Una pantalla nova per als reguladors d'expressió de la proteïna telomèrica TRF2 va identificar petites molècules que perjudiquen la immunosupressió dependent de TRF2 i el creixement del tumor

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum simple:La proteïna telomèrica TRF2 (factor d'unió de repetició telomèrica 2) està regulada a l'alça en els càncers humans i s'associa amb un mal pronòstic. Les propietats oncogèniques de TRF2 es basen en el seu paper protector intrínsec dels telòmers, però també en els efectes extrínsecs de la cèl·lula mitjançant activitats immunosupressores i angiogèniques. Per tant, l'orientació a TRF2 apareix com una estratègia terapèutica contra el càncer prometedora. En aquest estudi, hem desenvolupat un mètode basat en cèl·lules per detectar inhibidors de TRF2 que ens permet identificar dos compostos que emboliquen les propietats pro-oncogèniques de TRF2 in vivo.

Resum: El factor 2 d'unió repetida telomèrica (TRIF2) és una subunitat del complex proteic shelterin, que s'uneix i protegeix els telòmers de l'activació no desitjada de la resposta a danys a l'ADN (DDR). L'expressió de TRF2 té un paper fonamental en l'envelliment i el càncer, sent regulada durant la senescència cel·lular i sobreexpressada durant l'oncogènesi. Els càncers que sobreexpressen TRF2 sovint presenten un pronòstic dolent. A les cèl·lules canceroses, TRF2 té múltiples funcions, inclosa la protecció dels telòmers i funcions autònomes no cel·lulars, promovent la neoangiogènesi i la immunosupressió.puritans vitamina cPresentem aquí una estratègia de cribratge original, que permet identificar petites molècules que disminueixen o augmenten l'expressió de TRF2. En examinar una petita biblioteca de fàrmacs aprovats per l'Agència d'Aliments i Medicaments (FDA), vam identificar dues molècules (AR-A014418 i alexidina-2HCl) que van deteriorar el creixement del tumor, la neoangiogènesi i la immunosupressió mitjançant la regulació a la baixa de l'expressió de TRF2 en un ratolí. model de xenograft. Aquests resultats donen suport a l'estratègia quimioterapèutica de reduir l'expressió de TRF2 per tractar tumors humans agressius i validar aquest assaig basat en cèl·lules capaç de detectar molècules potencials anticancerígenes i anti-envelliment mitjançant la modulació dels nivells d'expressió de TRF2.

Paraules clau:TRF2; càncer; envelliment; assaig de cribratge basat en cèl·lules; neoangiogènesi; supressió immune

Feu clic aquí per saber-ne més

1. Introducció

Els telòmers són estructures de nucleoproteïnes especialitzades que es troben als extrems dels cromosomes lineals que estan regulades per factors associats als telòmers, com ara la telomerasa, els complexos de proteïnes shelterin i l'ARN que conté repeticions telomèriques no codificants [1]. Quan es regulen adequadament, els telòmers protegeixen els cromosomes de la inestabilitat i la senescència. L'escurçament de l'ADN telomèric es produeix com a part del desenvolupament i l'envelliment fisiològic programats [2]. Tanmateix, l'escurçament excessiu de l'ADN dels telòmers provoca síndromes progeroides rares, com ara la disceratosi congènita [3]. A més, els estats de telòmers desregulats estan implicats en nombroses malalties que són comunes a la població general, incloent gairebé tots els tipus de càncer i diverses malalties degeneratives [4]. Així, el desenvolupament de tractaments farmacològics per orientar components específics dels telòmers és prometedor per prevenir i tractar aquestes malalties.

