Una puntuació del mòdul de rebuig comú urinari (uCRM) per al seguiment de trasplantaments renals no invasiu

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Resum

S'ha informat anteriorment que un mòdul de rebuig comú (CRM) que consta d'11 gens expressats en biòpsies d'al·loempelt servia com a biomarcador per al rebuig agut (AR), es correlacionava amb l'extensió de la lesió de l'empelt i prediria el dany futur de l'al·loempelt. Hem investigat l'ús d'aquest panell de gens en el pellet de cèl·lules d'orina de pacients amb trasplantament de ronyó. Es van recollir sediments de cèl·lules urinàries de pacients amb rebuig agut confirmat per biòpsia, AR límit (bAR), nefropatia del virus BK (BKVN) i es van analitzar empelts de ronyó estables amb biòpsies de protocol normal (STA) per a l'expressió d'aquests 11 gens mitjançant una cadena de polimerasa quantitativa. reacció (qPCR). Hem avaluat aquests 11 gens CRM per la seva abundància, autocorrelació i nivells d'expressió individual, l'expressió dels gens 10/11 es va elevar en AR en comparació amb STA. sensibilitat=93,6 per cent, especificitat=97,6 per cent). La puntuació Au CRM, basada en la mitjana geomètrica dels nivells d'expressió, podria distingir AR de STA amb una alta precisió (AUC= 0.9886) i es va correlacionar específicament amb les mesures histològiques de la tubulitis i la inflamació intersticial en lloc de l'atròfia tubular, la glomerulosclerosi, proliferació íntima, vacuolització tubular o glomerulitis aguda. Aquesta puntuació basada en l'expressió gènica d'orina pot permetre el seguiment no invasiu i quantitatiu de la RA.

EFECTES DE CSITANCHE: ANTIINFLAMATORIS

Introducció

El trasplantament de ronyó (KTx) és la modalitat preferida per al tractament de la malaltia renal en fase terminal (ESRD) per qualsevol causa [1]. Tot i que aquest enfocament terapèutic s'ha convertit en una pràctica rutinària a tot el món, millorant significativament la qualitat de vida i la supervivència dels pacients[2], els resultats a llarg termini de l'al·loempelt de ronyó no han millorat com s'esperava malgrat una millor comprensió de la biologia immune del rebuig de l'al·loempelt i l'arribada de noves tecnologies. i agents immunosupressors més potents [3]. La causa principal de la supervivència persistent i deficient de l'empelt és la incapacitat per quantificar de manera no invasiva la càrrega de la lesió immune de l'empelt i predir el rebuig agut abans d'un declivi funcional substancial i una lesió histològica. De fet, tot i que és ben sabut que els pacients amb KTx estan exposats contínuament a lesions immunes i no immunes relacionades [4, 5], el seguiment periòdic de KTx depèn de marcadors substituts insensibles de la disfunció de l'al·lograft com la creatinina sèrica (6, Z] i el monitoratge esporàdic de KTx. es basa en protocols de biòpsies d'al·loempelt per detectar lesions histològiques subclíniques de l'empelt en absència de pertorbació de la creatinina sèrica.[8] Tot i que l'avaluació de la disfunció de l'empelt basada només en la creatinina sèrica té sensibilitat per danys inespecífics, establerts, de l'empelt, té poca especificitat per al diagnòstic de rebuig agut (RA), ja que un augment de la creatinina sèrica pot ser degut a altres motius no directament relacionats amb el rebuig de l'al·loempelt, com la nefrotoxicitat relacionada amb fàrmacs immunosupressors (IS), la necrosi tubular aguda, la infecció. , i fibrosi intersticial i atròfia tubular (IFTA) A més, mentre que l'ús de biòpsies de vigilància s'ha postulat com l'eina estàndard d'or per diagnosticar lesions logrades, aquest enfocament és costós, invasiu, amb morbiditat del procediment (risc de sagnat; procediment que requereix sedació, especialment per als pacients pediàtrics amb KTx)[9], ple de variabilitats de lectura entre operadors i sovint poc representatiu de la lesió histològica focal. Per tant, l'ús de marcadors biològics no invasius que poden predir i quantificar amb precisió la càrrega de la lesió immune a l'al·loempelt seria un avenç significatiu per al monitoratge de precisió KTx [10-12].

Els nostres grups i altres [13-17] han demostrat que la interrogació de biomarcadors proteòmics, d'ARN i de microARN a l'orina de pacients amb KTx és un fluid biològic òptim per al seguiment en sèrie de l'al·loempelt de ronyó perquè és un ultrafiltrat del ronyó i reflecteix els processos biològics i la càrrega inflamatòria que es troben a l'empelt de ronyó [18]. Malgrat una sèrie d'estudis que han avaluat prèviament els biomarcadors d'orina com un enfocament diagnòstic no invasiu per a l'anàlisi de la RA en el trasplantament de ronyó, l'enfocament exclusiu en biomarcadors únics com ara quimiocines i receptors particulars com CXCR3, CXCL9 o CXCL10 [{{ 6}}] dificulten la captura de la complexitat molecular i l'heterogeneïtat de l'AR entre diferents pacients amb KTx. Captar aquesta heterogeneïtat és essencial per quantificar la càrrega de lesions d'una manera utilitzable per al seguiment prospectiu de la RA i la recuperació de la lesió de l'empelt després de la intervenció terapèutica [25, 26].

