Dinàmiques transcripcionals específiques de l'alcohol de reconsolidació i recaiguda de la memòria Part 4

A més d'Arc, vam trobar que els nivells d'ARNm d'Egr1, però no de Bdnf, es van incrementar a la DH i mPFC mitjançant la recuperació de la memòria d'alcohol.

A mesura que passa el temps, la gent va adquirint una nova comprensió del misteri de l'oblit. En aquest procés, una nova tecnologia de recuperació de memòria s'ha convertit gradualment en un punt d'investigació.

Hi ha, doncs, una relació entre la recuperació de la memòria d'alcohol i el rendiment de la memòria? Vine a fer una ullada ara! En primer lloc, hem de tenir clar: la recuperació de la memòria de l'alcohol no és una tecnologia a part. És una tecnologia que afecta les neurones cerebrals a través de l'alcohol. Aquest procés pot activar alguns records "dormints" al cervell, permetent-nos refrescar aquests records.

En segon lloc, hem de saber que millorar la memòria no ens permet simplement "recordar" més coses sinó que és un procés de recuperació i reconstrucció de records de diferents maneres. Aquest procés ens pot ajudar a consolidar i entendre millor els coneixements que hem après, millorant així la nostra memòria.

Per tant, podem concloure que hi ha una relació entre la recuperació de la memòria d'alcohol i el rendiment de la memòria. Quan utilitzem aquesta tecnologia per tornar a extreure records anteriors després de beure alcohol, estem passant per un procés de reconsolidació d'aquests records, millorant així la nostra memòria fins a cert punt.

Per descomptat, també hem de tenir en compte que la recuperació de la memòria d'alcohol no és una tècnica duradora i fiable per millorar la memòria. Si volem tenir una memòria excel·lent durant molt de temps, hem de consolidar i millorar contínuament la nostra memòria mitjançant l'estudi i la vida diària, combinats amb altres tècniques d'entrenament de la memòria.

En aquest procés, hem de mantenir una actitud optimista en tot moment, per estimular millor la nostra motivació d'aprenentatge i potencial de memòria. Per tant, afrontem l'entrenament de la memòria de manera activa, siguem nosaltres mateixos sense parar i avancem amb valentia en el camí de la millora contínua de la memòria! Es pot veure que hem de millorar la memòria, i Cistanche deserticola pot millorar significativament la memòria, perquè Cistanche deserticola també pot regular l'equilibri dels neurotransmissors, com augmentar els nivells d'acetilcolina i factors de creixement. Aquestes substàncies són molt importants per a la memòria i l'aprenentatge. A més, la carn també pot millorar el flux sanguini i promoure el lliurament d'oxigen, cosa que pot garantir que el cervell rebi suficients nutrients i energia, millorant així la vitalitat i la resistència del cervell.

Feu clic ara per millorar la memòria a curt termini

L'augment de l'expressió d'ARNm d'Egr1 s'ha implicat prèviament en la reconsolidació de records de por i drogues [19, 21, 48, 61], plantejant la possibilitat que aquest factor de transcripció també tingui un paper en la reconsolidació dels records d'alcohol.

Mentre que el paper de Bdnf en la reconsolidació de la memòria segueix sent controvertit [19, 49], se sap que la inducció de Bdnf és crucial per a l'adquisició i l'aprenentatge de l'extinció de la memòria [19, 62]. Així, la manca de canvi en l'expressió de Bdnf al nostre estudi podria suggerir que el nostre procediment de recuperació de memòria no va iniciar l'aprenentatge d'extinció en paral·lel amb la recuperació de memòria.

A més, recentment hem informat que, tot i que els nivells d'ARNm de Bdnf a la DH no augmenten per la recuperació de la memòria d'alcohol per se, l'expressió del factor de creixement es va elevar quan la recuperació va seguida d'un contracondicionament aversiu que va evitar la recaiguda [44], cosa que suggereix un paper complex de Bdnf. en la dinàmica de la memòria de l'alcohol.