Pel que fa als telòmers i al càncer, els punts de control de resposta al dany vital en l'ADN (DDR) de vegades fallen; això pot provocar un escurçament excessiu de l'ADN telomèric i reordenacions cromosòmiques aberrants, que al seu torn poden contribuir a l'oncogènesi. A més, la regulació de la telomerasa és un esdeveniment clau en el desenvolupament d'aproximadament el 90 per cent de tots els càncers, ja que això pot conferir un creixement il·limitat a les cèl·lules canceroses [5]. Per aquest motiu, la inhibició de la telomerasa ha estat l'objectiu de diversos estudis que busquen desenvolupar tractaments contra el càncer [6]. Malgrat els avenços recents, hi ha algunes limitacions a l'ús clínic dels fàrmacs antitelomerases. Per exemple, per aturar la proliferació de cèl·lules canceroses, s'ha d'assolir una longitud d'ADN telomèrica críticament curta i els efectes anti-oncogènics dels telòmers escurçats es perden en absència del gen supresor del tumor p53 [7,8]. Aquest període de retard redueix l'eficàcia terapèutica i augmenta els efectes secundaris pro-envelliment limitant la renovació cel·lular i afavorint l'activació de mecanismes alternatius d'allargament dels telòmers basats en la recombinació [9,10].sistanchePer tant, les estratègies anti-telomerasa poden ser més adequades per dirigir-se a les cèl·lules canceroses que ja alberguen telòmers crítics curts [11].

A més de la telomerasa, els canvis en l'expressió i l'activitat de les subunitats del complex shelterin (TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 i POT1) estan implicats en la tumorigènesi, i en alguns casos independentment de la longitud dels telòmers [12-16]. Així, orientar la shelterin per al tractament del càncer podria ser una alternativa interessant a les intervencions antitelomerasa. La subunitat shel-terin TRF2 representa un candidat interessant; El TRF2 està sobreexpressat en diverses malalties humanes, tant en cèl·lules canceroses com en cèl·lules vasculars, i això normalment s'associa amb un mal pronòstic [17-20]. En particular, la sobreexpressió de TRF2 pot promoure la tumorigènesi no cel·lular de manera autònoma, donant lloc a la immunosupressió i la neoangiogènesi[13,18-20]En particular, la regulació positiva de TRF2 crea un microambient immunosupressor potent. En alterar l'expressió dels proteoglicans de sulfat d'heparà, TRF2 recluta i activa directament cèl·lules supressores derivades de mieloides (MDSC) a través de la via TLR2 [21]. Mentre que la sobreexpressió de TRF2 a les cèl·lules canceroses inhibeix fortament el reclutament de cèl·lules NK al microambient tumoral mitjançant la regulació de la síntesi de HSPG[13], l'activació de TLR2 de MDSC induïda per la sobreexpressió de TRF2 condueix a una potent inhibició de la immunovigilància de les cèl·lules NK amb una forta disminució. de la desgranulació de cèl·lules NK, producció i matança d'IFNgamma [21].què és el cistancheAixí, la sobreexpressió de TRF2 embota fortament l'etapa inicial de la immunovigilància antitumoral inhibint directament el reclutament de cèl·lules NK i indirectament la funcionalitat de les cèl·lules NK mitjançant la conformació d'un microambient immunosupressor depenent de MDSC. En conseqüència, l'orientació a TRF2 en càncers podria ser una valuosa estratègia de múltiples èxits mitjançant processos autònoms i no cel·lulars, promovent la senescència, així com perjudicant la neoangiogènesi i la fugida immune.

cistanche pot anti-envelliment

Fins ara, tots els petits compostos identificats que tenen com a objectiu el TRF2 perjudiquen la seva capacitat de protegir els extrems dels cromosomes de la DDR, amb efectes secundaris potencials per a l'envelliment [22]. El nostre treball anterior va demostrar que una reducció parcial de l'expressió de TRF2 pot revertir la tumorigenicitat en models de ratolí mitjançant efectes no autònoms de cèl·lules, sense induir DDR [13]. Per tant, vam raonar que centrar-nos a reduir l'excés de TRF2 en càncers derivats de la seva sobreexpressió podria ser una estratègia interessant per tractar el càncer sense efectes secundaris favorables a l'envelliment. En aquest estudi, presentem una plataforma de cribratge original per identificar petits compostos dirigits a l'estabilitat de TRF2. Mostrem que dos èxits principals van inhibir l'activitat tumorigènica de la sobreexpressió de TRF2. Aquest estudi va demostrar que l'expressió de TRF2 es pot modular farmacològicament i que el nostre assaig de cribratge és un mètode fiable per a la selecció de fàrmacs capaços de modular els nivells d'expressió de TRF2, amb potencials propietats anticancerígenes i anti-envelliment.