En aquest estudi, apliquem els coneixements adquirits mitjançant l'aprofitament d'un mòdul de rebuig comú (CRM) d'11 gens [27], desenvolupat originalment mitjançant una metaanàlisi exhaustiva de conjunts de dades de microarrays de teixits de trasplantament disponibles públicament de mostres de biòpsia de quatre tipus diferents de sòlids. òrgans. Els gens CRM al teixit (tCRM) es van sobreexpressar entre els pacients amb AR, independentment del tipus d'òrgan, les diferències en els protocols d'immunosupressió o les diferències en les plataformes que interrogaven l'expressió gènica. Un llindar quantitatiu determinat mitjançant l'anàlisi computacional d'una puntuació gènica combinada (la puntuació tCRM) va predir amb precisió la presència d'AR mitjançant la validació creuada de signatures d'expressió gènica dels teixits en 8 cohorts independents (n= 236 mostres) d'al·loempelt de ronyó humà. biòpsies[27]. La puntuació tCRM es va validar encara més per qPCR en un estudi separat sobre mostres de biòpsia KTx com a diagnòstic tant d'AR com de lesió crònica d'al·lograft (CAl) amb diferents llindars de gens [28]. A més, aquest conjunt de gens CRM es va validar en un conjunt independent de teixit biòpsia de pacients amb trasplantament de pulmó amb disfunció crònica d'al·lograft pulmonar (CLAD) [29].

En aquest estudi, avaluem el conjunt de gens CRM per al seu ús en mostres d'orina de pacients amb KTx, combinat amb biòpsies d'al·loempelt amb histologia coneguda, per al diagnòstic no invasiu d'AR i altres lesions mediades per la immunitat. A més, desenvolupem una puntuació CRM (uCRM) d'orina que discrimina amb precisió entre pacients amb STA i AR. Avaluem el potencial clínic d'aquesta puntuació en la detecció de bAR correlacionant aquesta puntuació amb puntuacions histològiques de tubulitis i inflamació intersticial.

EFECTES DE CSITANCHE: MILLORAR LA IMMUNITAT

Materials i mètodes

Les mostres d'orina i la cohort d'estudi

Es van incloure a l'estudi mostres d'orina del biobanc (n=1760) de destinataris de KTx inscrits a la Universitat de Stanford entre el 2000 i el 2011 i el Centre Mèdic UCSF inscrit entre el 2014 i el 2016. L'estudi va ser aprovat per la Junta de Revisió Institucional i el Comitè d'Ètica de la Universitat de Califòrnia a San Francisco, CA. Tots els pacients van donar el consentiment informat per escrit per participar en la investigació, en total adhesió a la Declaració d'Hèlsinki. Les activitats clíniques i de recerca que s'estan informant són coherents amb els Principis de la Declaració d'Istanbul tal com es descriu a la Declaració d'Istanbul sobre el tràfic d'òrgans i el turisme de trasplantaments. Per a les mostres d'orina utilitzades per establir el llindar uCRM per a l'AR, es van identificar 178 mostres d'orina amb biòpsies d'al·loempelt de ronyó aparellades amb patologies clarament definides d'AR[30,31] de Banff o sense lesions/empelts estables (STA) (Eig 1). A més, també es va avaluar la signatura de l'assaig uCRM en la nefropatia viral BK, que és un factor de confusió important per al diagnòstic d'AR i que sovint presenta una inflamació important a la biòpsia d'al·lograft. En total, es van descartar 28 mostres a causa de problemes de control de qualitat relacionats amb el baix contingut i l'ARN de mala qualitat, donant lloc a un recompte final de 150 mostres d'orina de 150 individus per a l'anàlisi transversal de la lesió KTx mediada per la immunitat. Cada mostra d'orina es va emparellar amb una biòpsia en el moment de la recollida d'orina, que va ser avaluada per un patòleg del personal central de la Universitat de Stanford (Richard Sibley) o de la UCSF (Zol-tan Laszik).

Característiques del pacient

150 unique urine samples were assessed for the uCRM assay in 150 unique kidney transplant patients. Baseline clinical and demographic variables by AR, bAR, BKVN, or STA phenotype are shown in Table1, There were no significant differences between the groups in the demographic variables, except in recipient age (p= 0.025) and in donor-source (p=0.0008). These samples were used in cross-sectional analyses for modeling of gene expression data and subsequent development and validation of the uCRM threshold for biopsy-proven AR. Samples were collected from both pediatric (n=94) and adult (n=56)patients to enable a model-independent of recipient age or baseline immunosuppression. Based on the matched biopsy diagnosis, urine samples were categorized in the following categories: AR(n=64;45 biopsies met criteria for Banff confirmed AR with >i2,t2, and infiltration by >4 cèl·lules mononuclears/secció transversal tubular, mentre que 19 complien els criteris per a l'AR límit amb il/i2 i t0/t1 i la infiltració per 1-4 cèl·lules mononuclears/secció transversal tubular), STA (n { {8}}), nefritis del virus BK (n =43), els pacients van rebre un règim d'ILS inhibidor de la calcineurina basat en tacrolimus i micofenolat de mofetil, amb o sense esteroides, i teràpia d'inducció amb Timoglobulina o anti-IL{{{{ 12}} anticossos monoclonals del receptor (daclizumab o basi. infliximab)[32]. Les mostres d'orina es van obtenir a una mitjana de 731 dies després del trasplantament (rang 169-1335 dies).

