Una nova preparació d'albúmina sèrica humana S-sulfhidratada suprimeix la síntesi de melanina

Contacte:jaslyn.ji@wecistanche.com

L'albúmina sèrica humana (HSA) és la proteïna més abundant en sèrum i s'utilitza àmpliament com a portador de fàrmacs per la seva biocompatibilitat i les seves propietats de retenció de plasma llarga [14,15]. L'HSA conté un total de 35 residus Cys i un d'ells, Cys34, està present en forma de grup tiol lliure [16]. De vegades, Cys34 és un objectiu per a un lloc d'unió de fàrmacs, a causa del seu grup tiol reactiu [17, 18]. Per exemple, en presència d'òxid nítric (NO), el grup tiol Cys34 està S-nitrosat. Prèviament vam demostrar que la HSA S-nitrosada (SNO-HSA) permet que el NO es mantingui durant llargs períodes en sèrum [19]. SNO-HSA té diverses funcions biològiques, inclòs un efecte protector del fetge contra la isquèmia/reperfusió [20] i efectes suprimidors del tumor [21].

En conseqüència, vam plantejar la hipòtesi que l'HSA es podria utilitzar com a portador RSS (com SNO-HSA) mitjançant la S-sulfhidratació de Cys34-SH. Com a font de polisulfur, DATS i DMTS estan limitats a causa de la seva lipofilia i volatilitat. Per tant, en aquest estudi es va utilitzar Na2Sn disponible comercialment (Na2S, Na2S2, Na2S3 i Na2S4). Ogasawara et al. L'albúmina sèrica lligada al sofre preparada prèviament va reaccionar amb sulfur de sodi (NaHS) mitjançant una simple barreja dels reactius [22]. El sofre de NaHS es va afegir a Cys34 i la preparació resultant va protegir el dany hepàtic causat pel peròxid de lípids. Hem adoptat aquest mètode per preparar l'HSA afegit amb RSS mitjançant Na2Sn per al lliurament de RSS.

En aquest treball, vam informar de la preparació de HSA tractat amb Na2Sn i el seu ús com a nou sistema de lliurament de RSS. El sofre afegit es va analitzar mitjançant una sonda de sulfà sofre [23] i l'eliminació de sulfur del polisulfur [24]. Per avaluar l'efecte de l'HSA tractat amb Na2Sn sobre el blanqueig de la pell, es va estudiar l'efecte de l'HSA tractat amb Na2Sn sobre la síntesi de melanina mitjançant una línia cel·lular de melanoma B16.

2. Material i mètodes

2.1. Materials

L'albúmina sèrica humana (HSA) es va comprar a KAKETSUKEN (Kumamoto, Japó) i totes les mostres de HSA es van desgreixar mitjançant un tractament amb carbó vegetal. El sulfur de sodi i el tetrasulfur de sodi es van comprar al Laboratori DOJINDO (Kumamoto, Japó). La sonda 4 de sofre de sulfan (SSP4) es va preparar tal com es va descriure anteriorment [23]. L-DOPA, glutatió (DTNB), àcid ascòrbic i reactiu de Griess satíric sòdic (sulfanilamida, naftiletilendiamina-HCl) es van comprar a Nakarai Chemicals (Kyoto, Japó). La columna de dessalació Sephadex G-25 (φ 1,6 × 2,5 cm) es va comprar a GE Healthcare (Kyoto, Japó). El medi Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) i el 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) es van obtenir de Wako Pure Chemical (Osaka, Japó). La tirosinasa de bolets es va comprar a Sigma-Aldrich. Tots els altres productes químics eren de la millor qualitat disponible comercialment, i totes les solucions es van preparar en aigua desionitzada i destil·lada.

extracte de cistanche

2.2. Assaig de proteïnes BCA

Les concentracions de proteïnes es van mesurar mitjançant un assaig de proteïnes BCA. Es van incubar alíquotes de 10 μL de mostres i estàndards d'albúmina sèrica bovina (BSA) en 100 μL de tampó de reacció a 25 graus durant 30 min. Després de la reacció, es va utilitzar un lector de microplaques per mesurar l'absorbància de 540 nm. Es va utilitzar BSA per construir una corba estàndard.