2. Materials i mètodes 2.1.Cèl·lules

Les cèl·lules T de ronyó embrionari humà (HEK)293-(ATCC CRL-1573) i cèl·lules BJ-HELTRs[13] es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, França) complementat amb Sèrum de vedella fetal al 10% (FCS), 100 UI/ml de penicil·lina i 100 ug/ml d'estreptomicina (Invitrogen, Cergy Pontoise, França).

2.2.SDS-PAGE i Western Blotting

Es van preparar lisats cel·lulars totals, separats per electroforesi i borrar com es va descriure anteriorment [14]. Breument, les cèl·lules es van recollir i lisar en tampó de lisi (8,76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH 7,2, 0,1% SDS,0,1% Triton X -100,10 g/L desoxicolat de sodi, 5 mM àcid etilendiaminotetraacètic (EDTA), 1{{5{0}} ug/mL leupeptina, 1 mM AEBSF i 19 ug/mL aprotinina). A continuació, es van valorar les mostres mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BCA (Interchim, Monlucon, França). Les mostres (60 ug/carril) es van escalfar a 95 graus durant 5 min en tampó de càrrega (500 mM Tris-HCl, 100 mM DTI, 2 per cent de SDS, 0, 1 per cent de blau de bromofenol, 10 per cent de glicerol pH 6, 8). A continuació, les mostres es van carregar en gels de poliacrilamida al 10 per cent i es van executar durant 45 min a 160 V. Les proteïnes es van transferir a membranes Immobilon-FL (Millipore, Upstate New York, EUA) mitjançant Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio- Rad, Hercules, CA, EUA). Les membranes es van bloquejar durant 1 h al tampó de bloqueig d'interceptació (LI COR, Lincoln, NE, EUA) abans de la incubació durant la nit a 4 graus amb una barreja d'anticossos primaris (mouselgGl anti-TRF2 diluït a 1: 250;i IgGanti-Beta-actina de conill diluïda a 1:10,000) en un tampó de bloqueig d'intercepció que conté un 0,5 per cent de Tween20. Després de rentar-se amb PBS al 0,1 per cent de Tween20, les membranes es van incubar durant 1 h a temperatura ambient en un tampó de bloqueig Intercept que contenia un 0,25 per cent de Tween20 amb una barreja d'anticossos secundaris: IRDye 680 de cabra-anti-ratolí per a anticossos anti-TRF2 i IRDye de cabra anti-conill. 800CW per a anticossos anti-beta-actina (1:15, dilució000).Cistanche anti-envellimentEls anticossos primaris i secundaris IRDye que es van utilitzar es mostren a continuació a la taula d'anticossos (taula 1). Finalment, es van visualitzar les bandes de proteïnes mitjançant el sistema d'imatge LiCor Odyssey 9120 (LI-COR). L'expressió TRF2 es va mesurar normalitzant la intensitat de la banda TRF2 a les intensitats de la banda d'actina i el fons.

2.3.Estratègia de clonació

La seqüència d'ADNc de TRF2 humà es va clonar entre els llocs de restricció BamHI/BclI d'un plasmidi lentiviral SFFV-GPR que és un derivat del VIH-SFFV-GFP-WPRE [23]. El plasmidi SFFV-GPR conté un promotor del virus de formació de focus de melsa (SFV) que controla un gen policistrònic GPR que inclou seqüències d'ADNc per a proteïna fluorescent verda (GFP), una proteïna de resistència a la puromicina i una proteïna fluorescent Tag-red (RFP) -T (etiqueta mutada S158T). -RFP), cadascun separat per seqüències de Picornaviridae E2 i T2. L'ADNc de hTRF2 es va inserir a la regió C-terminal de RFP-T, per permetre l'expressió d'una proteïna de fusió RFP-TRF2.