Definició de fenotips de lesions

All kidney biopsies were blindly and centrally analyzed at each institution by staff pathologists (RS and ZL)and were graded by the Banff dassification[31,33] for acute rejection.Intragraft C4d stains were performed [34] to assess for acute humoral rejection(AHR)[35]. Transplant injury was defined as>Un augment del 20 per cent de la creatinina sèrica respecte al seu valor inicial d'estat estacionari anterior i una biòpsia associada que es va classificar com a AR o BKVN.AR es va definir com a mínim, segons l'esquema de Banff, una puntuació de tubulitis superior o igual a 1 acompanyada d'un Puntuació d'inflamació intersticial Major o igual a 1 amb Cd i DSA negatius. Es van induir tant els casos d'AR (TCMR) mediats per cèl·lules T com de rebuig mediat per anticossos (ABMR), tot i que tots els casos d'ABMR observats tenien un fenotip mixt de TCMR i ABMR, ja que l'observança de l'ABMR pura rarament s'observa en cohorts de baix risc i no sensibilitzats. Es van observar canvis límit (bAR) en alguns casos de TCMR, caracteritzats per la infiltració de cèl·lules mononuclears (<25% of="" the="" parenchyma)or="" foci="" of="" mild="" tubulitis(1-4="" mononuclear="" cells/tubular="" cross-section),="" and="" for="" purposes="" of="" molecular="" correlation="" analysis,="" these="" have="" been="" shown="" as="" bar,="" as="" the="" burden="" of="" histological="" inflammation="" was="" overall="" lower="" for="" these="" biopsy="" samples.="" bkvn="" was="" defined="" as="" the="" positivity="" of="" polyomavirus="" pcr="" in="" peripheral=""><1000-28,800,000), together="" with="" a="" positive="" sv40="" stain="" in="" the="" concomitant="" renal="" allograft="" biopsy.="" normal="" (sta)="" allografts="" were="" defined="" by="" an="" absence="" of="" significant="" injury="" pathology="" on="" the="" 6-month="" protocol="" biopsy,="" as="" defined="" by="" banff="" schema,="" stable="" graft="" function,="" no="" proteinuria,="" and="" no="">

Fig 1. Selecció de la mostra i esquema d'estudi de l'estudi. Es van recollir 1.760 mostres d'orina entre el 2000 i el 2016,

dels quals 643 tenien dades de biòpsia coincidents. 178 d'aquests 643 tenien fenotips ben definits d'AR, bAR, BKVN o STA.

Després de l'extracció d'ARN, la síntesi d'ADNc i la quantificació de qPCR, 28 mostres no van passar QA/QC, deixant 150

mostres per a l'anàlisi i la modelització estadística.

Recollida d'orina, processament, extracció d'ARN total, síntesi d'ADNc i qPCR

L'orina (50 ml; recipient estèril) es va recollir dels pacients amb trasplantament renal abans del procediment de biòpsia i abans de qualsevol intensificació del tractament per a la AR. L'ARN es va extreure del sediment de cèl·lules urinàries seguint el nostre protocol reportat anteriorment [36]. En resum, les cèl·lules d'orina es van obtenir centrifugant l'exemplar d'orina de 50- ml a 2000 xg durant 20 minuts. L'ARN es va extreure dels pellets de cèl·lules d'orina mitjançant el RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, València, CA). La qualitat de l'ARN es va avaluar amb l'espectrofotòmetre NanoDrop ND-2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) amb una relació de 260/280. La síntesi d'ADNc es va realitzar mitjançant 50 ng d'ARN extret mitjançant SuperScript VILO"Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA). Es va realitzar qPCR en ADNc sintetitzat a partir de 50 ng d'ARN total, després es van processar 1,56 ng d'ADNc mitjançant una amplificació i una mostra diana específiques. dilució amb els assajos Taqman agrupats per als gens uCRM d'1l en multiplex, amb Taqman PreAmp Master Mix (ABI) a un volum final de 5 ul, durant 18 cicles en un termociclador, després diluït amb DNA Suspension Buffer (TEKnova, CA). realitzat a les matrius dinàmiques de 96,96 (Fluidigm, South San Francisco, CA) utilitzant 2,25 ul de la mostra diluïda de l'amplificació diana específica, juntament amb Taqman Assays (ABI) per a cada transcripció gènica (S1Table), Taqman Universal master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) i reactiu de càrrega (Fluidigm), cebant i carregant el xip mitjançant el controlador HX IFC i realitzant qPCR al sistema BioMark (Fluidgm). La quantitat relativa d'expressió d'ARN es va calcular mitjançant un cy comparat. Mètode cle threshold (CT). Els valors d'expressió es van normalitzar a 18 amb referència endògena d'ARN ribosòmic i ARN universal (Agilent Inc., Santa Clara, CA).

Estadística

Tots els assajos de qPCR es van executar per duplicat. Totes les dades es presenten com a mitjana ± SEM. Per a les comparacions dels gens CRM per fenotip, es va utilitzar un model d'efectes mixts amb la correcció Geisser-Greenhouse, amb correccions de comparacions múltiples realitzades mitjançant el procediment de pas lineal en dues etapes de Beniamini, Krieger i Yekutieli. La correlació de Pearson i la pols jeràrquica es van realitzar a Morpheus (Broad Institute). Per als models de predicció d'aprenentatge automàtic, les dades es van dividir en un conjunt d'entrenament (80 per cent) i un conjunt de proves (20 per cent). Es va utilitzar un model de classificació d'arbre de decisió, validat al conjunt de proves, per determinar el tall de puntuació uCRM més precís. La selecció de variables utilitzant boscos aleatoris (VSURF) es va utilitzar per classificar AR i STA, així com per avaluar i classificar la importància dels gens individuals. La sortida d'importància de la variable Random Forest es defineix com la disminució del percentatge mitjà d'inexactitud del model de la variable (gen) exclosa (permutada aleatòriament) del model. La pols no supervisada per visualitzar la separació de fenotips es va fer mitjançant un algorisme d'incorporació de veí estocàstic distribuït (t-SNE) a Mathematica 11.3 (Wolfram Research, Champaign. IL). L'anàlisi de xarxa dels gens CRM es va realitzar mitjançant GeneMANIA [37]. Les estadístiques sobre variables demogràfiques es van realitzar mitjançant anàlisis de Chi quadrat per a variables discretes i la prova de Kruskal-Wallis per a variables contínues a IMP 14.2 (SASInstitute, Cary, NC). Llevat que s'indiqui el contrari. totes les altres anàlisis es van realitzar i visualitzar amb Prism 8.0.1 (GraphPad, Carlsbad, CA).

Aprovació de l'estudi

L'estudi va ser aprovat pels comitès d'ètica tant de la Stanford University Medical School com del UCSF Medical Center. Tots els pacients adults i els pares/tutors de pacients no adults van donar el consentiment informat per escrit per participar en la investigació, en total adhesió a la Declaració d'Hèlsinki. Les activitats clíniques i de recerca que s'estan informant són coherents amb els Principis de la Declaració d'Istanbul tal com es descriu a la Declaració d'Istanbul sobre el tràfic d'òrgans i el turisme de trasplantaments.