2.3. Síntesi de Na2Sn tractat-HSA

L'HSA (300 μM) es va incubar amb 1 mM de polisulfurs de sodi (Na2Sn) en PBS (pH 7,4) durant 1 h a 37 graus. Després de la reacció, es van eliminar l'excés de polisulfurs de sodi mitjançant filtració en gel amb una columna Sephadex G-25.

2.4. Determinació de la taxa d'unió del sofre mitjançant el mètode d'eliminació del sulfur del polisulfur (EMSP)

L'EMSP es va preparar tal com es va descriure anteriorment (3 × EMSP mitjançant l'addició de 792 mg d'àcid L-ascòrbic a 5 ml de 3 N de NaOH) [24]. Les mostres (7,5 μM, 133 μL) es van incubar amb 66,7 μL de 3 × EMSP durant 3 h a 37 graus. A continuació, es va afegir una solució d'acetat de zinc a l'1 per cent (600 μL) a la solució de reacció, seguida de vortex immediatament. Les mostres es van centrifugar a 8,000xg durant 5 min i es van rentar amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) dues vegades. Després d'eliminar els sobrenedants, es va afegir aigua desionitzada i destil·lada (200 μL) als precipitats. Després d'afegir 1 per cent d'acetat de zinc (300 μL), 50 μL de N,N-dimetil-p-fenilendiamina 20 mM i FeCl3 20 mM en HCl 7,2 N, la solució es va incubar durant 30 min a 25 graus. Les mostres es van centrifugar a 8000 × g durant 1 min i es van transferir a 96-plaques de pous i es va mesurar la DO a 665 nm. Es va utilitzar Na2S per construir una corba estàndard.

2.5. Detecció de sulfà sofre amb SSP4

Cada mostra (20 μM) es va incubar amb 5 μM de SSP4 en bromur de cetiltrimetilamoni 1 mM / PBS (pH 7,4) durant 10 min a 25 graus. Després de la incubació, la fluorescència mesurada per un espectrofotòmetre (JASCO Corporation) amb excitació a 457 nm, emissió a 490–535 nm.

2.6. Proves radicals DPPH

Es va barrejar DPPH (250 μM) en etanol amb la mateixa quantitat de tampó MES (50 mM, pH 7, 4). A aquesta solució de DPPH es va afegir HSA tractat amb Na2Sn (40 μM), que es va incubar durant 30 min a 25 graus i es va mesurar l'absorbància dels radicals DPPH a 540 nm. Les taxes de radicals emmagatzemats es van convertir mitjançant la fórmula següent;

Radical emmagatzemat (percentatge)=(Abssample-Abspbs)/ Abspbs × 100

2.7. Anàlisi NO i SNO

L'HSA tractat amb Na2Sn (50 μM) es va incubar amb un donant de NO, NOC7 (200 μM), durant 30 min a 25 graus. Després de la reacció, la concentració de NO i SNO es va mesurar mitjançant un assaig de Griess amb modificacions menors [25]. La solució de reactiu de Griess es va preparar barrejant un 0,1 per cent de diclorhidrat de N-1- naftiletilè-diamida i un 1 per cent de sulfanilamida en un 2 per cent d'àcid fosfòric. El tampó de reacció estava compost per NaCl 0,1 M, DTPA 0,5 mM i AcONa ・AcOH 10 mM (pH 5,5). Les mostres (20 μM) es van fer reaccionar amb la solució de reactiu de Griess (60 μL) en tampó de reacció (110 μL) amb 3 mM de HgCl2 en 10 mM d'acetat de Na (pH 5, 5). Després d'una incubació de 15 minuts, es va mesurar l'absorbància de 540 nm mitjançant un lector de microplaques. La resta de relació NO/SNO (per cent) es va calcular i es va comparar amb els valors de PBS de les mostres.

