Una nova mutació homozigota KLHL3 com a causa del seudohipoaldosteronisme autosòmic recessiu tipus II diagnosticada tard en la vida
Nov 02, 2023
Resum Introducció:
El seudohipoaldosteronisme tipus II (PHA II) és un trastorn mendelià, que presenta acidosi hiperkalèmica i nivells baixos de renina plasmàtica, normalment associats a hipertensió. Les mutacions en WNK1, WNK4, CUL3 i KLHL3 causen PHA II, amb mutacions dominants en WNK1, WNK4 i CUL3 i mutacions dominants o recessives en KLHL3. S'han informat catorze famílies amb mutacions recessives de KLHL3, amb diagnòstic a l'edat de 3 mesos a 56 anys, normalment en individus amb funció renal normal.
Mètodes: vam realitzar investigacions clíniques i genètiques en un pacient amb hipertensió hiperkalèmica i vam utilitzar simulacions de dinàmica molecular, expressió heteròloga a cèl·lules COS7 i Western blotting per investigar l'efecte d'una mutació de la malaltia candidata a KLHL3 sobre l'expressió de la proteïna WNK4.
FEU CLIC AQUÍ PER OBTENIR LA FORMULACIÓ A HERBES DE CISTANCHE PER AL RONÓN
Resultats: la pacient, una dona de 58-anys d'una família consanguínia, presentava hipertensió, acidosi hiperkalèmica persistent associada a dolor muscular sever, nefrolitiasi, malaltia renal crònica (ERC) i malaltia coronària. La teràpia amb hidroclorotiazida va corregir la hiperpotasèmia, la hipertensió i el dolor muscular. L'anàlisi genètica va revelar una mutació homozigota p.Arg431Trp en una posició KLHL3 altament conservada. Les simulacions van suggerir una estabilitat reduïda de la proteïna mutant, que va ser confirmada per Western blot. En comparació amb KLHL3 de tipus salvatge, la cotransfecció de p.Arg- 431Trp KLHL3 va provocar un augment dels nivells de proteïna WNK4, que es dedueix que provoca una reabsorció de NaCl augmentada mitjançant el portador sensible a la tiazida i PHA II.
Conclusions: Fins i tot en pacients que es presenten al final de la vida i en presència d'ERC, s'ha de sospitar PHA II si els nivells de renina són baixos i l'acidosi hiperkalèmica i la hipertensió són inadequades per a l'etapa d'ERC, especialment en presència d'antecedents familiars sospitosos.
Introducció
La hipertensió arterial sistèmica afecta més d'1.100 milions d'adults a tot el món [1] i es considera el factor de risc modificable més important per a totes les causes de morbiditat i mortalitat a tot el món [2]. Aproximadament el 90% dels pacients adults tenen l'anomenada hipertensió primària o essencial amb etiologia genètica-ambient multifactorial [2], mentre que es pot identificar una causa subjacent de la hipertensió a la resta. Les causes habituals d'hipertensió secundària són l'aldosteronisme primari, l'apnea obstructiva del son, la malaltia renal parenquimatosa i l'estenosi de l'artèria renal [3]. En casos rars, la hipertensió s'hereta com un tret monogènic. Els pacients afectats solen presentar nivells baixos de renina plasmàtica, mentre que els nivells d'aldosterona i electròlits varien en funció de l'etiologia subjacent [4]. Les formes mendelianes d'hipertensió sovint es manifesten en la infància o la joventut. Els adults poques vegades són investigats per hipertensió monogènica; així, la seva prevalença a la població general segueix sent desconeguda. En una cohort seleccionada (criteris d'inclusió almenys un de: edat d'inici Menor o igual a 35 anys, hipertensió resistent, hipertensió amb anomalies electròlits, anomalies hormonals, resultats d'imatge anormals o signes clínics suggeridors), es van examinar 37 gens candidats, i es van identificar variants patògenes o probables patògenes en 33 de 1.179 casos (2,8%) [5].