EFECTES DE CSITANCHE: MILLORAR LA IMMUNITAT

Resultats

Les variables clíniques i demogràfiques de referència per als 150 receptors de KTx amb fenotips AR, bAR, BKVN i STA es mostren a la taula 1.

Abundància relativa i correlació de l'expressió del gen CRM al sediment de cèl·lules murines

Abundància relativa. Per determinar l'abundància relativa de les transcripcions del gen CRM als sediments d'orina, es van utilitzar els valors del llindar del cicle (Ct) com a mètrica de l'abundància. Com més baix sigui el valor de Ct, més gran serà la seva abundància entre els gens CRM. Entre els 11 gens CRM, BASP1 va ser la transcripció més abundant al sediment de les cèl·lules urinàries. BASP1 va ser seguit per TAP1, PSMB9 i ISG20 com les 4 transcripcions més abundants. LCK i CD6 es trobaven entre les transcripcions menys abundants en els sediments d'orina del conjunt de gens CRM. Com que els valors de Ct van anar des del valor Ct més baix de 14 fins al valor Ct més alt de 20, hi va haver una diferència 64-plegada entre les transcripcions dels gens BASP1 i CD6, sent CD6 la transcripció menys abundant.

Fig 2. Abundància relativa i correlació de l'abundància de gens CRM a l'orina i expressió de gens CRM a través de diferents fenotips clínics de trasplantament renal. A. Matriu de correlació de Pearson que demostra la correlació entre 11 gens CRM en la seva expressió en sediments de cèl·lules urinàries. La mida del quadrat serveix com a indicador visual de la força de la correlació. B. Mapa de calor amb agrupació supervisada per fenotip que demostra l'expressió relativa dels gens CRM en AR, bAR, BKVN i STA. C. Gràfics de violí que representen la distribució dels gens CRM en el pellet de cèl·lules d'orina AR, bAR, BKVN i STA. � indica que AR vs STA va ser significatiu després de múltiples comparacions. # indica que bAR vs STA va ser significatiu després de múltiples comparacions. Les estadístiques addicionals estan disponibles a la taula 2.

Correlació de l'expressió gènica entre els gens del gen CRM.

A continuació, es va avaluar la correlació de l'expressió gènica entre 11 gens CRM. La correlació va anar des de molt feble (r=-0.17 per a CXCL9 i NKG7 i r=-0.10 CXCL10 i RUNX3) fins a molt forta (r=0.77 per a INPP5D i TAP1 i el mateix valor per a CD6 i LCK). Tot i que CXCL9 i CXCL10 es troben a la mateixa classe de quimiocines, la correlació d'expressió gènica entre elles només era moderada (r=0.46). La presentació gràfica de la matriu de correlació es presenta a la figura 2A. Un mapa de calor generat mitjançant agrupació supervisada demostra l'augment considerable dels valors d'expressió gènica dels gens CRM en AR, bAR i BKVN en comparació amb el fenotip STA (Fig 2B).

Expressió del gen uCRM en sediments urinaris amb AR i BKVN confirmats per biòpsia

Expressió gènica de CRMgenes en AR i bAR. A continuació, es va avaluar l'expressió gènica de cadascun dels 11 gens CRM per a la seva expressió relativa en AR, bAR, BKVN i STA. Un resum dels resultats de l'anàlisi es presenta a la taula 2 i la figura 2C.10 dels 11 gens es van incrementar significativament en els sediments d'orina AR en comparació amb els sediments d'orina de STA. No obstant això, només cinc gens CRM (Cd6, Cxcll0, Cxd9, Nkg7 i Psmb9) es van regular significativament a les mostres de bAR en comparació amb STA i la seva expressió al grup bAR va ser relativament inferior a la del grup AR classificat Banff, destacant que els gens uCRM poden reflecteixen la càrrega inflamatòria dins de l'al·lograft Eig 2C.

Taula 2. Nivells d'expressió gènica dels gens CRM a través de diferents fenotips

Expressió gènica dels gens CRM en BKVN. L'expressió de CD6, CXCL10, CXCL9, LCK, NKG7 i PSMB9 es va regular de manera diferent a les mostres d'orina amb pacients amb BKVN en comparació amb les mostres de pacients STA. Dels sis gens amb valors d'expressió gènica estadísticament diferents entre mostres de BKVN i STA, l'expressió de només NKG7 va ser substancialment menor a l'orina de BKVN.

Determinació d'una puntuació d'expressió gènica CRM (uCRM) d'orina per identificar el rebuig del trasplantament de ronyó

Com que l'expressió del conjunt de gens CRM no era homogènia entre els fenotips de trasplantament i hi va haver una conversa fisiològica substancial entre els diferents gens (Fig S1), vam utilitzar mètodes supervisats no lineals per diferenciar i classificar encara més els fenotips. Es va realitzar un agrupament no supervisat mitjançant t-SNE per determinar les relacions entre els gens i els fenotips uCRM. La figura 3A mostra la trama t-SNE, que indica que els 11 gens CRM podrien segregar gairebé completament AR de les mostres STA. El model VSURF, depenent de les puntuacions d'importància de Random Forests, va determinar que PSMB9 i CXCL10 eren els dos gens més importants per satisfer l'AR de STA. La figura 3B mostra més la importància d'aquests 2 gens. El gràfic d'importància dels pesos dels gens indica que qualsevol dels dos gens, si s'exclou del model, correspon a una disminució aproximada del 20 per cent de la imprecisió del model. Aquests dos gens podrien classificar AR versus STA amb una precisió gairebé tan alta com el model del gen 1l, amb una sensibilitat del 93,6% i una especificitat del 97,6%. Els llindars d'expressió gènica d'aquests dos gens es van determinar mitjançant un classificador d'arbre de decisió i els valors d'escala logarítmica d'aquests dos gens es mostren a la figura 3C. Un llindar de 28 per a CXCL10 i 3 per a PSMB9 va classificar correctament 86/88 casos AR i STA per a una precisió global del 97,7 per cent . En particular, les mostres de bar es van situar entre els fenotips AR i STA, cosa que suggereix la gradació d'aquests dos gens en el grau d'inflamació de l'al·lograft.