2.8. Cultiu cel·lular

Les cèl·lules de melanoma B16 van ser proporcionades pel Banc japonès de recursos per a la investigació del càncer (JCRB, Tòquio, Japó) i es van cultivar en DMEM que contenia un 10 per cent de sèrum fetal boví i una solució antibiòtica. Les cèl·lules es van cultivar mantenint-se a 37 graus en aire humidificat que contenia un 5 per cent de CO2 a la incubadora (número de pas 10-20).

2.9. Producció de melanina

Les cèl·lules de melanoma B16 es van sembrar en plaques de 24 pous a una concentració de 2,5 × 104 cèl·lules/pou i es van cultivar amb un 5% de CO2 a 37 graus durant 24 h. Les mostres es van tractar amb tirosina 0, 4 mM i NH4Cl 10 mM en DMEM que contenia un 10 per cent de FBS i després es van incubar amb un 5 per cent de CO2 a 37 graus durant 72 h. Després de la incubació, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb PBS i es van dissoldre en NaOH 1 N (200 μL). Després d'una incubació de 2 h a 60 graus, es va mesurar l'absorció (405 nm) mitjançant un lector de microplaques.

Cistanche inhibeix la producció de melanina.

2.10. Radiacions UV

Es va utilitzar una làmpada UV de mà per irradiar les mostres a una distància de 5 cm de la placa del pou. Aquesta làmpada UV proporciona una intensitat UV de 614 o 743 μW/cm2 respectivament amb una radiació de 254 nm o 365 nm des d'una distància de 5 cm.

2.11. Activitat d'eliminació de l'HSA4-tractat amb Na2S contra ROS intracel·lular, NO, RSS

ROS i NO a les cèl·lules de melanoma B16 es van mesurar per cadascuna de les sondes de fluorescència, CM-H2DCF-DA i DAF-FM-DA, respectivament. Les cèl·lules de melanoma B16 es van sembrar en plaques de 96-pous a una concentració d'1 × 104 cèl·lules/pou i es van cultivar a 37 graus, 5 per cent de CO2 durant 24 h. Després del cultiu, el medi es va eliminar i es va substituir per CM-H2DCF-DA (5 μM) o DAF-FM-DA (10 μM) en PBS. Les sondes van ser agafades per les cèl·lules incubant-les a 37 graus durant 30 min. Després de la reacció, es van eliminar els sobrenedants, les mostres es van diluir en PBS i es va mesurar immediatament la fluorescència. Les cèl·lules van ser radiades per una làmpada UV durant 15 minuts. Després de la irradiació, es va mesurar la intensitat de fluorescència (Ex. 485 nm, Em. 535 nm) mitjançant un lector de microplaques de fluorescència.

2.12. Activitat tirosinasa de bolets i agregació de melanina

Les solucions de tirosinasa i L-DOPA es van preparar en PBS (pH 7, 4) immediatament abans de l'assaig. La tirosinasa, aïllada dels bolets, es va utilitzar per examinar l'activitat inhibidora de l'HSA tractat amb Na2Sn. Es van barrejar bé una porció de 20 μL de tirosinasa de bolets (537 U/mL) i 100 μL de HSA tractat amb Na2Sn (40 μM) amb PBS (60 μL) en plaques de 96 pous i 20 μL de L-DOPA (5 mM) després afegit. Després d'una incubació de 30 minuts, es va analitzar el nivell de melanina sintetitzada mesurant la DO 490 nm. Per avaluar l'agregació de melanina, la barreja es va centrifugar a 20, 000 g, 15 min durant 3 h. La fletxa blanca mostra el material agregat. La melanina no agregada al sobrenedant es va mesurar a una DO de 490 nm.