Els nostres resultats indiquen que els augments de l'expressió IEG no són exclusius de la reconsolidació de records relacionats amb l'alcohol.

De fet, ARC i EGR1 estaven implicats anteriorment en la consolidació de diversos tipus de records, inclosos els records de por [19, 46, 47, 62], els records de reconeixement [21] i els records associats a diferents drogues d'abús [20, 22, 61].

Tanmateix, també hi ha proves creixents que alguns dels mecanismes subjacents a la recerca d'alcohol poden diferir dels que controlen la recerca de recompenses naturals [5, 27, 28, 63]. A més, hi ha proves que els records de diferents recompenses (i de diferents drogues, en particular) es processen de manera diferent [29-32]. Els nostres resultats de l'anàlisi RNAseq van revelar la signatura transcriptòmica única induïda per la recuperació de la memòria d'alcohol.

Concretament, vam trobar 44 gens a la DH i un conjunt diferent de 9 gens en ells PFC, que van mostrar canvis significatius després de la recuperació de la memòria d'alcohol. Després d'una validació de dades addicional, ens vam centrar en un gen del mPFC (Fkbp5) i tres gens del DH (Adcy8, Scl8a3 i Neto1) i vam trobar que la seva expressió no es veia afectada per la recuperació de records associats a sacarosa.

Això suggereix que, a diferència d'Arc i Egr1, aquests 4 gens específics probablement no tenen un paper general en el processament de records de recompensa, però més aviat poden tenir un paper selectiu en el processament de records d'alcohol.

Curiosament, aquests quatre gens estaven implicats anteriorment en el trastorn per l'ús d'alcohol i l'aprenentatge i la memòria. Així, Fkbp5 codifica la proteïna d'unió FK506 5, un regulador del sistema neuroendocrí de l'estrès [64].

Les variants de FKBP5 modulen la gravetat de la síndrome d'abstinència d'alcohol [65] i prediuen la propensió de beure excessiva en humans [66–68]. Es va demostrar que la supressió de Fkbp5 augmentava la gravetat de l'abstinència d'alcohol [65] i el consum d'alcohol [67] en ratolins, mentre que la inhibició farmacològica de la proteïna va reduir el consum moderat d'alcohol i la restauració de CPP en ratolins [69] i va reduir el consum d'alcohol en rates estressades [70].

Els nivells d'ARNm d'Adcy8, que codifica l'adenilateciclasa 8 (AC8) que catalitza la formació d'AMPc en resposta a l'afluència de calci i marcat recentment com a possible regulador de la ingesta d'alcohol [28, 71], es van reduir a les cèl·lules sanguínies dels alcohòlics abstinents a llarg termini [72].

La supressió d'Adcy8 es va demostrar anteriorment per reduir el consum d'alcohol i augmentar la sensibilitat als efectes datius de l'alcohol en ratolins [73]. A més, l'exposició crònica a l'alcohol a les rates va regular l'expressió cerebral de la família de transportadors de soluts 8 (intercanviador de sodi/calci), membre 3 (NCX3), la proteïna codificada per Scl8a3 [74, 75].

El consum d'alcohol a les rates també es va associar amb una reducció de l'expressió del tronc cerebral de Neto1 [76], que codifica la neuropilina tolloide 1 (NRP1), un component del complex receptor NMDA [77].

Aquesta proteïna està implicada en la reorganització sinàptica i la transmissió a l'hipocamp [78] i és necessària per a l'aprenentatge espacial i la memòria [77].

Així, els nostres resultats mostren que la mera recuperació de records d'alcohol, fins i tot sense cap efecte farmacològic de l'alcohol, afecta l'expressió d'aquests gens. No obstant això, el seu paper específic en la reconsolidació de la memòria i la recaiguda de l'alcohol encara està per provar.

