tòxics ambientals causen diferents tensions oxidatives als éssers humans i poden produir espècies reactives de nitrogen o espècies reactives d'oxigen (ROS) [5]. L'excés de radicals lliures i ROS s'associen amb vies de senyalització inflamatòria, que finalment condueixen a danys cel·lulars, envelliment, trastorns neuronals, diabetis, aterosclerosi, malalties inflamatòries, cardiovasculars, càncer i melanogènesi [6,7]. Diversos estudis ho suggereixenantioxidantspot inhibir els danys de la pressió oxidativa actuant com a eliminadors de radicals lliures o eliminadors de ROS [7,8]. A més, tant els inhibidors de la generació de ROS com els eliminadors de ROS poden reduir la producció de melaninpigments [9]. Concretament,tirosinasaés un enzim clau que catalitza un pas que limita la velocitat en els dos primers passos durant els processos de síntesi de melanina [10], i la regulació a la baixa de la tirosinasa és un objectiu crític per a la prevenció de malalties de la pell i la producció deblanqueig de la pell[11]. Per tant, el desenvolupament d'antioxidants naturals que inhibeixin eficaçment les tirosinases per a la prevenció o el tractament de la hiperpigmentació indesitjable de la pell i la protecció contra el dany de l'ADN és essencial.

Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) és una espècie de canyella autòctona de Taiwan amb molts usos com a herbes medicinals xineses. Els compostos actius dels olis essencials de COK mostren un excel·lent potencial com a antibacterians farmacològics [12]. Tot i que estudis anteriors d'extractes d'alcohol de fulles de COK van demostrar activitats anti-tirosinasa, gairebé tots aquests estudis es van centrar en extractes d'etanol o olis essencials de COK. A més, no s'han informat estudis quantitatius i sistemàticsantioxidantpropietats,tirosinasaactivitats inhibidores i repressió de la síntesi de melanina per extractes d'aigua (hidrosol) de fulles de COK. Per tant, aquest estudi es va realitzar per investigar els efectes de l'hidrosol COK sobre l'estrès oxidatiu i la melanogènesi a les cèl·lules de melanoma B16F10 i protegir contra el dany de l'ADN. Aquest estudi és el primer informe detallat de la composició química iantioxidant, inhibició de la tirosinasa, melanogènesi repressiva i activitats protectores de danys a l'ADN de l'hidrosol de les fulles de COK.

2. Materials i Mètodes

2.1. Productes químics i anticossos

Bolettirosinasa, hidroxitoluè butilat (BHT), -tocoferol, 6-hidroxi-2, 5,7,8-tetrametilcroman-2-àcid carboxílic (Trolox), àcid tricloroacètic (TCA), gàl·lic àcid, ferricianur de potassi, clorur fèrric, clorur fèrric, ferrozina, 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH),20-azino-bis{-3-etilbenztiazolina{{14} } àcid sulfònic (ABTS), reactiu Folin-Ciocalteu, L-tirosina i L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) es van obtenir de Merck Co. (Darmstadt, Alemanya). Tots els productes químics i els dissolvents utilitzats en l'estudi eren de grau analític o de cromatografia líquida d'alt rendiment. Els anticossos contra el factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF) i l'actina es van obtenir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA) i Sigma Chemical Co. (St. Louis, EUA), respectivament.

2.2. Preparació d'hidrosols: Extracció de fulles de COK mitjançant destil·lació de vapor

Les fulles d'un arbre COK de 13-anys a Taiwan (núm. 186, Yongping Road, Zhonggliao Township, Nantou County, Taiwan) es van assecar a l'aire. Amb una mòlta d'acer inoxidable, les fulles es van triturar en una pols fina (menys de 10 malles) i després es van emmagatzemar a temperatura ambient. A continuació, es van extreure 3,5 kg de pols de fulla COK seca mitjançant destil·lació de vapor durant 4 h. Aquest procés es va repetir quatre vegades. Mitjançant un buit, es va filtrar l'extracte i després, mitjançant un evaporador rotatiu, es va obtenir l'extracte sec (Figura 1). Finalment, l'extracte es va evaporar per obtenir un pes final.