Per explorar el rendiment de classificació de la puntuació uCRM en casos AR, AR límit i STA, es va produir un classificador d'arbre de decisió (Fig 4A). L'arbre de decisió va determinar els llindars de puntuació uCRM òptims per a cada fenotip. Una puntuació superior a 4 44/49 casos AR classificats correctament; una puntuació inferior a 1,8 va classificar correctament 33/35 casos STA. 14/23 casos límit es trobaven entre aquests dos llindars. La distribució de les puntuacions d'uCRM per fenotip es mostra a la figura 4B. Les puntuacions mitjanes d'uCRM (SEM) per a AR, bAR i STA eren 8,195 (0,631), 3,265 (0,412{{21) }}), i 1,404 (0,162) respectivament, i totes les comparacions van ser significatives després de la correcció de múltiples comparacions. La puntuació uCRM podria distingir entre AR i STA amb una alta precisió: amb un llindar de 3,63, la sensibilitat i l'especificitat eren del 95,35 per cent i del 97,78 per cent, respectivament (Eig 4C. En distingir entre AR i la combinació de bAR i STA, es va mantenir la puntuació uCRM). una alta precisió al mateix llindar, la sensibilitat i l'especificitat eren del 87, 10 per cent i del 97, 78 per cent respectivament (Fig S2A).

En incloure les mostres de BKVN, tots els fenotips eren significativament diferents entre si després de la correcció de múltiples comparacions excepte bAR i BKVN (S2BFig). En distingir entre AR i la combinació de bAR, STA i BKVN, la puntuació uCRM encara conservava una precisió alta, però menor. Utilitzant els mateixos llindars de 3,63, la sensibilitat i l'especificitat eren del 76,92 i del 97,78 per cent, respectivament (S2CFig).

El ComScore es correlaciona amb lesions histològiques de la biòpsia específiques d'AR. En particular, la tendència d'augmentar la puntuació uCRM de STA a bAR a AR va suggerir que la puntuació uCRM podria detectar degradacions de la inflamació clínicament rellevants. Com a tal, vam avaluar si la puntuació uCRM estava associada amb l'extensió de les lesions histològiques AR observades en biòpsies coincidents del mateix pacient, recollides simultàniament. Com es veu a les figures 5A i 5B, les puntuacions uCRM es correlacionen amb l'extensió de la tubulitis (t) i les puntuacions de la biòpsia d'inflamació intersticial (i) en AR (R=0.5479, P).<0.0001 and="" r="0.4420,"><0.0001 for="" the="" ucrm="" score="" regarding="" t="" and="" ii,="" respectively).="" there="" was="" no="" correlation="" between="" the="" ucrm="" score="" and="" measures="" of="" tubular="" atrophy="" (ta),glomerulosclerosis="" (gs),mesangial="" matrix="" (mm),="" intimal="" proliferation="" (cv),="" medial="" arteriolar="" hyaline="" (ah),="" tubular="" vacuolization(tv),="" arteritis="" (v),="" or="" acute="" glomerulitis="">

EFECTES DE CSITANCHE: ANTIFATIGA

Discussió

Hi ha una necessitat urgent en medicina de trasplantaments per desenvolupar eines de monitorització fiables i no invasives que puguin ajudar els metges de trasplantament a predir el risc de lesió de l'al·loempelt, preferentment abans que ja s'hagi establert el dany de l'al·loempelt. Tot i que una sèrie de biomarcadors transcripcionals s'han associat amb AR, la majoria dels estudis s'han centrat bàsicament en un factor transcripcional únic o únic i no reflecteixen tota la complexitat molecular del procés biològic de rebuig de l'al·lograft [11,38]. A més, mentre que l'estàndard d'or actual per diagnosticar la presència d'una lesió d'al·loempelt mediada per la immunitat és la biòpsia d'al·loempelt, és ben sabut que el procediment té limitacions clau pel que fa a la representació freqüent de mostres erràtiques, el seu alt cost i la impracticabilitat de repeticions. cribratge per la naturalesa invasiva de la tècnica.

Diversos informes han demostrat el valor d'estudiar diferents biomarcadors que prediuen RA en mostres d'orina de receptors de trasplantament de ronyó [20-22]. Augment dels nivells urinaris de molècules efectores immunitàries i transcripcions com el granzim B. CXCL10.CXCL9.IFN-y i CXCR3. s'ha demostrat que estan molt associats amb la RA i, en alguns casos, fins i tot prediuen l'arribada de la RA amb antelació [19,24,39-43]. Aprofitant les dades recentment informades pel nostre grup [2Z, 29,44] que mostren un mòdul de rebuig comú de l'expressió gènica en biòpsies d'al·loempelt durant la RA, independentment del tipus d'òrgan de teixit, l'objectiu principal d'aquest estudi era investigar si l'avaluació del CRM a l'orina dels pacients amb trasplantament de ronyó podria ser útil com a biomarcador no invasiu ideal per predir l'arribada de la AR.

Tot i que molts dels gens i productes gènics CRM individuals s'han avaluat individualment, aquest és el primer informe de l'ús col·lectiu i no invasiu dels gens CRM en la predicció de l'AR en KTx. Per exemple, l'ARNm i la proteïna CXCL9 urinari i l'ARNm CXCL10 s'havien avaluat prèviament en estudis multicèntrics per al diagnòstic d'AR[13,45,46. Les transcripcions de PSMB9 en biòpsies renals també s'havien associat prèviament amb la qualitat de l'empelt i la predicció del rebuig agut. 47].

Hem analitzat les dades d'expressió gènica sobre sediments d'orina de pacients amb KTx per a l'abundància relativa de transcripcions de CRM i la seva correlació d'expressió entre gens CRM (Fig 2A). els CRMgenes havien augmentat l'expressió en AR i altres lesions de trasplantament com AR i BKVN (Fig 2B i 2C). En aquest informe, també vam observar una forta correlació entre la puntuació uCRM recentment desenvolupada i les puntuacions inflamatòries histològiques (puntuació t i ii de biòpsies renals). Com que la majoria d'aquests gens CRM s'expressen gairebé exclusivament en cèl·lules immunitàries infiltrades, l'augment de l'expressió dels gens CRM als sediments d'orina suggereix que hi ha un augment de l'alliberament de cèl·lules immunitàries infiltrades a l'orina dels receptors de trasplantament renal que pateixen lesions de l'empelt.

A continuació, vam utilitzar una puntuació combinada calculada a partir dels valors d'expressió gènica individual de gens CRM individuals, el ComScore, com a mètrica per classificar els pacients amb trasplantament renal en pacients amb rebuig agut o sense lesió i vam determinar un llindar per a AR. Els resultats d'aquest estudi demostren que el poder de l'assaig uCRM no només és identificar pacients amb AR, sinó també quantificar el grau de lesió que té lloc a l'al·loempelt, ja que la puntuació augmenta des de valors baixos en pacients amb STA fins a valors intermedis en pacients amb bAR. i a valors elevats en pacients amb AR, tal com es reflecteixen en les puntuacions histològiques de la tubulitis i la inflamació intersticial. Creiem que la puntuació uCRM té una utilitat potencial en el seguiment de trasplantaments i pot servir com a complement o com a prova de referència per a biòpsies. Un pacient amb una puntuació uCRM baixa pot evitar biòpsies de protocol innecessàries, mentre que un pacient amb una puntuació uCRM alta pot requerir un seguiment en sèrie o una biòpsia per causa per avaluar l'estat de l'empelt.

Reconeixem diverses limitacions d'aquest estudi que inclou (i) la mida limitada de la mostra de l'estudi, (ii) l'absència d'altres fenotips de lesions per trasplantament, com ara lesions cròniques d'al·loempelt o toxicitat per fàrmacs, i (i) la manca d'avaluació de la puntuació uCRM en una puntuació longitudinal. mostra en una mida de cohort més gran. Aquestes troballes prometedores suggereixen que es necessiten estudis addicionals i prospectius per validar i avaluar completament la utilitat potencial de la puntuació uCRM en l'entorn clínic. En resum, presentem un biomarcador no invasiu basat en orina desenvolupat a partir d'un mòdul de rebuig comú format per 11 gens que poden identificar la lesió i el rebuig del trasplantament en pacients amb trasplantament de ronyó.

EFECTES DE CSITANCHE: MILLORAR LA MEMÒRIA

Referències

1 Wolfe RA, Ashby VB, Milford EL, Ojo AO, Ettenger RE, Agodoa LY, et al. Comparació de la mortalitat en tots els pacients en diàlisi, pacients en diàlisi en espera de trasplantament i receptors d'un primer trasplantament de cadàver. La revista de medicina de Nova Anglaterra. 1999; 341(23):1725–30.

2. Laupacis A, Keown P, Pus N, Krueger H, Ferguson B, Wong C, et al. Estudi de la qualitat de vida i cost-utilitat del trasplantament renal. Kidney internacional. 1996; 50(1):235–42. PMID: 8807593.

3. Lodhi SA, Lamb KE, Meier-Kriesche HU. Millorar els resultats a llarg termini dels pacients amb trasplantament: argumentar la investigació multidisciplinària i específica de la malaltia a llarg termini. Revista americana de trasplantament: revista oficial de la Societat Americana de Trasplantament i la Societat Americana de Cirurgians de Trasplantament. 2011; 11(10):2264–5.

4. Naesens M, Khatri P, Li L, Sigdel TK, Vitalone MJ, Chen R, et al. El dany histològic progressiu en els al·loempelts renals s'associa amb l'expressió de gens de la immunitat innata i adaptativa. Kidney internacional. 2011; 80(12):1364–76.

5. Sigdel TK, Li L, Tran TQ, Khatri P, Naesens M, Sansanwal P, et al. Els anticossos no HLA contra epítops immunogènics prediuen l'evolució de la lesió crònica de l'al·lograft renal. Revista de la Societat Americana de Nefrologia: JASN. 2012; 23(4):750–63.

6. Pape L, Offner G, Ehrich JH, de Boer J, Persijn GG. Funció d'al·loempelt renal en parelles de receptors pediàtrics i adults del mateix donant. Trasplantament. 2004; 77(8):1191–4. PMID: 15114083.

7. Provoost AP, Wolff ED, de Keijzer MH, Molenaar JC. Influència de la mida del receptor sobre la funció renal després del trasplantament de ronyó. Una investigació experimental i clínica. Revista de cirurgia pediàtrica. 1984; 19(1):63–7.

8. Moreso F, Lopez M, Vallejos A, Giordani C, Riera L, Fulladosa X, et al. Biòpsies de protocol en sèrie per quantificar la progressió de la nefropatia crònica del trasplantament en al·loempelts renals estables. Revista americana de trasplantament: revista oficial de la Societat Americana de Trasplantament i la Societat Americana de Cirurgians de Trasplantament. 2001; 1(1):82–8. PMID: 12095044.

9. Davis ID, Oehlenschlager W, O'Riordan MA, Avner ED. Biòpsia renal pediàtrica: aquest procediment s'ha de fer en un entorn ambulatori? Nefrologia pediàtrica. 1998; 12(2):96–100. PMID: 9543363.

10. Roedder S, Sigdel T, Salomonis N, Hsieh S, Dai H, Bastard O, et al. L'assaig kSORT per detectar pacients amb trasplantament renal amb alt risc de rebuig agut: resultats de l'estudi multicèntric AART. PLoS medicina. 2014; 11(11):e1001759.