Una limitació del present estudi és que l'assaig d'ARN-seq es va realitzar als teixits mPFC i DH a granel, en lloc de cèl·lules individuals activades per la recuperació de memòria. Específicament, estudis recents han suggerit que els records en general [79, 80], i específicament els records relacionats amb l'alcohol [32, 81, 82], es codifiquen mitjançant l'activació de conjunts neuronals composts per un petit nombre de neurones, que es poden identificar mitjançant marcadors d'activació neuronal. per exemple, cFOS) [80].

De fet, es van trobar patrons d'activació d'IEG (cFOS) similars mitjançant la recuperació d'alcohol condicionat per operant i records de recompensa dolça a les regions mPFC i mesolímbiques addicionals del cervell de rata [32, 81]. Per tant, és possible que la realització selectiva de l'assaig d'ARN-seq en el conjunt neuronal activat per la recuperació de memòria hauria donat resultats més precisos.

En resum, els nostres resultats suggereixen que la memòria d'alcohol recupera dos programes de transcripció paral·lels. Un programa, transmès mitjançant mecanismes moleculars comuns d'aprenentatge i memòria, inclosos els IEG Arc i Egr1, es dedica a la consolidació de memòries, en general.

L'altre programa de transcripció, llançat per la recuperació de la memòria d'alcohol, està controlat per gens que promouen específicament comportaments relacionats amb l'alcohol. Aquest model de processament dual per a memòries d'alcohol planteja la possibilitat que la reconsolidació de memòria per a diferents memòries pugui tenir mecanismes moleculars de processament dual similars, amb alguns components compartits per múltiples memòries i d'altres únics per a cada tipus de memòria.

Aquest model hipotètic encara s'ha d'avaluar per provar si la manipulació d'aquests gens afecta la reconsolidació de la memòria d'alcohol i sacarosa de manera diferent. Si és així, suggeriria que podria ser possible apuntar a objectius moleculars específics de recompensa per tractar trastorns relacionats amb les memòries patògenes, com ara l'addicció, en lloc d'interrompre els principals mecanismes moleculars essencials per a moltes funcions més enllà de la reconsolidació de la memòria de l'alcohol.

MATERIALS I MÈTODES

Vegeu la informació complementària per obtenir més informació sobre l'aparell, els fàrmacs i els reactius, el disseny i la preparació d'oligodesoxinucleòtids (ODN), les anàlisis de Westernblot i qRT-PCR i la preparació de la biblioteca d'ARN-seq.

Els animals

Els ratolins C57BL / JRccHsd mascles i femelles (25-30 g), allotjats entre 3 i 4 per gàbia, es van criar a la instal·lació d'animals de la Universitat de Tel-Aviv (Israel) i es van mantenir sota un cicle de llum-foscor de 12 hores (llums encesos a les 7 del matí), amb aliments i aigua disponibles adlibitum.

En experiments que implicaven el condicionament del lloc de sacarosa, l'accés als aliments es va restringir durant 6 hores abans de les sessions d'entrenament per augmentar la motivació dels ratolins per recollir pellets de sacarosa. Aquesta curta durada de la privació d'aliments es basa en les troballes que durant el dia, un dejuni de 2 a 6 hores no afecta el comportament d'alimentació [83] i no provoca un canvi significatiu dels marcadors inmetabòlics [84], minimitzant així els efectes de la restricció alimentària per si mateixa. .

Els ratolins es van pesar dues vegades per setmana per controlar la pèrdua de pes. Tots els protocols experimentals van ser aprovats i conformats amb les directrius del Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Tel Aviv i les directrius del NIH (número de garantia del benestar animal A{0}}). Es van fer tots els esforços per minimitzar el nombre d'animals utilitzats.

Procediments de conducta

Condicionament del lloc

Preferència de lloc condicionat amb alcohol (CPP): Tots els ratolins es van habituar a injeccions diàries de solució salina ip durant 3 dies.