2.3. Cromatografia de gasos/espectrometria de masses (GC/MS) Anàlisi d'hidrosols

Un instrument Thermo-GC/MS amb una columna capil·lar de 5 per cent de fenil- 95 per cent de metilpolisiloxà reticulat THERMO WaxMS (60 m × 0,25 mm d.i., gruix de pel·lícula {{1 0}},25 µm) es va utilitzar amb heli com a gas portador a un cabal constant d'1,0 ml/min. La columna es va mantenir a 200 ◦ C durant 5 min després de la injecció i després es va escalfar a 5 ◦ C/min a 260 ◦ C. Es va injectar oli essencial pur (1,0 ml) amb una proporció dividida d'1:100. Les temperatures de l'injector, la línia de transferència i la font d'ions eren de 250 ◦ C, 250 ◦ C i 200 ◦ C, respectivament. La detecció de MS es va realitzar en el mode d'impacte d'electrons a 70 eVionització d'energia i 60 µA de corrent d'ionització; l'instrument es va operar en mode d'adquisició d'escaneig complet en el rang de 50 a 350 amu. Els compostos es van identificar comparant els temps de retenció i els índexs dels pics cromatogràfics amb els dels estàndards de referència autèntics, injectats en les mateixes condicions. Els patrons de fragmentació de MS es van comparar amb els de compostos purs i es va cercar la base de dades d'espectre de masses mitjançant la base de dades MSspectral de l'Institut Nacional d'Estàndards i Tecnologia (NIST) [13].

2.4.Continguts fenòlics totals

El contingut fenòlic total (TPC) dels extractes es va determinar mitjançant els assajos Folin-Ciocalteu descrits anteriorment [14]. Breument, es van barrejar mostres d'hidrosol (100 µL) amb alíquotes de 100 µL de reactiu Folin-Ciocalteu (10-dilució de vegades) i alíquotes de 10 µL de carbonat de sodi (10 per cent, p/v). Després d'emmagatzemar durant 30 min, el L'absorbància es va mesurar a 735 nm. Els TPC s'expressen com a equivalents d'àcid gàl·lic (GAE) en mg per 100 g de material fresc.

2.5. Assajos d'eliminació de radicals lliures DPPH

Com es va descriure anteriorment, mitjançant l'assaig DPPH, es van determinar les activitats d'eliminació de radicals de l'hidrosol [15], amb modificacions. Breument, es van afegir diferents dilucions de mostres d'hidrosol (75 µL per triplicat) a alíquotes de 150 µL de DPPH (0,02 g/100 mL) i es va mesurar l'absorbància a 517 nm després de 30 min. Es va utilitzar BHT com a control positiu (0,5 mg/ml d'etanol). Les activitats d'eliminació de radicals es van expressar com a proporcions d'inhibició (per cent) mitjançant l'equació següent:

La proporció d'inhibició (per cent)=[1 − (A/B)] × 100 per cent

on A és l'absorbància de la mostra d'hidrosol i B és l'absorbància del blanc.

2.6. Concentracions inhibidores fraccionades

Els assajos de concentracions inhibidores fraccionades (FIC) es van realitzar tal com es va descriure anteriorment [16], amb modificacions. Breument, es va barrejar FeSO4 (20 µL; 2 mM) amb diferents dilucions de mostres d'hidrosol (200 µL). Després d'afegir ferrozina (40 µL; 5 mM), es va deixar que les reaccions s'esdevinguessin durant 10 minuts i després es va mesurar l'absorbància a 562 nm. A més, es va utilitzar 0,5 mg/mL d'àcid etilendiaminotetraacètic (EDTA) com a control positiu. El percentatge d'inhibició de ferrozina-Fe2 més la formació del complex es va calcular mitjançant la fórmula següent:

Efecte quelant metàl·lic (per cent)=[1 − (A/B)] × 100 per cent

on A és l'absorbància de la mostra d'hidrosol i B és l'absorbància del blanc.

2.7. Assajos de reducció de potència

El poder reductor de l'hidrosol COK es va determinar mitjançant el seguiment de la reducció de Fe3 més a Fe2 més tal com es va descriure anteriorment [17], amb modificacions. Breument, a dilucions de 50 µL d'hidrosol, es van 50-µL·líquotes de tampó fosfat (pH 6,6, 200 mM) i 50-µL alíquotes de ferricianur de potassi (1 per cent, p/v) afegit. Després de la incubació a 50 ◦ C durant 20 min, es van afegir 50 µl de TCA (10 per cent, p/v); i la barreja es va centrifugar a 9,000 rpm durant 3 min. Finalment, es van barrejar 50 µl de sobrenedant amb 50 µl d'aigua destil·lada i 50 µl de clorur fèrric en aigua (0, 1 per cent, p/v) i es va mesurar l'absorbància a 700 nm contra un blanc després de 10 min de temps de reacció. Els controls positius utilitzats van ser hidroxitoluè butilat (BHT) i -tocoferol.

2.8. Assaig de Capacitat Antioxidant Equivalent de Trolox (TEAC).

AntioxidantLes activitats de l'hidrosol COK es van avaluar segons un mètode descrit anteriorment [15, 18], amb modificacions. Breument, la solució concentrada de cations radicals ABTS (ABTS• plus ) es va diluir en solució salina tamponada amb fosfat (pH 7,4) fins a una absorbància final de 0,80 ± 0,05 a 734 nm. Després de barrejar la mostra (0,02 ml) amb 1 ml d'ABTS més solució, es van produir reduccions de l'absorbància a 734 nm després de 5 min. Es va utilitzar Trolox com a estàndard i les activitats d'hidrosol es van expressar com a TEAC traçant corbes de calibració Trolox. Els valors de TEAC equivalents molars de les mostres d'hidrosol es van calcular segons les disminucions de l'absorbància de la solució de Trolox. Es van utilitzar BHT i -tocoferol com a controls positius.

2.9. Efectes de l'hidrosol sobre la inhibició de la tirosinasa de bolets

BolettirosinasaL'activitat es va mesurar mitjançant l'anàlisi espectrofotomètrica tal com s'ha descrit anteriorment, amb modificacions [19]. Breument, es van afegir 20 µl de L-tirosina o 20 µl de L-DOPA en PBS (pH 6,8; 80 µl) i 80 µl de PBS amb o sense hidrosol de prova a les microplaques de 96-pous, i després 20 µl de tirosinasa de bolets (100 U/ mL) es va afegir. Després de barrejar i incubar a 37 ◦ C durant 20 min, es va determinar la producció (o el consum) de dopacrom a la barreja de reacció a una absorbància de 475 nm. L'àcid kòjic, que inhibeix la tirosinasa, es va utilitzar com a control positiu. El percentatge d'inhibició de la tirosinasa es va calcular de la següent manera:

Inhibició (per cent) ≡ {[(A − B) − (C − D)]/(A − B)} × 100 per cent

on A indica absorbància amb enzim en absència de mostra d'hidrosol, B indica absorbància sense enzim o mostra d'hidrosol, C indica absorbància amb enzim i hidrosol i Dindica absorbància sense l'enzim però amb hidrosol. També hem calculat el 50 per centtirosinasaconcentracions inhibidores (IC50) de les mostres com les que inhibeixen l'activitat de la tirosinasa en un 50 per cent.

2.10. Anàlisi cinètica de la inhibició de la tirosinasa dels bolets

Les mescles de reacció contenien 20 µL de L-tirosina o L-DOPA (0,25 mg/mL) com a substrats, 100 µLof tirosinasa de bolets (20 unitats/mL) en tampó de fosfat sòdic 0,2 M ( pH 6,8) i 80 µL de cada mostra d'hidrosol en un volum total de 200 µL. L'assaig es va realitzar a 25 ◦C i la cinètica inhibidora de cada mostra d'hidrosol ambtirosinasaes va analitzar mitjançant gràfics Lineweaver-Burk. L'equació recíproca es va utilitzar per a un equilibri ràpid a partir de la inhibició no competitiva de tipus mixt, tal com s'expressa a l'equació (1) [20]. Els valors de Ki per a les mostres d'hidrosol es van estimar a partir de replots de pendent (equació (2)). Els valors de Ki per a l'hidrosol es van calcular a partir del diagrama d'intercepció de l'eix 1/v (equació (3)),

on Vmax és la velocitat màxima de latirosinasaactivitat, K és la constant de dissociació del substrat (S) del complex enzim-substrat (ES), Ki és la constant de dissociació de l'inhibidor [I] del complex enzim-inhibidor i Ki és la constant de dissociació de l'inhibidor de l'enzim-substrat - Complex inhibidor (ESI).

2.11. Cultiu cel·lular i assaigs de viabilitat cel·lular

Les cèl·lules de melanoma B16-F10 (BCRC60031) es van obtenir del Bioresource Collection and ResearchCenter (BCRC), Taiwan. Les cèl·lules B16-F10 es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (Gibco, Califòrnia, EUA) que contenia un 10 per cent de FBS a 37 ◦ C en un 5 per cent de CO2. Mitjançant la tripsinització, es van recollir cèl·lules. La viabilitat cel·lular es va mesurar mitjançant un assaig de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il){-2,5-difeniltetrazoliumbromur (MTT) tal com el descriu Lee [15 ].

2.12. Contingut de melanina cel·lular

El contingut de melanina es va mesurar mitjançant el mètode descrit per Lee. [15]. Breument, les cèl·lules B16-F1{0 es van cultivar en plaques de 6-pous a una densitat de 0,8 × 105 cèl·lules per pou i després es van incubar durant 24 h. tractat amb 100-nM -hormona estimulant dels melanòcits (-MSH), àcid cògic (control positiu) i hidrosol a diverses concentracions durant 24 h. Després de rentar-se dues vegades amb PBS, les cèl·lules es van lisar en un tampó que contenia 100 mM de fosfat de sodi (pH 6, 8), 1 per cent de Triton X-100 i 0, 1 mM de fluorur de fenilmetanosulfonil i es van emmagatzemar a -80 ◦ C durant 30 min. Després de recollir les cèl·lules, el pellet cel·lular es va dissoldre en NaOH 1 N que contenia un 10 per cent de DMSO a 65 ◦ C durant 1 h. A continuació, es va mesurar l'absorbància a 405 nm.

2.13. Western Blot

Les cèl·lules es van lisar tal com es descriu a la secció 2.11 i es van sotmetre a Western blotting per proteïna MITF utilitzant un anticòs Anti-MITF.

2.14. Assajos de protecció de l'ADN

El dany oxidatiu de l'ADN es va determinar d'acord amb la conversió de l'ADN del neoplasmidi supercoiledpCI circular en formes circulars tallades o més degradades mitjançant un mètode descrit anteriorment [21, 22] amb lleugeres modificacions. Les mescles de reacció de 20 µL contenien 2,5 µL de supercoiledpCI neo (150 ng/µL), 10 µL d'una solució de reacció de Fenton que contenia 30 mM de peròxid d'hidrogen, 100- µM de clorur fèrric i 100 Àcid ascòrbic µM en tampó Tris-HCl 20 mM (pH 7,6) i 5µL d'hidrosol (0,3325–5,32 mg/mL) o quercetina (control positiu; 250 µg/mL). Les mescles de reacció es van incubar a 37 ◦ C durant 30 min i les formes d'ADN plasmidi es van separar en gels d'agarosa al 0, 7% i es van tenyir amb SafeView™ (Applied Biological Materials (ABM) Inc., Richmond, Canadà).

Per semiquantificarantioxidantEs van quantificar les activitats dels extractes, les quantitats de formes superenrotllades i tallades de pCI neo mitjançant un instrument AlphaImager Mini (proteinsimple) i es van quantificar les intensitats de banda en gels d'agarosa mitjançant el programari Gelpro. Com a controls negatius i positius, el neoplàsmid pCI es va incubar sol i amb la barreja de reactius Fenton, respectivament. Les dades s'expressen en quantitats d'ADN superenrotllat en relació amb el (100 per cent) dels controls negatius. Les activitats protectores dels extractes es van calcular a partir de quantitats d'ADN plasmidi superenrotllat i tallat mitjançant les equacions següents [23]:

Protecció del plasmidi superenrotllat (per cent) =intensitat de la forma superenrotllada pCI intensitat de la banda d'ADN neo × 100

Protecció del plasmidi tallat (per cent) =intensitat de la forma tallada pCI intensitat de la banda d'ADN neo × 100

2.15. Anàlisi estadística

Totes les dades s'expressen com a mitjanes ± desviació estàndard (SD). Les diferències entre tractaments es van identificar mitjançant la prova t de Student o ANOVA seguida de la prova de Scheffe. Les diferències es van considerar significatives quan p <>

3. Resultats i discussió

3.1. Identificació de compostos volàtils en hidrosols

Els continguts d'hidrosols es van analitzar mitjançant GC/MS. Els components es van identificar segons els temps de retenció dels estàndards i les quantitats es van determinar a partir de les àrees màximes dels eluents (figura 2). Tal com es descriu a la figura 2A-D, el trans-cinamaldehid, el benzaldehid i l'acetat de cinamil eren els compostos principals de l'hidrosol de COK i estaven presents a 87,7 per cent, 7,0 per cent i 5,3 per cent, respectivament. Anteriorment, Eugeno es trobava en olis essencials de C. verum al 7,29 per cent [24], però no es va detectar en l'hidrosol de COK actual (figura 2). Les diferències en els processos d'extracció i els mètodes d'assaig poden contribuir a les diferències en el contingut de cinamaldehid dels olis essencials de C. cassia [25].

3.2. Propietats antioxidants de l'hidrosol de les fulles de COK

3.2.1. Activitat d'eliminació radical de DPPH

A la figura 3A, les activitats d'eliminació de radicals DPPH dels hidrosols d'1.06 × 1{0-2 a 5,32 × 1{0-1 mg/mL eren entre 5.04. per cent ± 0,96 per cent i 41,76 per cent ± 2,50 per cent, respectivament. Aquestes dades indiquen una eliminació depenent de la dosi mitjançant l'hidrosol COK. En comparació, els controls positius BHT i -tocoferols van eliminar el 94,32 per cent ± 0,08 per cent i el 93,82 per cent ± 0,13 per cent dels radicals reactius de DPPH, respectivament, a 0,5 mg/mL. ).Molts estudis demostren que els fenòlics i els flavonoides impedeixen la formació de radicals DPPH donant àtoms d'hidrogen. Per tant, les activitats d'eliminació de radicals DPPH de les espècies de Cinnamomum també poden reflectir accions com a donant d'hidrogen [26, 27].

3.2.2. Quelació d'ions metàl·lics

Es va avaluar el Fe2 més la capacitat d'unió dels hidrosols a 1, 06 × 10−3 i 5, 32 × 10−1 mg/mL, tal com es mostra a la figura 3A. La quelació metàl·lica per components d'hidrosol va augmentar marginalment amb la concentració, però a 6 mg/ml, només tenia un 37, 3 per cent de l'activitat quelant de l'EDTA (figura 3A).

3.2.3. Potència reduïda

Com es mostra a la figura 3A, el poder reductor dels components de l'hidrosol depenia de la concentració i era superior al de BHT i -tocoferol (0,22 ± 0.01 i {{9}). }},33 ± 0,15, respectivament) a 0,5 mg/mL. En estudis anteriors, el poder reductor dels extractes bruts de branques de C. osmophloeum en fraccions BuOH era el més alt entre totes les fraccions i augmentava linealment amb la concentració [28].antioxidantEls potencials difereixen entre els compostos dels extractes, les activitats antioxidants generals dels extractes depenen molt del dissolvent d'extracció. Tanmateix, el poder reductor (valor de DO {{0}},7) dels extractes d'aigua de branques de C. osmophloeum era similar (valor de DO=0,66 ± 0,01) al de l'actual C. hidrosols d'osmophloeum (figura 3A), que es van produir mitjançant destil·lació de vapor. La potència reductora s'associa generalment amb la presència d'agents reductors i activitat antioxidant, cosa que reflecteix l'aturada de les reaccions en cadena dels radicals lliures per la disposició d'àtoms d'hidrogen reductors. El poder reductor de C. osmophloeum es deu probablement a la presència dels grups hidroxil en compostos fenòlics (Figura 2), que podrien actuar com a donants d'electrons.

3.2.4. Assajos TEAC

Els valors de TEAC del present hidrosol es van augmentar a concentracions superiors a 5,32 × 10−3 mg/mL i eren més grans que els dels compostos de referència -tocoferol i BHT, tal com es mostra a la figura 3A. L'accessibilitat estèrica al lloc radical d'ABTS plus és la principal criteri d'activitat en assajos TEAC. En conseqüència, els grups fenil dels constituents de l'hidrosol actuals estan lleugerament menys obstaculitzats que els de Trolox.

3.2.5. Correlacions entre TPC i activitats antioxidants

Com es mostra a la figura 3B, hi va haver una correlació molt significativa entre els TPC i l'activitat d'eliminació de radicals lliures de DPPH a GAE d'1,75 ± 0,438 a 100,41 ± 1,581 mg/g . Els coeficients de correlació de TPC amb l'activitat d'eliminació de radicals lliures de DPPH, l'activitat FIC, el poder reductor i el TEAC eren 0, 980, 0, 925, 0, 967 i 0, 902, respectivament (figura 3B). En conjunt, aquestes dades demostren que elantioxidantLes activitats dels hidrosols de COK estan estretament correlacionades amb els continguts de fenols.