11. Sarwal M, Chua MS, Kambham N, Hsieh SC, Satterwhite T, Masek M, et al. Heterogeneïtat molecular en el rebuig agut d'al·loempelt renal identificada mitjançant el perfil de microarrays d'ADN. The New England Journal of Medicine. 2003; 349(2):125–38.

12. Sigdel TK, Sarwal MM. Avenços recents en el descobriment de biomarcadors en el trasplantament d'òrgans sòlids mitjançant proteòmics. Revisió experta de proteòmica. 2011; 8(6):705–15. https://doi.org/10.1586/epr.11.66 PMID: 22087656.

13. Suthanthiran M, Schwartz JE, Ding R, Abecassis M, Dadhania D, Samstein B, et al. Perfil d'ARNm de cèl·lules urinàries i rebuig cel·lular agut en al·loempelts de ronyó. La revista de medicina de Nova Anglaterra. 2013; 369 (1):20–31.

14. Sigdel TK, Gao Y, He J, Wang A, Nicora CD, Fillmore TL, et al. Extracció del proteoma de l'orina humana per al seguiment de lesions de trasplantament renal. Kidney internacional. 2016; 89(6):1244–52. https://doi.org/10.1016/j. punt.2015.12.049 PMID: 27165815.

15. Sigdel TK, Ng YW, Lee S, Nicora CD, Qian WJ, Smith RD, et al. Perturbacions de l'exosoma urinari en el rebuig del trasplantament. Fronteres en medicina. 2014; 1:57.

16. Yang JY, Sarwal MM. Genètica i genòmica dels trasplantaments. Nature Reviews Genètica. 2017; 18(5):309–26.

17. Loupy A, Lefaucheur C, Vernerey D, Chang J, Hidalgo LG, Beuscart T, et al. Estratègia de microscopi molecular per millorar l'estratificació del risc en el rebuig precoç d'al·loempelt de ronyó mediat per anticossos. Revista de la Societat Americana de Nefrologia: JASN. 2014; 25(10):2267–77. Epub 05/04/2014.

18. Sigdel TK, Vitalone MJ, Tran TQ, Dai H, Hsieh SC, Salvatierra O, et al. Un assaig ràpid no invasiu per a la detecció de lesions de trasplantament renal. Trasplantament. 2013; 96(1):97–101. PMID: 23756769.

19. Hauser IA, Spiegler S, Kiss E, Gauer S, Sichler O, Scheuermann EH, et al. Predicció del rebuig agut d'al·loempelt renal per monocina urinària induïda per IFN-gamma (MIG). Revista de la Societat Americana de Nefrologia: JASN. 2005; 16(6):1849–58.

20. Hu H, Kwun J, Aizenstein BD, Knechtle SJ. Detecció no invasiva de lesions agudes i cròniques en el trasplantament renal humà mitjançant l'elevació de múltiples citocines/quimiocines a l'orina. Trasplantament. 2009; 87(12):1814–20. PMID: 19543058.

21. Jackson JA, Kim EJ, Begley B, Cheeseman J, Harden T, Perez SD, et al. Les quimiocines urinàries CXCL9 i CXCL10 són marcadors no invasius del rebuig de l'al·lograft renal i la infecció viral per BK. Revista americana de trasplantament: revista oficial de la Societat Americana de Trasplantament i la Societat Americana de Cirurgians de Trasplantament. 2011; 11(10):2228–34.

22. Schaub S, Nickerson P, Rush D, Mayr M, Hess C, Golian M, et al. Els nivells urinaris de CXCL9 i CXCL10 es correlacionen amb l'extensió de la tubulitis subclínica. Revista americana de trasplantament: revista oficial de la Societat Americana de Trasplantament i la Societat Americana de Cirurgians de Trasplantament. 2009; 9 (6):1347–53.

23. Segerer S, Cui Y, Eitner F, Goodpaster T, Hudkins KL, Mack M, et al. Expressió de quimiocines i receptors de quimiocines durant el rebuig del trasplantament renal humà. Revista americana de malalties renals: la revista oficial de la National Kidney Foundation. 2001; 37(3):518–31. PMID: 11228176.

24. Tatapudi RR, Muthukumar T, Dadhania D, Ding R, Li B, Sharma VK, et al. Detecció no invasiva de la inflamació de l'al·lograft renal mitjançant mesures d'ARNm per IP-10 i CXCR3 a l'orina. Kidney internacional. 2004; 65(6):2390–7.

25. Menon MC, Murphy B, Heeger PS. Moviment dels biomarcadors cap a la implementació clínica en el trasplantament renal. JASN. 2017.

26. Naesens M, Anglicheau D. Precision Transplant Medicine: Biomarkers to the Rescue. JASN. 2017.

27. Khatri P, Roedder S, Kimura N, De Visser K, Morgan AA, Gong Y, et al. Un mòdul de rebuig comú (CRM) per al rebuig agut en diversos òrgans identifica noves terapèutiques per al trasplantament d'òrgans. Revista de medicina experimental. 2013; 210(11):2205–21.

28. Sigdel TK, Bestard O, Tran TQ, Hsieh SC, Roedder S, Damm I, et al. Una puntuació d'expressió gènica computacional per predir lesions immunes en al·lografts renals. PloS un. 2015; 10(9):e0138133.

29. Secrets A, Yang JYC, Vanaudenaerde BM, Sigdel TK, Liberto JM, Damm I, et al. El mòdul de rebuig comú en el rebuig crònic després del trasplantament pulmonar. PloS un. 2018; 13(10):e0205107. Epub 06/10/2018.

30. Sis B, Mengel M, Haas M, Colvin RB, Halloran PF, Racusen LC, et al. Informe de la reunió de Banff '09: deteriorament de l'empelt mediat per anticossos i implementació dels grups de treball de Banff. Revista americana de trasplantament: revista oficial de la Societat Americana de Trasplantament i la Societat Americana de Cirurgians de Trasplantament. 2010; 10(3):464–71.