Prova de referència (dia 1): el primer dia, es va retreure la porta corredissa i es va permetre que els ratolins exploressin lliurement tot l'aparell durant 30 min. Condicionament del lloc d'alcohol (dies 2-9): l'entrenament va començar 24 hores després de la prova de base amb una sessió. administrat al dia durant 8 dies, amb la porta corredissa tancada. Els dies 3, 5, 7 i 9, els ratolins van rebre alcohol (1, 8 g/kg, 20% v/v; ip) i es van confinar immediatament al compartiment aparellat durant 5 min.

Es va demostrar anteriorment que aquesta dosi i la durada del condicionament produeixen CPP induïda per l'alcohol [42, 85]. Els dies alterns (és a dir, els dies 2, 4, 6 i 8), els ratolins van rebre una solució salina i es van confinar al compartiment no aparellat durant la mateixa durada que el dia de condicionament d'alcohol.

Els compartiments aparellats es van equilibrar. Prova de preferència de lloc 1 (dia 10): la prova de preferència de lloc va ser com es descriu per a la prova de referència i va servir per indexar l'alcohol-CPP [41]. La preferència es va definir com un augment del percentatge de temps passat al compartiment de parella d'alcohol durant la prova de preferència de lloc 1, en comparació amb la prova de referència.

Recuperació de memòria (dia 11): abans d'aquesta etapa, els ratolins es van assignar a diferents condicions experimentals (combinades per puntuacions de CPP i sexe). Durant una sessió de recuperació de memòria, els ratolins es van confinar al compartiment de parella d'alcohol durant 3 minuts i després van tornar a les seves gàbies de casa. Els ratolins control es van manipular breument. Prova de preferència de lloc 2 (dia 12): els ratolins es van sotmetre a una prova de preferència de lloc idèntica a la prova de preferència de lloc 1.

Sacarosa CPP: entrenament previ a la sacarosa (dies 1-6): els dies 1-3, els ratolins es van acostumar a recollir 5-6 pellets de sacarosa (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, EUA) a les gàbies domèstiques. . Els dies 4 i 6, els ratolins van ser entrenats per recollir 3 grànuls en una caixa de plexiglàs buida durant les sessions de 30-minuts. Els ratolins que van recollir menys de sis pellets (d'un total de nou pelets durant els 3 dies) durant l'entrenament amb sacarosa van ser exclosos de l'experiment (2 ratolins de 32).

Prova de referència (dia 7): el setè dia, es va retreure la porta corredissa d'una cambra CPP i es va permetre que els ratolins exploressin tot l'aparell durant 30 min. Aquí també es va adoptar un enfocament imparcial d'aparells/assignació imparcial, tal com es descriu al procediment de CPP d'alcohol. porta tancada. Els dies 9, 11, 13 i 15, es van col·locar ratolins al compartiment aparellat i, un minut més tard, es van escampar tres pellets de sacarosa al terra.
Els ratolins van ser retornats a les seves gàbies de casa 15 minuts més tard. Els dies alternatius (és a dir, els dies 8, 10, 12 i 14), els ratolins es van col·locar al compartiment no aparellat durant 15 minuts sense interferències.

Els compartiments aparellats es van equilibrar. Prova de preferència de lloc 1 (dia 16): la prova de preferència de lloc va ser com es descriu per a la prova de referència i va servir per indexar la sacarosa-CPP. La preferència es va definir com un augment del percentatge de temps passat al compartiment aparellat amb sacarosa durant la prova de preferència de lloc 1, en comparació amb la prova de referència. Recuperació de memòria (dies 17): el procediment de recuperació de memòria de sacarosa era idèntic al procediment de recuperació de memòria d'alcohol (vegeu més amunt). ).

Validació d'oligodesoxinucleòtids (ODN).

El disseny ODN antisentit d'arc (AS-ODN) i ODN codificat (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) va seguir les directrius descrites anteriorment [56, 86].

Validació funcional d'Arc AS-ODN. Arc AS-ODN (2 nmol/µl, 0,5 µl, 0,25 µl/min) es va infondre al DH en un hemisferi i SCR-ODN (2 nmol/µl, { {9}},5 µl, 0,25 µl/min) es va infondre a l'altre hemisferi (els costats estaven contrapesats). Dues o quatre hores més tard, els ratolins tractats van explorar un context desconegut (compartiment CPP, vegeu la descripció de l'aparell, més amunt) durant 5 minuts per induir l'expressió ARC depenent de la novetat. Els ratolins van ser eutanitzats una hora més tard (és a dir, 3 o 5 hores després de la infusió d'ODN), es van recollir teixits cerebrals i es van avaluar els nivells de proteïna ARC mitjançant l'anàlisi de Western Blot (figura S4).

Cirurgia i microinfusió intrahipocampal La cirurgia i les microinfusions es van realitzar tal com es va descriure anteriorment[42, 87].

Cirurgia. Les cirurgies estereotàxiques es van realitzar sota anestèsia amb isoflurà. Els ratolins es van col·locar en un marc estereotàxic (RWD Life Science, Shenzhen, Xina) i les cànules de guia bilaterals (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, EUA) es van dirigir al DH a les coordenades següents (−2 mm posterior al bregma, ±1,3 mm mediolateral, −1,45 mm ventral a la superfície del crani). Les cànules es van fixar amb acrílic dental. Es van inserir cànules simulades coincidents (Plastics One Inc., Roanoke, VA, EUA) a les cànules guies i es van recobrir amb gots de pols per mantenir el lloc de l'injector cobert i net de residus. Els ratolins es van permetre recuperar durant 7-10 dies abans de l'entrenament amb alcohol-CPP.

Infusions intrahipocampals. Actinomicina D (4 µg/µl, 0,5 µl per costat, 0,25 µl/min, en DMSO) [19] o un volum equivalent de vehicle es va microinjectar al DH immediatament després de la recuperació de la memòria . Es va demostrar que la infusió d'actinomicina D a l'hipocamp a una concentració similar pertorba la reconsolidació de la memòria [19]. Arc AS-ODN o control SCR-ODN (2 nmol/µl, 0,5 µl/costat, 0,25 µl/min; en PBS) es va microinjectar al DH 4 hores 2 h abans o 4 h després de la recuperació de la memòria.

Després d'eliminar la tassa de pols i les cànules simulades, es va realitzar una microinfusió durant 2 minuts a ratolins despertats suaument, utilitzant cànules d'injecció (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, EUA) que s'estenen 0,5 mm més enllà de la guia. punta de cànula. Les cànules d'injecció es van deixar al seu lloc durant 2 minuts més. Després de la infusió, es van inserir cànules simulades a les cànules guia, assegurades amb la tassa de pols i els animals van tornar a les seves gàbies. Les localitzacions de cànules es van verificar en seccions coronals de 30 μm de gruix de teixit fixat amb paraformaldehid tenyits amb violeta de cresil.

Anàlisi de dades

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >El 75% del temps en qualsevol dels compartiments durant la prova de referència van ser exclosos de l'estudi (9 de 267). L'establiment de CPP es va confirmar comparant les puntuacions de CPP entre la prova inicial i la prova 1 de CPP i es va analitzar mitjançant una prova t aparellada. Com que l'expressió de CPP (és a dir, formació de memòria) és necessària per a la recuperació de la memòria, les dades dels ratolins que no mostraven CPP (un augment mínim del 5% en la preferència entre la línia de base i la prova 1) es van excloure de l'experiment (48 de 258).

L'alcohol-CPP després de la interferència amb la reconsolidació de la memòria es va analitzar mitjançant un ANOVA de model mixt amb un factor de tractament entre subjectes (Actinomicina D o ODN) i un factor de prova dins dels subjectes (prova CPP 1, prova CPP 2). Les interaccions significatives es van analitzar mitjançant una prova post hoc de Student–Newman–Keuls. Les densitats dels nivells de proteïna ARC immunoreactiva Western blot es van normalitzar als GAPDH i es van analitzar mitjançant un ANOVA unidireccional amb un factor de tractament entre subjectes, seguit de la prova post hoc de Dunnett. Les dades d'expressió d'ARNm de qRT-PCR es van normalitzar a Gapdh i es van expressar com a percentatge d'expressió d'un grup control.