2.13. Proves de seguretat

La crema tòpica utilitzada en aquest estudi es va preparar barrejant aigua (30 ml) oli de jojoba (15 ml) i 5 g de cera emulsionant a 60 graus. Després de refredar-se, l'HSA tractat amb Na2S4-(20 μM) i la suspensió resultant es van barrejar bé. La prova d'irritació de la pell es va fer seguint la directriu de prova 439 de l'OCDE utilitzant el LabCyte Epi-Model (un model de pell humana cultivada en 3D).

2.14. Anàlisi estadística

La significació estadística de les dades recollides es va avaluar mitjançant anàlisi ANOVA seguida del mètode Newman-Keuls per a més de 2 mitjans. Les diferències entre els grups es van avaluar mitjançant la prova t de Student. Es va considerar que P <{3}},05 era="" estadísticament="">

3. Resultats

3.1. Preparació de HSA S-sulfhidratat

L'HSA tractat amb Na2Sn es va preparar a partir d'HSA que s'havia incubat amb Na2Sn i s'havia sotmès a filtració en gel després de la reacció. Per avaluar la quantitat de sofre de sulfan a la mostra, es va utilitzar EMSP, un mètode quantitatiu nou que hem desenvolupat anteriorment [24]. Per tant, l'HSA tractat amb Na2S4- es va preparar a partir de HSA i Na2Sn permetent que els reactius reaccionessin durant 1 h a 37 graus. Es va permetre que diferents quantitats de polisulfurs de sodi reaccionessin amb HSA. A continuació, les mostres de HSA es van incubar amb una solució EMSP, que es va preparar en el moment de l'ús, durant 3 h a 37 graus. A partir de les anàlisis de l'EMSP, el nivell de S-sulfhidratació va augmentar independentment de la quantitat de sofre (Fig. 1A). D'altra banda, tal com es mostra a la figura 1B, el tractament amb Na2S3- o Na2S4-va millorar la intensitat de fluorescència SSP4 (una sonda de fluorescència per al sofre de sulfan) en comparació amb el Na2S- o Na2S{{24} }} tractaments, cosa que suggereix que SSP4 possiblement va reaccionar amb el polisulfur de la proteïna d'una manera no lineal (Fig. 1B).

3.2. Efecte antioxidant i NO supressor de l'HSA tractat amb Na2S

Vam postular que la HSA tractada amb Na2Sn suprimiria la producció de melanina a causa de la seva activitat antioxidant. Per tant, es va realitzar una prova de radical DPPH [26,27] per analitzar l'activitat antioxidant in vitro. Com a resultat, el HSA tractat amb Na2Sn tenia una concentració significativament més alta de sofre afegit (Fig. 2A). Per dilucidar l'efecte del NO, NOC7 (un donant de NO) es va co-incubar amb HSA tractat amb Na2S4-a 25 graus. Després d'un període d'incubació de 30 minuts, la concentració de NO restant es va quantificar mitjançant un assaig de Griess. Com es veu a les barres tancades de la figura 2B, l'HSA tractat amb Na2S4-eliminava significativament més NO en comparació amb el control i l'HSA (figura 2B). Se sap que el mercuri elemental (Hg) redueix el SNO i allibera NO2-. Quan es va afegir Hg a una solució de HSA tractat amb Na2S4-, es va alliberar NO2-, cosa que suggereix que l'HSA tractat amb Na2S4- es va eliminar mitjançant nitrosació S.

3.3. Efecte de supressió de melanina de l'HSA tractat amb Na2Sn

Es van cultivar cèl·lules de melanoma de ratolins B16 i es va promoure la síntesi de melanina afegint tirosina al medi. Com es mostra a la figura 3, la HSA tractada amb Na2Sn va inhibir la síntesi de melanina i la inhibició depenia del contingut de sofre. Les imatges cel·lulars de cèl·lules de melanoma B16 després de l'aplicació de la HSA tractada amb Na2Sn també van demostrar que la HSA tractada amb Na2Sn va disminuir la proporció de producció de melaninacèl·lules positives (Fig. 3).

3.4. Efecte antioxidant del HSA4-tractat amb Na2S amb irradiació d'UV

Per examinar si la HSA tractada amb Na2Sn va suprimir la formació de ROS o NO induïda per UV, es va realitzar una prova d'estrès oxidatiu utilitzant cèl·lules de melanoma B16 com a models. La producció de ROS per HSA tractada amb Na2S4-a cèl·lules de melanoma B16 per irradiació amb 2 dispositius UV diferents durant 15 min es va mesurar per CMH2-DCF-DA. Les troballes indiquen que l'HSA tractat amb Na2S4-va provocar una disminució significativa de la fluorescència de CMH2-DCF-DA a PBS i HSA per irradiació a 254 nm i 365 nm (Fig. 4AB). Per contra, l'HSA tractat amb Na2S4-també va suprimir la producció de NO a les cèl·lules de melanoma B16 per irradiació amb UV de 254 nm (Fig. 4CD). Aquests resultats indiquen que l'HSA tractat amb Na2Sn suprimeix la síntesi de melanina mitjançant la inhibició de ROS i NO produïts per la irradiació UV.

3.5. Supressió directa de l'agregació de tirosinasa i melanina per HSA tractat amb Na2Sn

Se sap que alguns agents anti-melanina comercials inhibeixen directament l'activitat de la tirosinasa. Així, vam provar si la HSA tractada amb Na2Sn alterava l'activitat de la tirosinasa. Els resultats van indicar que la HSA tractada amb Na2Sn inhibia la tirosinasa dels bolets en major mesura que la HSA no tractada (Fig. 5A). Després de generar-se, la melanina s'agrega fàcilment i indueix la formació de la medul·la [28]. Per tant, a continuació vam abordar la qüestió de si l'HSA tractat amb Na2Sn inhibeix l'agregació de melanina. En conseqüència, quan la tirosinasa i la L-DOPA es van incubar juntes durant 3 h, els pigments de melanina es van agregar, però la HSA tractada amb Na2Sn va impedir l'agregació (Fig. 5B). D'una banda, també es va trobar que l'HSA inhibeix l'agregació, la qual cosa indica que el mateix HSA podria prevenir la unió de L-DOPA a la tirosinasa.

3.6. Prova de seguretat d'HSA tractada amb Na2Sn utilitzant pell humana cultivada en 3D

Les proves d'irritació de la pell per a la HSA4-tractada amb Na2S es van realitzar mitjançant cèl·lules de pell humana cultivades en 3D segons les directrius de l'OCDE. Com a resultat, el nombre de cèl·lules supervivents no es va reduir amb l'HSA tractat amb Na2S4- amb o sense l'ús d'una crema tòpica (Fig. 6A). L'ús d'un kit de detecció de citotoxicitat de LDH també va revelar que les cèl·lules de la pell no estaven danyades per l'HSA tractat amb Na2S4- (figura 6B). Aquestes dades van indicar que l'HSA tractat amb Na2Sn és molt segur per al seu ús contra la pell humana sota les concentracions examinades en aquest estudi.