3.3. Efecte de la concentració d'hidrosols de COK sobre l'activitat de la tirosinasa

Hem determinat els efectes de la concentració d'hidrosol de COK sobre l'oxidació de L-tirosina i L-DOPA per boletstirosinasai va fer comparacions amb l'activitat de l'àcid cògic, que és un inhibidor de la tirosinasa conegut (figura 3C, D). El present hidrosol va inhibir potentment i depenent de la dosi les activitats de L-tirosina i L-DOPA oxidasa de la tirosinasa de bolets (figura 3C), però tenia una activitat inhibidora de tirosinasa més alta en presència de substrat de L-tirosina (activitat monofenolasa) que la L-DOPA (activitat de difenolasa). Els valors IC5{{10}} de l'àcid cògic contra les activitats de la monofenolasa i la difenolasa eren 4.0 × 1{0-5 i 7,8 × 10−3 mg/mL (figura 3C), respectivament, significativament més que els de l'hidrosol actual (7,96 × 10−4 mg/mL i 0,35 mg/mL, respectivament; Figura 3D). Per tant, per aconseguir un 90 per cent d'activitat inhibidora de la tirosinasa (activitat monofenolasa), es van requerir hidrosol i àcid cògic a 0,52 mg/ml i 4,0 × 10−3 mg/ml, respectivament, quan es va utilitzar L-tirosina com a substrat (Figura 3C, D). ). Tot i que els efectes inhibidors de la tirosinasa requereixen concentracions més elevades d'àcid kògic hidrosol COK, una potent activitat inhibidora de la tirosinasa va ser evident en aquests experiments.

Diversostirosinasapreparacions, mètodes d'assaig d'activitat i pureses i components d'inhibidors podrien haver contribuït a les diferències en la cinètica inhibidora d'enzims [29]. No obstant això, les activitats biològiques dels extractes vegetals estan contribuïdes pels seus components bioactius, que poden veure's afectats per l'espècie vegetal, l'època de collita, l'estació, l'origen geogràfic, les pràctiques agronòmiques i els mètodes d'extracció. Els inhibidors s'han identificat i caracteritzat a partir de fonts naturals en molts estudis recents, i les relacions entre activitats inhibidores i ingredients naturals estan ben establertes (taula 1). En particular, molts aldehids i altres compostos s'han aïllat i caracteritzat com a inhibidors de la tirosinasa. Aquests inclouen cinamaldehid, 2-hidroxi-4-metoxi benzaldehid, anisaldehid, cuminaldehid, àcid còmic, flavonols, flavones i isoflavanes [4,19,30–37). L'hidrosol actual comprenia un 87,7 per cent de cinamaldehid i un 7,0 per cent de benzaldehid, cosa que suggereix que el cinamaldehid, seguit del benzaldehid, és la principal substància responsable de l'activitat inhibidora de la tirosinasa de l'hidrosol. D'acord amb la taula 1, hem trobat que l'hidrosol amb presència de benzaldehid és més potent. thanpure cinamaldehid, i millora latirosinasaactivitat inhibidora de l'hidrosol. També es va confirmar que els benzaldehids inhibeixen tant l'activitat de la difenolasa com l'activitat de la monofenolasa de la tirosinasa de bolets [38]. El mecanisme inhibidor de la tirosinasa dels inhibidors de tipus benzaldehid prové de la seva capacitat per formar una base de Schiff amb un grup amino primari a l'enzim [33,39]. L'addició d'un grup donador d'electrons a la posició para del benzaldehid augmenta l'activitat inhibidora de la tirosinasa, probablement estabilitzant la base de Schiff.

3.4. Modes cinètics d'inhibició de la tirosinasa dels bolets per hidrosol COK

Es van estudiar els comportaments cinètics de l'hidrosol, sobre la monofenolasa i l'activitat de la difenolasa de la tirosina utilitzant L-tirosina i L-DOPA com a substrat, respectivament. EltirosinasaLa cinètica inhibitòria de l'hidrosol es va analitzar mitjançant gràfics dobles recíprocs de Lineweaver-Burk, tal com es mostra a la figura 4. A la figura 4A, B, les quatre línies representen l'enzim desinhibit (línia 1) i la inhibició per tres concentracions (línia 2 - línia 4) d'hidrosol, i aquestes línies es tallen a l'esquerra de l'eix 1/v per sobre de l'eix 1/S. En condicions experimentals no inhibides, la velocitat màxima (Vmax) de la reacció d'oxidació de L-tirosina i L-DOPA catalitzada per la tirosinasa va ser de {{10}},055 ∆OD475/min i 0,096 ∆OD475/min sense contenir hidrosol (línia 1 a la figura 4A, B), respectivament. Els paràmetres cinètics Km (constante de Michael) per a boletstirosinasaobtingut a partir d'un Lineweaver-Burk que utilitzava L-tirosina i L-DOPA com a substrats, respectivament, mostren que Km era de 0,534 mg/mL i0.511 mg/mL sense contenir hidrosol (Línia 1 a la figura 4A, B).

Les quatre línies, obtingudes a partir de l'enzim desinhibit i de tres concentracions diferents d'hidrosol, es van tallar a l'esquerra de l'eix 1/v per sobre de l'eix 1/S. L'augment de les concentracions d'hidrosol va donar lloc a una disminució de Vmax i un augment de Km. Concretament, quan es va utilitzar L-tirosina com a substrat, les concentracions creixents d'hidrosol van donar lloc a múltiples línies amb diversos pendents i interceptes, però aquestes es van tallar entre elles al segon quadrant (línia 1-4 a la figura 4A). Es van obtenir resultats similars quan es va utilitzar L-DOPA com a substrat (línia 1-4 a la figura 4B), donant suport a l'afirmació que l'hidrosol porta inhibidors de la tirosinasa de tipus mixt. D'acord amb la inhibició de tipus mixt, és probable que els components d'hidrosol s'uneixin a l'enzim lliure i al complex enzim-substrat. Les inhibicions de tipus mixt poden sorgir de moltes maneres: la inhibició de l'hidrosol podria sorgir perquè interaccionen amb un intermedi posterior en el patró de reacció, però no amb un complex inicial enzim-substrat [40]. Així, vam determinar constants de dissociació (Ki i Ki, respectivament) per a l'inhibidor que s'uneix a l'enzim lliure (E) i al complex enzim-substrat utilitzant gràfics recíprocs dobles i gràfics de pendent i interceptació vertical versus les concentracions d'hidrosol en presència de L-tirosina (Figura 4C, D) o L- DOPA com a substrats (figura 4E, F). Tal com es mostra a la figura 4A, B, el valor de Ki quan es va utilitzar L-tirosina com a substrat era aproximadament 1,28 vegades inferior al que hi havia en presència de L-DOPA, cosa que indica una unió d'enzims inhibidors més eficaç amb L-tirosina que amb L-DOPA. A més, el valor de Ki va ser 1,71 vegades més gran que el valor de Ki per a l'oxidació de L-DOPA, cosa que indica que l'afinitat dels components de l'hidrosol per l'enzim lliure és més forta que la del complex enzim-substrat. Aquestes dades suggereixen que l'hidrosol afecta l'afinitat de l'enzim lliure. l'enzim de L-DOPA però no s'uneix al lloc actiu. A més, el valor de Ki era gairebé el mateix que Ki per a l'oxidació de L-tirosina, cosa que indica que els inhibidors mixts són els inhibidors no competitius, que s'uneixen a un enzim lliure i un complex enzim-substrat amb la mateixa constant d'equilibri utilitzant L- tirosina com a substrat (figura 4A). Tanmateix, les constants d'unió d'equilibri per a l'enzim lliure i el complex enzim-substrat, respectivament, són diferents utilitzant L-DOPA com a substrat (figura 4B), cosa que indica que l'inhibidor de tipus mixt (competitiu i no competitiu mixt) es pot unir no només amb un enzim lliure, però també amb el complex enzim-substrat utilitzant L-DOPA com a substrat. Estudis anteriors també van revelar que l'oli essencial de C. cassia i el cinnamaldehid són inhibidors de tipus mixt [19]. En canvi, el trans-cinamaldehid aïllat de l'escorça de C. cassia va indicar una inhibició competitiva per a l'oxidació de L-DOPA per bolets.tirosinasa[32], mentre que el cinamaldehid aïllat de l'arrel de P. cernua era una inhibició no competitiva [35].

3.5. Efectes dependents de la concentració de les concentracions d'hidrosols sobre la melanogènesi

Per analitzar els efectes de l'hidrosol sobre la viabilitat cel·lular i la melanogènesi a diferents concentracions ({{{0}},0035–10,64 mg/mL), vam induir la melanogènesi en cèl·lules de melanoma B{{16-F10 mitjançant -MSH i vam comparar els efectes utilitzant l'àcid cògic com a control positiu (figura 5). El resultat d'aquest assaig de viabilitat cel·lular va indicar que l'hidrosol no tenia citotoxicitat a concentracions de 0, 0035-1, 064 mg / ml a les cèl·lules de melanoma B16F10 (figura 5a). A mesura que s'estan desenvolupant inhibidors de la melanogènesi, la seguretat i l'eficàcia haurien de ser la consideració més important per a moltes aplicacions. Tanmateix, el tractament de cèl·lules de melanoma B16F10 amb hidrosol va donar lloc a una reducció marcada de la viabilitat cel·lular a concentracions de 5, 32 a 10, 64 mg/ml. Segons els resultats dels estudis de cribratge de seguretat i eficàcia deblanqueig de la pellproductes en cultius cel·lulars B16F10, 1,064 mg/ml és una concentració llindar per al cribratge primari basat en cèl·lules. Per tant, es van utilitzar concentracions de 0,1064–1,064 mg/ml per examinar els mecanismes de l'antitirosinasa a les cèl·lules de melanoma B16F10 mitjançant hidrosol.