2.4.Producció de lentivirus

Per a la producció de lentivirus, 5 × 10* cèl·lules T HEK 293- es van transfectar amb 8,6 ug de SFFV-GPR o RFP-TRF2-que expressa el vector SFFV-GPR, 8,6 ug de Lenti. -Delta 8,91 i 2,8 ug de VSV-g mitjançant transfecció mediada per fosfat de calci. Les cèl·lules transfectades es van cultivar en DMEM suplementat amb un 10 per cent de FCS a 37 graus amb un 5 per cent de CO2 en plats de 10-cm. Els sobrenedants que contenien els virus de nova construcció es van recollir després de 48 h i després es van passar per un filtre Millipore de 0,45-μm. Després de la valoració del virus, es va utilitzar una proporció 1∶1 （virus∶cèl·lula） per infectar la línia cel·lular BJ-HELTRAs, escollida per la seva resistència als defectes de TRF2[13].cistanche benefíciosA continuació, es va aïllar un clon que expressava GFP i la proteïna RFP-TRF2 fusionada a nivells moderats mitjançant la classificació cel·lular activada per fluorescència (FACS).

2.5.Detecció per citometria de flux

Les cèl·lules de la línia clonal BJ-HELTRs que contenien el vector SFFV-GPR i que expressaven la proteïna de fusió RFP-TRF2 es van cultivar en plaques de 96-pous en medi DMEM suplementat amb un 10 per cent de FCS i un 1 per cent de penicil·lina/estreptomicina. Després de 24 h de tractament amb fàrmacs, les cèl·lules es van tripsinitzar i es van rentar en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) que contenia 0,5 mM d'EDTA i 2 per cent de FCS abans de fixar-les amb un 0,5 per cent de formaldehid (FA). A continuació, es van sotmetre les cèl·lules fixes. per citometria de flux mitjançant un mostrador d'alt rendiment FacsCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA).

2.6. Reacció en cadena de la polimerasa quantitativa en temps real (RT-qPCR)

L'ARN total es va aïllar mitjançant RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Països Baixos). La transcripció inversa es va realitzar mitjançant la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) amb 1 ug d'ARN total. L'expressió de cada gen es va normalitzar a la de GAPDH. Es van utilitzar els següents cebadors: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC{-3'hGAPDH Rv 5'-CAACCCAATA{{{ACCAATCCATA{-3'; 14}}. 2.7.AlamarBlue

En una placa de fons pla 96-pou, es van sembrar 5 × 103 cèl·lules per pou en 200 uL de DMEM suplementat amb un 10 per cent de FCS. A les 24 h després del tractament amb fàrmacs, es van afegir 10 uL d'AlamarBlue (Bio-Rad) i es va mesurar l'absorbància a 570 nm i 600 nm durant 36 h en un lector de plaques Spectrostar Nano (BMGLabtech, Ortenberg, Alemanya). El percentatge d'oxidació-reducció d'AlamarBlue es va determinar tal com descriu el fabricant.

2.8.Animals

Es van realitzar experiments amb 8- ratolins femelles nues NMRI de 12-setmanes de Janvier Labs (França). Tots els experiments amb ratolins es van realitzar d'acord amb les directrius institucionals locals i internacionals i van ser aprovats pel Comitè de Cura dels Animals de l'IRCAN i el regional (CIEPAL Cote d'Azur #187 i #188) i nacional (Ministeri francès d'Investigació #03482.01/02482.2). i #02973.01/02973.2)autoritats.

2.9.Experiments de creixement tumoral

Cada ratolí nu NMRI es va injectar per via subcutània a la part posterior amb 1 x 106 cèl·lules BJ-HELTRAs suspeses en 100 μL de PBS (n=8 ratolins per grup). Els ratolins es van tractar els dies 16, 18, 20 i 22 amb injeccions intraperitoneals de 100 uL de DMSO (45 per cent), alexidina-2HCl (1 mg/kg) o AR-A014418 (5 mg/kg), després es va seguir fins al dia 26. L'aspecte del tumor es va valorar per palpació cada dia. La mida del tumor es va mesurar cada 2-3 dies amb un calibre. A continuació, es va determinar el volum del tumor mitjançant la fórmula hemi-el·lipsoide: π×(L×1×h)/6, on L correspon a la longitud, I a l'amplada i h a l'alçada del tumor, respectivament.