31. Solez K, Colvin RB, Racusen LC, Haas M, Sis B, Mengel M, et al. Classificació Banff 07 de la patologia d'al·loempelt renal: actualitzacions i orientacions futures. Revista americana de trasplantament: revista oficial de la Societat Americana de Trasplantament i la Societat Americana de Cirurgians de Trasplantament. 2008; 8 (4):753–60.

32. Sarwal MM, Ettenger RB, Dharnidharka V, Benfield M, Mathias R, Portale A, et al. L'evitació completa d'esteroides és efectiva i segura en nens amb trasplantament renal: un assaig aleatori multicèntric amb un seguiment de tres anys. Revista americana de trasplantament: revista oficial de la Societat Americana de Trasplantament i la Societat Americana de Cirurgians de Trasplantament. 2012; 12(10):2719–29.

33. Racusen LC. L'esquema de Banff i el diagnòstic diferencial de la disfunció de l'al·lograft. Tràmits de trasplantament. 2004; 36(3):753–4.

34. Jianghua C, Wenqing X, Huiping W, Juan J, Jianyong W, Qiang H. C4d com a predictor significatiu del rebuig humoral en al·lografts renals. Trasplantament clínic. 2005; 19(6):785–91.

35. Crespo M, Pascual M, Tolkoff-Rubin N, Mauiyyedi S, Collins AB, Fitzpatrick D, et al. Rebuig humoral agut en receptors d'al·loempelt renal: I. Incidència, serologia i característiques clíniques. Trasplantament. 2001; 71(5):652–8. PMID: 11292296.

36. Keslar KS, Lin M, Zmijewska AA, Sigdel TK, Tran TQ, Ma L, et al. Avaluació multicèntrica d'un protocol estandarditzat per al perfil d'expressió gènica no invasiva. AJT. 2013.

37. Montojo J, Zuberi K, Rodriguez H, Bader GD, Morris Q. GeneMANIA: Construcció ràpida de xarxes de gens i predicció de funcions per a Cytoscape. Recerca F1000. 2014; 3:153.

38. Der SD, Zhou A, Williams BR, Silverman RH. Identificació de gens regulats de manera diferent per interferó alfa, beta o gamma mitjançant matrius d'oligonucleòtids. Actes de l'Acadèmia Nacional de Ciències dels Estats Units d'Amèrica. 1998; 95(26):15623–8.

39. Hartono C, Muthukumar T, Suthanthiran M. Diagnòstic no invasiu de rebuig agut d'al·lografts renals. Opinió actual en trasplantament d'òrgans. 2010; 15(1):35–41. https://doi.org/10.1097/MOT. 0b013e3283342728 PMID: 19935064.

40. Lazzeri E, Rotondi M, Mazzinghi B, Lasagni L, Buonamano A, Rosati A, et al. Alta expressió de CXCL10 en ronyons rebutjats i paper predictiu del sèrum pretrasplantament CXCL10 per al rebuig agut i la nefropatia d'al·lograft crònica. Trasplantament. 2005; 79(9):1215–20. PMID: 15880073.

41. Matz M, Beyer J, Wunsch D, Mashreghi MF, Seiler M, Pratschke J, et al. L'expressió IP-10 urinària posttrasplantament precoç després del trasplantament de ronyó és predictiva de la funció de l'empelt a curt i llarg termini. Kidney internacional. 2006; 69(9):1683–90.

42. Simon T, Opelz G, Wiesel M, Ott RC, Susal C. Mesures d'expressió gènica de perforina de sang perifèrica en sèrie i granzima B per a la predicció del rebuig agut en receptors d'empelt renal. Revista americana de trasplantament: revista oficial de la Societat Americana de Trasplantament i la Societat Americana de Cirurgians de Trasplantament. 2003; 3(9):1121–7. PMID: 12919092.

43. Yannaraki M, Rebibou JM, Ducloux D, Saas P, Duperrier A, Felix S, et al. Marcadors moleculars citotòxics urinaris per a un diagnòstic no invasiu en el rebuig agut del trasplantament renal. Transplant international: revista oficial de la Societat Europea de Trasplantament d'Òrgans. 2006; 19(9):759–68. https://doi.org/10. 1111/j.1432-2277.2006.00351.x PMID: 16918537.

44. Yang JYC, Verleden SE, Zarinsefat A, Vanaudenaerde BM, Vos R, Verleden GM, et al. L'ADN lliure de cèl·lules i el CXCL10 derivats del rentat broncoalveolar prediuen la supervivència del trasplantament pulmonar. J Clin Med. 2019; 8(2). Epub 20/02/2019.

45. Faddoul G, Nadkarni GN, Bridges ND, Goebel J, Hricik DE, Formica R, et al. Anàlisi de biomarcadors durant els dos anys inicials posteriors al trasplantament i els 5-anys de resultats del trasplantament renal: resultats dels assaigs clínics en el trasplantament d'òrgans-17. Trasplantament. 2018; 102(4):673–80. Epub 01/12/2017.

46. ​​Hricik DE, Nickerson P, Formica RN, Poggio ED, Rush D, Newell KA, et al. Validació multicèntrica de CXCL9 urinari com a biomarcador estratificant de risc per a lesions de trasplantament renal. Revista americana de trasplantament: revista oficial de la Societat Americana de Trasplantament i la Societat Americana de Cirurgians de Trasplantament. 2013; 13(10):2634–44. Epub 24/08/2013.

47. Kotsch K, Kunert K, Merk V, Reutzel-Selke A, Pascher A, Fritzsche F, et al. Els nous marcadors en biòpsies renals d'hora zero indiquen la qualitat de l'empelt i el resultat clínic. Trasplantament. 2010; 90(9):958–65. Epub 23/09/2010. PMID: 20859252.