La repressió de la melanogènesi mitjançant tractaments amb hidrosol a diverses concentracions es va determinar com a percentatges de contingut de melanina a les cèl·lules (figura 5b). També vam analitzar els nivells d'expressió MITF mitjançant Western blotting (figura 5c). En aquests experiments, el contingut de melanina i els nivells d'expressió de MITF es van suprimir depenent de la dosi per l'hidrosol de COK, cosa que suggereix que l'hidrosol de COK disminueix el contingut de melanina a les cèl·lules reprimint la síntesi de MITF.

3.6. Assajos de protecció de l'ADN

Les espècies reactives d'oxigen són ben conegudes per danyar l'ADN i causar envelliment cel·lular i càncer. Els assajos de DNAnicking ofereixen un còmode sistema de model lliure de cèl·lules per determinar amb sensibilitat la producció de radicals perjudicials per a l'ADN [41]. En aquests experiments, les reaccions de Fenton van produir radicals hidroxil que tallen l'ADN plasmidi superenrotllat i el converteixen en la forma de tall d'ADN, que ha disminuït la mobilitat delectroforètica. [42,43]. Així, per avaluar les activitats protectores de l'ADN de l'hidrosol, hem incubat pCI neo DNA amb els reactius de Fenton [44]. Com es mostra a la figura 6, les formes de plasmidi superenrotllades i tallades es distingeixen clarament per les seves taxes de mobilitat electroforètica relatives al gel d'agarosa; L'ADN supercoiled es va moure més ràpid i l'ADN tallat el més lent, respectivament. Després dels tractaments amb hidrosol, el dany a l'ADN es va reduir lleugerament a concentracions d'hidrosol d'1,33-5,32 mg/ml, amb una protecció del 28-58% de la forma superenrotllada, respectivament (carrils 6-8). A concentracions d'hidrosol de 0,3325–0,665 mg/ml, no es va observar cap protecció en relació amb el control negatiu (carrils 4 i 5). En canvi, la quercetina va protegir eficaçment l'ADN plasmidi dels radicals hidroxil. fragmentació mediada, com es va mostrar anteriorment [45]. Aquestes són les primeres dades que mostren els efectes protectors dels extractes d'hidrosol de C. osmophloeum deixa Kanehira en danys a l'ADN per reaccions de Fenton. Aquests efectes es deuen probablement a la presència de compostos polifenols.

4. Conclusions

El COK s'ha utilitzat durant molt de temps com a planta medicinal a Taiwan. No obstant això, que sabem, aquest és el primer informe que demostra que els hidrosols que es preparen per destil·lació de vapor a partir de fulles de COK tenen activitats antioxidants, tal com s'observa en assajos deantioxidantactivitat i danys a l'ADN. També vam demostrar que aquest hidrosol reprimeix la melanogènesi. En les anàlisis GC/MS, es va trobar que els principals compostos de l'hidrosol COK eren cinamaldehid i benzaldehid, i aquests agents eren potentment inhibidors de les activitats monofenolasa i difenolasa de la tirosinasa. En les nostres avaluacions de la cinètica d'inhibició de la tirosinasa, l'hidrosol COK va mostrar una inhibició de tipus mixt depenent de la dosi de les activitats de L-tirosina i L-DOPA oxidasa.tirosinasa. Els compostos d'hidrosol actuals també van suprimir l'expressió de proteïnes MITF, donant lloc a una reducció de la síntesi de melanina induïda per -MSH.

Finalment, la seguretat és una consideració important per als inhibidors de la tirosinasa, especialment per als productes incosmètics i alimentaris utilitzats, que es poden utilitzar en quantitats regulades. COK ja és un additiu natural comestible i molt utilitzat per a aliments i cosmètics. A més, el cinamaldehid generalment es reconeix com a segur per al consum humà. L'hidrosol de COK és un excel·lent biomaterial natural, efectiu i segurtirosinasai l'activitat inhibidora de la síntesi de melanina i el potencial de protegir contra el dany de l'ADN. Per tant, creiem que l'hidrosol COK es podria utilitzar com a agent de pigmentació segur i eficaç per a moltes aplicacions.