2.10.Assajos de matriugel

Les cèl·lules BJ-HELTRAs es van tractar amb DMSO (1 per cent), alexidina -2HCl (1 uM) o AR-A014418 （10 μM） durant 2 dies. A continuació, es van inocular per via subcutània 100 μL de cèl·lules tractades a 1 × 10 graus suspeses en PBS juntament amb 400 μL de Matrigel reduït amb factor de creixement (Corning, Nova York, EUA) a la part posterior de ratolins nus NMRI sota anestèsia isofluran. El dia 5 després de la inoculació, es van recollir els taps de Matrigel i es van recollir cèl·lules infiltrades mitjançant dissociació enzimàtica mitjançant dispasa (Corning), col·lagenasa A (Roche, Bale, Suïssa) i digestió DNAseI (Roche) durant 30 minuts a 37 graus [13]. ]. Les cèl·lules es van saturar durant 15 min en gel amb anticossos Fe-Block anti-CD16/CD32 (clon 2.4G2) abans de la tinció amb anticossos acoblats durant 30 min a 4 graus. Els anticossos conjugats utilitzats s'enumeren a la taula d'anticossos. Les cèl·lules es van rentar en PBS amb EDTA 0, 5 mM, 2 per cent de FCS i es van fixar amb 0, 5 per cent de FA. Les cèl·lules tacades es van analitzar mitjançant un citòmetre ARIA III amb programari DIVA6 (BD Biosciences) i FlowJo 10 (LLC).

2.11.Estadístiques

Tots els gràfics i anàlisis estadístiques es van produir mitjançant el programari GraphPad Prism (San Diego, CA, EUA). Tots els resultats es representen com a mitjana ± desviació estàndard (sd) o mitjana ± error estàndard de la mitjana (SEM). Les diferències significatives entre les mitjanes es van determinar mitjançant la prova de dues cues de Mann-Whitney. Es va utilitzar la prova de rang de registre (Mantel-Cox) per determinar la presa del tumor. Per a cada prova, pàg<0.05 was="" considered="" statistically="">

3.Resultats

3.1.Identificació de molècules inhibidores de TRF2

Per detectar fàrmacs capaços de modular els nivells de proteïna TRF2, vam utilitzar un sistema lentiviral per co-trancriure el gen GFP i la RFP fusionada a l'extrem N-terminal de TRF2. Seguint una estratègia general descrita en un altre lloc [23], vam construir un lentivirus GRT, en el qual el promotor SFFV controlava l'expressió d'un gen policistronic que codificava GFP, una proteïna de resistència a la puromicina i RFP-TRF2 o RFP només com a control (figura 1A). En conseqüència, totes les cèl·lules transduïdes expressaven tant GFP com RFP-TRF2. Aquest sistema es va dissenyar per identificar fàrmacs que modulen l'expressió de TRF2, mesurant la intensitat de la RFP mitjançant citometria de flux, mentre que la intensitat de la GFP serveix com a control intern per a la transcripció de la construcció del reporter.

Hem transduït els lentivirus GRT en fibroblasts humans BJ-HELTRAs que van ser immortalitzats per SV40 i hTERT i convertits en oncogènics per Ras v12 [13]. Per facilitar les mesures de la regulació tant a l'alça com a la baixa de TRF2, es va aïllar un clon resistent a la puromicina que expressava moderadament les proteïnes GFP i RFP-TRF2 mitjançant la classificació FACS i es va anomenar GRI-BJ-HELTRAs (figura 1A). Com a control positiu, vam tractar cèl·lules GRT-BJ-HELTRAs amb gemcitabina 10 uM, un modulador de l'estabilitat de TRF2 descrit anteriorment [24], durant 24 hores. Tot i que no es va detectar cap modulació RFP a les cèl·lules transduïdes amb vector buit, es va observar una reducció significativa de la relació d'intensitat de fluorescència mitjana (MFI) RFP/GFP a les cèl·lules GRT-BJ-HELTRAs tractades amb gemcitabina en comparació amb el control tractat amb DMSO (82 per cent). del control;p<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