Aquest estudi se centra en el pseudohipoaldosteronisme tipus II (PHA II), una forma d'hipertensió mendeliana que presenta acidosi hiperkalèmica i nivells baixos de renina plasmàtica [6]. La PHA II també es coneix com a hipertensió hiperkalèmica familiar. Va ser descrit per primera vegada l'any 1964 per Paver i Pauline en un home jove amb hipertensió severa i hiperpotasèmia malgrat una funció renal normal [7], que va ser caracteritzat per Stokes i col·legues [8] i Arnold i Healy [9] i va demostrar que tenia un nivell baix. renina plasmàtica. Després de l'informe d'una nena de 10-anys amb estatura baixa, hipertensió, hiperpotasèmia severa, acidèmia lleu, paràlisi periòdica i renina suprimida l'any 1970 per Gordon et al. [10], la síndrome també s'ha conegut ocasionalment com a síndrome de Gordon.
L'any 2001, es van identificar mutacions en els gens de la serina-treonina cinasa WNK1 i WNK4 sense lisina (WNK) com a causes de PHA II [11], i altres mutacions en KLHL3 (que codifica kelch-like 3) i CUL3 (codificació). cullin 3) es van descriure el 2012 [12, 13]. Les subformes PHA II causades per mutacions en WNK1, WNK4 i CUL3 són trastorns autosòmics dominants, mentre que les mutacions KLHL3 es poden heretar de manera autosòmica dominant o autosòmica recessiva [12]. KLHL3 inclou un domini BTB N-terminal, seguit d'un domini BACK i una estructura d'hèlix de sis pales C-terminal que consisteix en les anomenades repeticions semblants a kelch (mostrades a la figura 1d, 2a). Les mutacions dominants de KLHL3 s'agrupen dins o entre les pales de l'hèlix, mentre que les mutacions recessives es distribueixen per tota la proteïna [12]. Els casos recessius són menys freqüents que els casos dominants; en total, s'han publicat 21 pacients de 14 famílies amb mutacions recessives de KLHL3 [12–15] (taula 1).
La fisiopatologia subjacent de la hipertensió en PHA II és l'augment de la reabsorció de NaCl mitjançant el transportador sensible a tiazides (cotransportador de Na-Cl, NCCT) al túbul contornejat distal del ronyó, i la teràpia amb tiazides corregeix tant la hipertensió com les anomalies dels electròlits en pacients amb PHA II. [16]. En resum, WNK1 i WNK4 fosforilen OSR1 (gen 1 sensible a l'estrès oxidatiu) i SPAK (cinasa rica en prolina-alanina relacionada amb Ste20-), que després fosforilen i activen NCCT [17, 18]. KLHL3 és un adaptador de substrat de la ubiquitina lligasa CUL3; el complex KLHL3-CUL3 ubiquitinila les quinases WNK i, per tant, afavoreix la seva degradació [19]. La pèrdua de la funció de la ubiquitina lligasa o la unió deteriorada a les cinases WNK provoca un augment de l'abundància de WNK, un augment de la fosforilació de NCCT [18] i una major absorció de NaCl al túbul contornejat distal. En els segments posteriors de la nefrona, es redueix la reabsorció de NaCl mitjançant ENaC (canal epitelial de sodi) i la secreció de K + mitjançant ROMK (canal de potassi medul·lar extern renal) [20, 21]. Els ratolins knockout KLHL3 mostren hipoplàsia del túbul contornejat distal, augment dels nivells de WNK1 i WNK4 i un augment de la fosforilació OSR1, SPAK i NCC al ronyó. A més, presenten hiperpotasèmia, hiperclorèmia i acidosi metabòlica [22]. Aquí, informem d'un pacient amb PHA II autosòmic recessiu i caracteritzem la mutació genètica i la fisiopatologia subjacents.
Materials i mètodes
Preparació de l'ADN i seqüenciació de Sanger L'ADN es va preparar a partir d'una mostra de sang venosa perifèrica mitjançant el kit QIAamp DNA Blood Maxi (Qiagen) segons les instruccions del fabricant. La PCR estàndard i la seqüenciació bidireccional directa de Sanger de l'ADN genòmic es van realitzar mitjançant primers publicats per a KLHL3 [13], WNK1 i WNK4 [11] i el CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAAACCG-3′) i cebadors CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) per a CUL3. La seqüenciació de Sanger es va realitzar a Eurofins Genomics.
Alineació de seqüències
Les seqüències de proteïnes homòlogues es van identificar mitjançant NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) i la base de dades eggNOG (http://eggnogdb.embl.de). Les seqüències mostrades inclouen KLHL3 humà i els seus ortòlegs: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP{_001349344.2), Gallus gallus (XP{_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP{_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP{{_724095.1) i Caenorhabditis elegans (NP{{_001254310.1) . Els paràlegs humans es van identificar mitjançant la investigació bibliogràfica i inclouen KLHL1 a KLHL42, tal com es mostra a la taula suplementària en línia 1 (per a tot el material de subministrament en línia, vegeu www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. Les seqüències es van alinear mitjançant la versió 2.10.5 de Jalview [24]. L'estructura del domini era d'UniProt (Q9UH77, accedit el 13 d'abril de 2021) i es va visualitzar mitjançant DOG [25].
Plàsmids i mutagènesi dirigida al lloc
Els plasmidis pTRE2hyg WNK4 i pFN21A KLHL3 van ser regals amables del Dr. Shinichi Uchida (Universitat Mèdica i Dental de Tòquio). Per introduir la mutació p.R431W, es van dissenyar primers utilitzant Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) i 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). Els residus mutants es mostren en negreta. La mutagènesi dirigida al lloc es va realitzar mitjançant el kit de mutagènesi dirigida al lloc QuikChange amb una DNA polimerasa d'alta fidelitat PfuUltra (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) segons les instruccions del fabricant. L'ADNc va ser seqüenciat per Sanger a Eurofins Genomics. Els plasmidis es van preparar mitjançant el QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit.
Cultiu de teixits, transfecció transitòria i Western blot
Les cèl·lules COS7 es van cultivar en DMEM + L-glutamina, 10% FBS i 1% penicil·lina/estreptomicina (totes Gibco, Thermo Fisher). Per a les transfeccions, les cèl·lules es van sembrar en plaques de 6-pous a una densitat d'1, 9 × 105 cèl·lules/pou i es van fer créixer fins a aproximadament un 90% de densitat. Les cèl·lules es van transfectar amb 1 µg de pTRE2hyg WNK4 i 2 µg de pFN21A (vector buit o tipus salvatge KLHL3 [WT]) o ADNc KLHL3 R431W mitjançant Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) segons les instruccions del fabricant. Es van utilitzar dos clons independents cadascun per a la transfecció. Quaranta-vuit hores després de la transfecció, les cèl·lules es van rentar en PBS fred i es van lisar en Tris-HCl 10 mM (pH 7, 5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM i 1% NP40 que contenia còctel inhibidor de proteasa complet (Roche, Merck). El lisat es va centrifugar a 20,000 g durant 30 min a 4 graus, i el sobrenedant es va emmagatzemar a -20 graus. Les concentracions de proteïnes es van determinar per duplicats (estàndard) o triplicats (mostres) mitjançant l'assaig BCA (Pierce, Thermo Fisher) segons les instruccions del fabricant. Uns 20 µg de proteïna total es van fraccionar mitjançant SDSPAGE i es van transferir a una membrana de PVDF (1,5 h, 100 V). Les membranes es van bloquejar en llet seca al 2% en TBST. Western blot es va realitzar mitjançant un anti-HaloTag de conill policlonal (Promega #G9281, 1:500, 4 graus durant la nit), seguit de rentat i incubació amb IgG d'ase anti-IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46). }}, dianova, 1:20,000, 1 h a temperatura ambient), rentat i detecció quimioluminiscent millorada (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare). Les taques es van eliminar amb ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth), es van bloquejar en llet seca al 2% en TBST durant la nit a 4 graus i es van incubar amb ratolí monoclonal anti-FLAG M2 (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{69} }, 1,5 h a temperatura ambient), seguit de IgG anti-ratolí d'ase (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 h a l'habitació temperatura), detecció, eliminació i bloqueig d'ECL com s'ha indicat anteriorment. A continuació, es van incubar les taques amb anti- -actina monoclonal de ratolí (Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5.000, 1 h a temperatura ambient) i IgG anti-ratolí d'ase, seguida de nou de la detecció d'ECL. Les bandes es van quantificar mitjançant el programari Image Lab en un ChemiDoc XRS + (Bio-Rad). Les intensitats de les bandes detectades per l'anticòs anti-HaloTag i l'anticòs anti-FLAG M2, respectivament, es van dividir per les intensitats corresponents de les bandes detectades per anticossos anti- - actina. Per avaluar els nivells d'expressió de KLHL3, les cèl·lules es van transfectar com anteriorment, però utilitzant 0 µg, 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg i 8 µg de pFN21A KLHL3 WT o R431W. L'electroforesi i el blotting en gel es van realitzar com anteriorment. Per a l'assaig de persecució de cicloheximida, les cèl·lules es van sembrar com anteriorment i es van transfectar com anteriorment, però amb 2 µg de pFN21A KLHL3 WT o 4 µg de KLHL3 R431W. Quaranta-vuit hores després de la transfecció, es van afegir 100 µM de cicloheximida i les cèl·lules es van lisar després dels punts de temps indicats. Els passos posteriors d'anàlisi van ser els anteriors.