Les dades de tots els gens de cada regió cerebral es van analitzar mitjançant un ANOVA unidireccional amb un factor de tractament entre subjectes, seguit de la prova de Dunnett per a cada gen, per comparar-les amb les dades obtingudes d'un grup de control (sense recuperació). Per a ARN-seq, vam reunir teixits de 3 animals per a cada rèplica i vam preparar el següent nombre de rèpliques: 3 per a l'hipocamp dorsal (DH) - sense recuperació, 2 per a la recuperació de DH, 3 per a l'escorça prefrontal (PFC) - sense recuperació i 2 per a ( PFC)-recuperació. Després de l'aïllament total de l'ARN amb Trizol, es van generar biblioteques de seqüenciació mitjançant el mètode que hem desenvolupat [88].

Les biblioteques es van sotmetre a una seqüenciació d'un sol extrem de 50 pb amb IlluminaHiseq 2000. Després de confirmar la qualitat de les dades de seqüenciació per FastQC, les lectures es van mapar al genoma de referència mm9 mitjançant Bowtie2 [89] i es van anotar amb Tophat2 [90].

Les lectures assignades als gens es van quantificar mitjançant FeatureCounts [91]. Vam excloure Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a i el cromosoma tematocondrial per evitar recomptes de gens sobreamplificats que podrien esbiaixar la normalització de la biblioteca tal com es va descriure anteriorment [92]. DESeq2 [58] es va utilitzar per identificar gens expressats de manera diferencial (DEG) al grup de recuperació, en comparació amb el grup de control sense recuperació, amb un valor p ajustat per tall de significació (p(adj) <0.05).

DISPONIBILITAT DE DADES Les dades d'RNA-seq estan disponibles a NCBI Gene Expression Omnibus a https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) amb un testimoni de revisor: knyfwwiorbutvuv.

REFERÈNCIES

1. Collins PY, Patel V, Joestl SS, March D, Insel TR, Daar AS, et al. Grans reptes de salut mental global. Naturalesa. 2011;475:27–30.

2. Heilig M, Egli M. Tractament farmacològic de la dependència a l'alcohol: símptomes diana i mecanismes diana. Teràpia farmacològica. 2006;111:855–76.

3. Sinha R. Noves troballes sobre factors biològics que prediuen la vulnerabilitat a la recaiguda de l'addicció. Curr Psiquiatria Rep. 2011;13:398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Reactivitat als estímuls relacionats amb l'alcohol al laboratori i al camp: predictors de craving en alcohòlics tractats. Addicció.2000;95:889–900.

5. Barak S, Liu F, Ben Hamida S, Yowell QV, Neasta J, Kharazia V, et al. La interrupció dels records relacionats amb l'alcohol per inhibició de mTORC1 evita la recaiguda. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Milton AL. Beguda, drogues i interrupció: manipulació de la memòria per al tractament de l'addicció. Curr Opin Neurobiol. 2013;23:706–12.

7. Nader K, Hardt O. Un estàndard únic per a la memòria: el cas de la reconsolidació. NatRev Neurosci. 2009;10:224–34.

8. Dudai Y. Reconsolidació: l'avantatge d'estar reorientat. Curr Opin Neurobiol. 2006;16:174–8.

9. Przybyslawski J, Sara SJ. Reconsolidació de la memòria després de la seva reactivació. Comportament. Cervell Res. 1997;84:241–6.

10. Nader K, Schafe GE, Le Doux JE. Els records de la por requereixen la síntesi de proteïnes a l'amígdala per a la reconsolidació després de la recuperació. Naturalesa. 2000;406:722–6.

For more information:1950477648nn@gmail.com