Mitjançant citometria de flux, després vam examinar 396 compostos farmacològics aprovats per la Food and Drug Administration (FDA) capaços d'orientar-se a sis categories principals de processos biològics: canals iònics, fosfatases, cinases, factors epigenètics, lligands del receptor nuclear i la via Wnt (Figura S1C). Les cèl·lules GRT-BJ-HELTRAs es van tractar primer amb 10 uM de cadascun dels 396 compostos o DMSO durant 24 hores abans de l'anàlisi de citometria de flux (Figura S1D). En aquest cas, es van trobar 84 compostos per modular els nivells de proteïna TRF2 (figura S1D, panell dret; taula S1) i es van utilitzar per a una pantalla secundària (figura S1E; ​​taula S1). En aquesta pantalla secundària, a més de tractar cèl·lules GRT-BJ-HELTRAs amb 10 uM dels compostos seleccionats, les cèl·lules BJ-HELTRAs no transduïdes o les cèl·lules BJ-HELTRAs transduïdes amb un vector buit es van tractar de manera similar per descartar falsos positius que emeten vermells. o autofluorescència verda o afectant a les proteïnes RFP o GFP. A continuació, es van seleccionar els 18 millors compostos per determinar la seva capacitat per modular l'expressió de l'endogen nous TRF2 a les cèl·lules BJ-HELTRAs no transduïdes, basant-se en Western blotting (Figura S2A, B Taula S1). Hem definit els èxits com a compostos que modulen almenys un 20 per cent de la dosi de TRF2 (amunt o avall). Utilitzant aquests criteris, dels 18 fàrmacs avaluats mitjançant Western blotting, 9 d'ells es van reduir i un van augmentar els nivells de proteïna endògena TRF2 (figura S2A, taula S1) Aleshores vam decidir triar dos compostos entre aquests fàrmacs per a experiments in vivo per determinar si podrien contrarestar els efectes pro-oncogènics de la sobreexpressió de TRF2. Per evitar l'activació de la DDR i els efectes secundaris en cèl·lules no tumorigèniques, vam seleccionar compostos que no reduïen la dosi de TRF2 ni als nivells més alts ni als més baixos. Entre ells, AR i AD corresponien a aquests criteris. Tots dos compostos van regular a la baixa RFP-TRF2 a les cèl·lules GRT-BJ-HELTRAs analitzades per citometria de flux (figura 1C), els nivells de proteïna endògena TRF2 tal com es mostra per l'anàlisi de Western blotting (figura 1D; figura S2A, B) i els nivells d'ARNm de TERF2 determinats mitjançant RT -qPCR (Figura 1E). A més, el tractament amb les concentracions respectives de LD50 d'AR i AD va reduir l'expressió d'ARNm de TERF2 tant a les cèl·lules BJ-HELTRAs com a les cèl·lules BJ-HELTRAs que sobreexpressen TRF2- (figura S3A-C).

3.2.AR-A014418 i Alexidine-2HCl van revertir la tumorigenicitat conferida pels alts nivells d'expressió de TRF2

A continuació, vam avaluar l'impacte de l'AR i l'AD en el creixement del tumor. Per controlar la seva capacitat d'orientar els càncers que sobreexpressen TRF2-, hem analitzat els efectes antitumorals potencials de AR i AD tant en cèl·lules estàndard BJ-HELTRAs com en cèl·lules BJ-HELTRAs que sobreexpressen TRF2-. Les cèl·lules BJ-HELTRAs es van transduir amb un vector TRF2 lentiviral o un vector buit, i després es van injectar per via subcutània a ratolins nus. A continuació, els ratolins es van tractar amb DMSO, 1 mg/kg AD o 5 mg/kg AR els dies 16, 18, 20 i 22 després de la injecció [26, 27] (Figura 2A). Com es va informar anteriorment [13, 21], la sobreexpressió de TRF2 va promoure el tumor ini. tiació i creixement in vivo (figura 2B-D; p<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 i Alexidine-2HCI van contrarestar la TRF2-Immunosupressió dependent i neoangiogènesi