Fig. 2. Simulacions MD dels dominis Kelch WT i p.Arg431Trp (R431W) KLHL3. una vista de dalt a baix del domini Kelch (PDBID: 4CH9), acolorida per les pales de l'hèlix (K1–K6). El lloc de la mutació està indicat per una estrella groga i la regió d'interès és de color gris (residus 425-465) i el pèptid WNK4 (no inclòs a les simulacions) és transparent i de color gris. b Diferència en els MSF del domini Kelch mapejats a la columna vertebral de la proteïna. El lloc de la mutació està indicat per una estrella groga. El color vermell indica parts més dinàmiques (menys estables) de la proteïna. c RMSD de tota la proteïna (superior), residus 425-465 (mig) i la butxaca d'unió WNK4-(inferior) de l'estructura cristal·lina per a tres rèpliques de simulació independents (línies en negreta, mitjanes corrents). d Gràfiques de violí de hbonds (esquerra) i distància COM (mitjana) entre K3 (residus 425–441) i K4 (442–465) -àles de l'hèlix i electrostàtica de butxaca d'unió (dreta). e Superposició estructural de la interfície K3-K4 del fotograma final (1,1 μs) de cada rèplica (WT, blau; R431W, gris) amb els models experimentals/inicials (negre). La columna vertebral de la proteïna es mostra com a dibuixos animats, amb el residu 431 mostrat com a pals. MSF, fluctuació quadrada mitjana.
Simulació de Dinàmica Molecular
El model WT es basava en l'estructura de cristall de raigs X (PDBID: 4CH9) del domini Kelch humà en complex amb el fragment pèptid WNK4 [26]. Els àtoms i tapes terminals que falten es van afegir mitjançant la utilitat psfgen a la versió 1.9.3 de la dinàmica molecular visual [27]. El model KLHL3 mutant (R431W) es va generar mitjançant la versió 9.18 de Modeller [28]. L'interval final de residus per a cada sistema era de 300-585. Els terminals N i C dels models WT i R431W es van neutralitzar mitjançant acetilació i N-metilamidació, respectivament. Els estats de protonació per defecte es van assignar a cada residu titulable segons l'anàlisi amb PROPKA versió 3.0 [29]. El pèptid WNK4 es va eliminar de les simulacions de producció a causa de la dissociació de KLHL3 després de les simulacions d'equilibri inicial.
Totes les simulacions es van realitzar mitjançant el paquet de programari GROMACS versió 2021 [30]. Els paràmetres de camp de força CHARMM36m es van utilitzar per als àtoms de proteïnes [31]. Els ions es van descriure mitjançant els paràmetres CHARMM predeterminats i es va utilitzar el model TIP3P per a les aigües [32]. Es va utilitzar un pas de temps d'integració d'1 fs per al pas d'equilibri inicial, amb 2 fs per a totes les simulacions posteriors. Tots els enllaços que implicaven hidrogen es van limitar mitjançant LINCS [33]. Les interaccions de Van der Waals no enllaçades es van calcular utilitzant el potencial de Lennard-Jones amb un radi de tall d'1,2 nm; les forces es van apagar sense problemes en el rang d'1,2-1,0 nm. Totes les electrostàtiques es van calcular mitjançant el mètode Ewald [34] de malla de partícules suavitzades amb una distància de tall a l'espai real d'1, 2 nm. Després d'una simulació inicial en el conjunt isocòric-isotèrmic (NVT), totes les simulacions posteriors es van realitzar al conjunt isobàric-isotèrmic (NPT) a una temperatura de 310, 15 K mitjançant el termòstat de reescala de velocitat [35] amb una constant de temps de 0, 5 ps. El termòstat es va aplicar per separat a la proteïna i al dissolvent (és a dir, aigua i ions); es van utilitzar els mateixos grups per a l'eliminació del moviment del centre de massa (COM). Es va imposar una pressió d'1 bar utilitzant un baròstat Berendsen [36] o Parrinello-Rahman [37] de manera isotròpica amb una constant de temps de 5 ps.
Els models WT i R431W es van solvatar en una caixa cúbica amb unes dimensions inicials d'1,2 × 1,2 × 1,2 nm3. Cada sistema es va neutralitzar amb 150 mM de NaCl. Després d'una minimització inicial d'energia de descens més pronunciat, cada sistema es va equilibrar al conjunt NVT durant 5 ns amb restriccions de posició a tots els àtoms de proteïnes. Es va realitzar un pas d'equilibri posterior al conjunt NPT durant 5 ns amb les mateixes restriccions que al pas anterior. Les restriccions de posició es van eliminar de totes les cadenes laterals per a la simulació final d'equilibri 5-ns. Es van generar tres estructures inicials a partir de l'etapa final d'equilibri per a simulacions de producció independents dels sistemes WT i R431W amb totes les restriccions de posició eliminades. Cada rèplica de producció es va simular durant 1,1 µs; els primers 0,1 µs es van eliminar de l'anàlisi.
Per avaluar l'estabilitat estructural al llarg de les simulacions, es van calcular les desviacions quadrades mitjanes de l'arrel (RMSD) de l'estructura cristal·lina per als àtoms de C de tota la proteïna, així com la interfície K3-K4 (residus 425-465) i la WNK4- butxaca d'enquadernació (residus 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 i 577). Es van calcular les mitjanes corrents de les traces RMSD i es van superposar amb les dades en brut.
L'efecte de la mutació sobre l'estabilitat estructural es va visualitzar calculant la diferència en les fluctuacions quadrades mitjanes dels àtoms de la proteïna C, promediades sobre fotogrames i rèpliques i mapejant l'estructura de la proteïna WT. Totes les visualitzacions de proteïnes es van generar mitjançant ChimeraX [38]. L'efecte de la mutació R431W a la interfície K3 (residus 425-441) a K4 (ressidus 442-465) es va caracteritzar per l'anàlisi d'enllaç d'hidrogen (enllaç H) i la distància COM entre els dos grups. Els enllaços H es van avaluar a cada fotograma mitjançant l'eina GROMACS gmx hbond, amb talls de distància i angle de 3, 5 Å i 30 graus, respectivament. Les distàncies COM es van avaluar de manera similar a cada fotograma: les distribucions tant de les distàncies Hbonds com de COM es van visualitzar com a trames de violí. Les mitjanes es van calcular sobre trajectòries i rèpliques.
L'electrostàtica de la butxaca d'enllaç WNK4-es va calcular mitjançant g_elpot [39]. El curs temporal del potencial electrostàtic a la butxaca d'unió es va avaluar definint un volum esfèric amb un radi de 8 Å, centrat al centre geomètric dels residus que comprenen la butxaca d'unió. Per avaluar la variància de l'electrostàtica, es van calcular mitjanes de blocs de 50-ns. La distribució del potencial electrostàtic dins de la butxaca d'unió per al mutant WT i R431W es va visualitzar com a trames de violí, amb mitjanes calculades en blocs i trajectòries 50-ns.
Servei de suport de Wecistanche: el major exportador de cistanche a la Xina:
Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel:+86 15292862950}
Compreu per obtenir més detalls de les especificacions:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