4. Discussió

La melanina es sintetitza per oxidació de la tirosina. La tirosina s'oxida a L-DOPA, i després dopaquinona per l'acció de la tirosinasa. La dopaquinona s'oxida espontàniament a melanina. La melanina indueix la formació de pigments negres i pigues, però també juga un paper en la protecció de la pell de ser danyada per la radiació UV. A la pell humana, els melanòcits produeixen ROS i NO quan són estimulats per la radiació UV [2,29,30]. ROS promou la síntesi de melanina activant la tirosinasa mitjançant l'acció de l'ATP sintasa, la fenilalanina hidroxilasa i la fosforilació de MAPKs [31,32]. El NO activa la tirosinasa augmentant el nivell cel·lular de cGMP [6]. Per tant, els eliminadors de ROS i NO es consideren agents anti-melanogènesi. Aquí, vam investigar l'efecte de síntesi anti-melanina de l'HSA tractat amb Na2Sn. La HSA tractada amb Na2Sn va suprimir fortament els nivells cel·lulars de ROS i NO produïts per la radiació UV (Fig. 4). A més, la HSA tractada amb Na2Sn va tenir un efecte directe en la inhibició de l'acció de la tirosinasa (Fig. 5A) i l'agregació de melanina (Fig. 5B). No vam poder aclarir el mecanisme de com es va transferir el sofre de sulfà de l'HSA tractat amb Na2Sn a una cèl·lula. Per tant, la naturalesa de com els efectes directes de la funció HSA tractada amb Na2Sn encara no està clara. Yamashita et al. va demostrar que la dopaquinona s'uneix a proteïnes tiol mitjançant residus de cisteïna [33]. En conjunt, la inhibició de l'agregació de melanina per HSA i HSA tractat amb Na2Sn també pot implicar la formació d'enllaços disulfur amb dopaquinona o melanina. D'altra banda, la inhibició de la tirosinasa depenia del contingut de sofre afegit (Fig. 5A). Se sap que el GSH s'uneix a la tirosinasa i disminueix la seva activitat [34]. Com que la cisteïna S-sulfhidratada té una reactivitat més forta que la cisteïna normal [11], el persulfur de glutatió (GSSH) pot inhibir l'acció de la tirosinasa més que la GSH. Es necessiten més estudis sobre la qüestió de si l'HSA tractada amb Na2Sn augmenta la GSSH intracel·lular en el futur.

Els ROS es produeixen per la irradiació UV o l'estrès extern indueixen signes d'envelliment, no només en forma de síntesi de melanina, sinó també per l'aparició d'arrugues i flacciditat de la pell, causades per danys a l'ADN i la formació de col·lagen reticulat. També se sap que les ROS són un factor agreujant en diversos tipus d'inflamació com els grans i la psoriasi. Diversos agents per blanquejar la pell, com l'àcid tranexàmic [35] i l'arbutina [36], s'han dissenyat per abordar aquests problemes. Tanmateix, aquests compostos només inhibeixen la síntesi de melanina i no tenen cap efecte sobre l'estrès oxidatiu. Així, es van mantenir els riscos de toxicitat induïda per ROS. Un avantatge d'utilitzar HSA tractat amb Na2Sn és que elimina de manera eficient ROS (Figs. 2 i 4).

El sulfur d'hidrogen s'ha estudiat com una tercera molècula essencial després de l'òxid nítric i el monòxid de carboni. S'ha demostrat que els efectes terapèutics del sulfur d'hidrogen són aplicables al tractament de la isquèmia/reperfusió [37], l'aterosclerosi [38], la sèpsia [39] i la toxicitat induïda per la dieta alta en greixos [40]. A més, l'hidropersulfur té una activitat més gran que el sulfur d'hidrogen. Per exemple, el Na2S4 desintoxica eficaçment el metilmercuri i inhibeix la diferenciació de les cèl·lules del neuroblastoma, mentre que el Na2S no [12,41]. Per tant, no només és possible un efecte blanquejador de la pell, sinó també altres efectes positius de l'HSA tractat amb Na2Sn.

En conclusió, vam informar sobre el desenvolupament d'un nou sistema de lliurament de RSS que utilitza l'albúmina sèrica com a portador estable. El sofre reactiu, quan es combina amb HSA, tenia un efecte antioxidant més fort que l'HSA i inhibia la síntesi de melanina a les cèl·lules del melanoma. El mecanisme d'anti-melanogènesi implica no només l'eliminació de ROS i NO, sinó també la supressió de l'activitat de la tirosinasa i l'agregació de melanina. Per tant, l'HSA tractat amb Na2Sn té un potencial considerable per utilitzar-lo com a agent per blanquejar la pell segur.

Aquest és el nostre producte.

Per a més informació, feu clic a la imatge.