Per determinar si els efectes antitumorals de l'AR i l'AD podrien orientar-se a les propietats oncogèniques autònomes no cel·lulars de TRF2, vam examinar la infiltració i l'activació de cèl·lules immunes, així com l'angiogènesi en tumors tractats. Vam tractar cèl·lules BJ-HELTRAs estàndard i TRF2-que sobreexpressen (figura S3A) amb 1 uM d'AD, 10 uM d'AR o DMSO durant 48 h abans de la seva injecció subcutània amb Matrigel en ratolins nus. A continuació, es van recollir els taps de Matrigel als 5 dies posteriors a la injecció per analitzar el microentorn del tumor mitjançant citometria de flux (figura 3A). Com era d'esperar [13, 21], la sobreexpressió de TRF2 no va canviar la infiltració global de cèl·lules immunitàries (CD45 més cèl·lules) (figura 3B; figura S4A), però va inhibir el reclutament de cèl·lules assassines naturals (NK) (figura 3C; figura S4B) i la funció NK. -alitat (Figura 3C-E; Figura S4C) i augmentar la infiltració de MDSC (Figura 3F). En les cèl·lules TRF2-que sobreexpressen BJ-HELTRs específicament, el tractament amb qualsevol fàrmac va augmentar la infiltració immune global (figura 3B; figura S4A), així com la quantitat i la funcionalitat de les cèl·lules NK intratumorals (figura 3C-E; figura). S4B,C). En particular, ambdós fàrmacs van rescatar completament la inhibició de la vigilància immune mediada per cèl·lules NK (CD107a més i CD69 més cèl·lules NK) induïda per la sobreexpressió de TRF2 (figura 3C). Això es va associar amb una disminució espectacular del reclutament de MDSC (figura 3F; figura S4D) i amb un augment del reclutament de monòcits i macròfags (figura 3G).

Com s'ha informat anteriorment [14,20], l'angiogènesi del tumor era més alta en els tumors que sobreexpressaven TRF2-en comparació amb els tumors control. Tot i que la sobreexpressió de TRF2 va augmentar la quantitat de cèl·lules endotelials CD31 més CD45- dins del llit tumoral (figura 3H; figura S4E), no es va detectar cap diferència entre el vector buit o els tumors que sobreexpressaven TRF2- després del tractament amb qualsevol fàrmac. El TRF2 (vector TRF2) o el vector buit es va tractar amb 1 uM d'alexidina-2HCl o 10 μM d'AR-A014418 o DMSO 2 dies abans de la injecció subcutània amb Matrigel (1 × 10 graus de cèl·lules) en ratolins NMRI nus ( n=8). A continuació, es va avaluar la infiltració de cèl·lules immunes i endotelials als 5 dies posteriors a la injecció mitjançant citometria de flux. (BH). Anàlisi per citometria de flux de la infiltració immune del tap Matrigel. Es mostra el nombre de cèl·lules immunitàries que s'infiltren als taps Matrigel entre les cèl·lules vives. La infiltració total de cèl·lules immunitàries (CD45 més cèl·lules) es mostra a (B); la infiltració de cèl·lules assassines naturals (NK) (NKp46 més cèl·lules) es mostra a (C); la infiltració de cèl·lules NK activades (CD107a més i CD69 més cèl·lules NK) es mostra a (D, E); La infiltració de cèl·lules supressores derivades de mieloides (MDSC; CD11b més GR1 més )) es mostra a (F); la infiltració de monòcits-macròfags es mostra a (G) i la infiltració de cèl·lules endotelials es mostra a (H).p Els valors es van determinar mitjançant el Mann- Test de Whitney(*p<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. Discussió

Aquí, informem del desenvolupament d'un assaig basat en cèl·lules per detectar compostos que modulen l'expressió de la proteïna telomèrica TRF2. En examinar una petita biblioteca de molècules aprovades per la FDA, vam identificar compostos que podrien augmentar o disminuir els nivells d'expressió de TRF2. Vam descobrir que l'AD i l'AR regulaven a la baixa TRF2 i presentaven una activitat antitumoral específica per a cèl·lules tumorals que sobreexpressen TRF2. Demostrant encara més la seva activitat específica de TRF2-, el tractament amb AR i AD va rescatar la immunosupressió i la neoangiogènesi conferides per la sobreexpressió de TRF2. Sorprenentment, el fet que la infiltració immune global augmenti per als tumors que sobreexpressen TRF2 després del tractament amb AR o AD suggereix que aquests fàrmacs són més potents per millorar la resposta immune quan el TRF2 està sobreexpressat. Aquests fàrmacs inhibeixen l'efecte immunosupressor de la sobreexpressió de TRF2 restaurant la funcionalitat de les cèl·lules NK (CD107a i CD69 més cèl·lules NK) i disminueixen fortament la infiltració de MDSC. Això suggereix que aquests fàrmacs atenuen el programa específic de TRF2-que desencadenen l'escapament immunitari i la immunosupressió i poden millorar l'alliberament de molècules associades al perill (DAMP) que milloren la resposta immune específicament quan el TRF2 està sobreexpressat. Cal destacar que l'AR i l'AD van rescatar les funcions immunosupressores i proangiogèniques de la sobreexpressió de TRF2, dues característiques de la sobreexpressió de TRF2 que anteriorment vam mostrar com a independents de DDR. Així, vam plantejar la hipòtesi que els efectes AR i AD sobre el creixement del tumor són independents de la DDR, un mecanisme que encara s'ha de descriure completament en estudis posteriors. El present estudi de prova de concepte proporciona proves que la reducció farmacològica de l'expressió de TRF2 podria ser una valuosa estratègia contra el càncer

Tot i que el mètode de cribratge va considerar els nivells de proteïna TRF2 independentment dels nivells de transcripció, ambdós fàrmacs van disminuir els nivells d'ARNm de TERF2 endògens, la qual cosa implica que AR i AD tenen com a objectiu múltiples nivells de regulació de TRF2. D'acord amb això, AR és un inhibidor de la senyalització Wnt [28], que és un activador de la transcripció de TERF2 [29]. De manera més general, els fàrmacs dirigits a la via de senyalització Wnt es van enriquir durant els passos de cribratge (figura S1B-D). Queda per determinar com l'AD, un agent orientat als mitocondris, afecta l'expressió de TRF2. Com que els càncers que presenten nivells alts de TRF2 tenen un pronòstic dolent i presenten una major resistència a la quimioteràpia [21], AR i AD són agents terapèutics d'interès per a aquests tumors. El potencial de desacoblar les activitats telomèriques i pro-oncogèniques de TRF2[13] planteja la possibilitat de reduir farmacològicament el TRF2, conferint així avantatges contra el càncer de múltiples èxits sense efectes secundaris perjudicials per a l'envelliment. Per tant, es garanteixen estudis futurs per determinar els efectes sinèrgics d'aquests fàrmacs sobre els nivells d'expressió de TRF2 en estudis clínics.

Tot i que el TRF2 està regulat a l'alça en diversos càncers humans [13,21], la seva expressió està regulada a la baixa durant l'envelliment tant normal com patològic de molts teixits [30,31] A més, diversos informes que impliquen models de ratolí de desregulació de TRF2 emfatitzen la importància de TRF2 a la cruïlla entre l'envelliment i el càncer [31-35]. Per tant, les molècules identificades pel procediment de cribratge descrit aquí són candidats a fàrmacs interessants, tant com a agents anticancerígens per a la regulació a la baixa de TRF2, tal com es confirma en aquest estudi, i potencialment com a agents anti-envelliment mitjançant la regulació de TRF2.

Aquest article està extret de Cancers 2021, 13, 2998. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers