El silenciament MiR-103a-3p millora la dipòsit d'oxalat de calci al ronyó de rata activant l'eix UMOD/TRPV5

2.10. Anàlisi bioinformàtica i assaig de luciferasa.

UMOD-MiRNA orientat, miR-103a-3p, va ser analitzat de manera previsible pelLloc web de TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)i després es va validar mitjançant un assaig de luciferasa. control pGL3-els vectors (E1741) es van comprar a Promega (EUA) aconstruir el tipus salvatge d'UMOD (UMOD-WT, 5′-AGCCUGUGUCUUUAAAUGCUGCU-3′) i el tipus mutantd'UMOD (UMOD-MUT, 5′-AGCCUGUGUCUUUAAAUGAUCCU-3′). Es van cotransfectar cèl·lules NRK-52EmiR-103a-3p imitació i UMOD-WT o miR-103a-3pmimic i UMOD-MUT amb l'ajuda de Lipofectamine2000. El procediment idèntic es va realitzar a la mímicacontrol (vectors pRL-TK, VT1568, YouBio, Xina). Desprésaixò, vam determinar l'activitat de la luciferasa a les cèl·lules mitjançant elKit d'assaig de reporter de doble luciferasa (E1910, Promega, EUA).2.11. Establiment del Model d'Hiperoxalúria In Vivo.Per alin vivoestudi, vam establir el model de rata hiperoxalúriaafegint 1% etilenglicol (EG) (324558, Sigma-Aldrich,EUA) a l'aigua potable. L'experiment amb animals va seraprovat pel Comitè d'Animals de Laboratori de TheTercer AffiHospital vinculat de la Universitat Mèdica de Xinxiang(IHRM20200510). Un total de 40 homes Sprague Dawley (SD)rates (8 setmanes, 180–210 g) comprat a Charles RiverEs van utilitzar laboratoris (Beijing, Xina).in vivoestudiar. Totsles rates es van dividir en 4 grups de control, EG, EG + antagomir, i EG + antagomir-NC, amb deu rates a cada grup.Durant l'allotjament, al grup control, només es van proporcionar les ratesamb aigua de l'aixeta; al grup EG, es van tractar les ratesamb 1% EG; al grup EG + antagomir, les rates erentractat amb un 1% d'EG i injectat per via intravenosa amb miR-103a-3p antagomir; i al grup EG + antagomir-NC,les rates es van tractar amb un 1% d'EG i es van injectar per via intravenosaamb miR-103a-3p antagomir-NC. Després de 4 setmanes, totes les rateseren sacresfiprovocat per luxació cervical sota anestèsia(pentobarbital sòdic, 40 mg/kg, P-010, Merck, EUA) iEs van recollir teixits renals per a un estudi histològic. ElEls antagòmirs miR-103a-3p utilitzats en aquest experiment erenobtingut de Ribobio (Guangzhou, Xina).

NOVA FORMULACIÓ D'HERBES PERTEIXITS RENOLÓS

2.12. Tinció d'hematoxilina-eosina (HE).

Els teixits renals fixats amb formalina es van incrustar en parafina per a l'avaluació de la deposició de CaOx. Les mostres seccionades es van desparafinar i es van hidratar abans de la tinció amb HE. A continuació, es va utilitzar el kit de tinció HE (C0105S, Beyotime, Xina) per tractar les mostres guiat per les instruccions d'operació. Després de segellar els teixits, es va observar l'àrea de deposició de cristalls sota un microscopi polaritzador (Axio Scope.A1, Precise Instrument, Xina) amb un augment de ×100 i es va quantificar mitjançant ImageJ (visió 1.8.0, National Institutes of Health, EUA).

Figura 5: Continuació.

Figura 5: el silenciament miR-103a-3p va activar l'eix UMOD/TRPV5 per atenuar les cèl·lules NRK-52E de la lesió induïda per oxalat. (a) Es va determinar l'efecte de l'inhibidor de miR-103a-3p sobre la viabilitat cel·lular en cèl·lules NRK-52E tractades amb oxalat, plasmidi que sobreexpressa TRPV{5-i siUMOD mitjançant assaig MTT. ( b ) Es va utilitzar l'assaig d'adhesió de cèl·lules cristal·lines per quantificar la deposició de CaOx a les cèl·lules especificades (ampliació × 200, barra d'escala=200 μm). (c) El kit Fluo-4 AM va analitzar la mesura del contingut de Ca2+ en diferents grups. ∗∗∗p < 0:001 contra oxalat; ###p <0:001 vs. oxalat + TRPV5 + siNC + IC; ∧∧p < 0:01 i ∧∧∧p < 0:001 vs. oxalat + TRPV5 + siUMOD + IC. TRPV5: subfamília V del canal catiònic potencial del receptor transitori membre 5; UMOD: uromodulina; MTT: bromur de metil tiazolil difenil-tetrazoli; NC: control negatiu; siUMOD: petit ARN interferent contra UMOD; I: inhibidor; IC: control d'inhibidors.

2.13. Immunohistoquímica (IHC).

Per estudiar la distribució de TRPV5 als teixits renals, hem utilitzat el Super Plus™ High Sensitive and Rapid Immunohistochemical Kit (E-IR R221, Elabscience, Xina) per dur a terme IHC. En resum, es van tractar seccions de ronyó (4 μm) amb tampó de recuperació d'antigens/desparafinats durant 30 min en escalfament i posteriorment es van incubar amb el tampó de bloqueig de peroxidasa SP Reagent B a temperatura ambient durant 15 min. Després del rentat de PBS, les seccions es van fer reaccionar amb anticossos anti-TRPV5 (ab137028, 1/100, Abcam, Regne Unit) a 37 graus C durant 2 h, seguit d'incubació d'anticossos secundaris. Després d'això, es van requerir les seccions per al desenvolupament del color a la solució de treball DAB i la tinció en tampó d'hematoxilina. Després del tractament de reblau, les imatges de tinció es van capturar mitjançant un microscopi (CX23, Olympus, Japó) amb un augment de ×100.

2.14. Anàlisi estadística.

Tots els experiments es van repetir tres vegades individualment, amb les dades de mesura descrites com a mitjana ± desviació estàndard. Les diferències comparades entre diversos grups es van analitzar mitjançant anàlisi de variància unidireccional. Es va utilitzar GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, EUA) per a l'anàlisi de dades, i un valor p <0,05 va indicar una diferència estadísticament significativa.

NOVA FORMULACIÓ D'HERBES PERTEIXITS RENOLÓS

3. Resultats

3.1. Regulació a l'alça de TRPV5

Cèl·lules NRK-52E protegides deLesió induïda per oxalats. Basat en el paper fonamental de TRPV5 en la regulació del transport de Ca2+cèl·lules tubulars renals, primer vam realitzar la sobreexpressió TRPV5 a les cèl·lules NRK-52E. Com es demostra a la figura 1 (a), es va detectar un augment significatiu del nivell d'ARNm de TRPV5 mitjançant qRT-PCR (p <0:001). Western blot també ha mesurat l'alt nivell de proteïna TRPV5 a les cèl·lules transfectades (figura 1 (b), p <0:001). Després del tractament amb oxalat a les cèl·lules NRK-52E, vam trobar que l'expressió de TRPV5 estava regulada a la baixa en comparació amb la del grup control, que es va revertir mitjançant la transfecció del plasmidi que sobreexpressava TRPV5- (Figura 1 (c), p <0:001). A més, la detecció de Western blot va presentar resultats similars (figura 1 (d), p <0:001). El següent assaig MTT va indicar que l'oxalat assisteix i la viabilitat cel·lular, que es va anul·lar parcialment desprésSobreexpressió TRPV5(Figura 1(e), p <0:05). La detecció d'adhesió de cristalls ho va demostrarSobreexpressió TRPV5va inhibir de manera sorprenent l'adhesió de CaOx induïda per l'oxalat a les cèl·lules NRK -52E (figura 1 (f)).

.

Figura 6: miR-103a-3p silenciant la deposició de CaOx induïda per EG mitigada en teixits renals in vivo mitjançant l'activació de l'eix UMOD/TRPV5. ( a, b ) La deposició de CaOx es va mesurar mitjançant la tinció d'H&E en teixits renals de rates tractades amb EG o EG i miR-103a-3p antagomir (×100 augment, barra d'escala=200 μm). ( c ) Es va utilitzar Western blot per mesurar els nivells de proteïnes d'UMOD i TRPV5 en teixits renals de rates tractades amb EG o EG i miR{{10}}a-3p antagomir. -L'actina va servir de control intern. ( d ) L'anàlisi IHC de l'expressió de TRPV5 es va realitzar als teixits de diferents grups (ampliació × 100, barra d'escala=200 μm). ∗∗∗p <0:001 vs. control; #p < 0:05, ###p < 0:001 contra EG + antagomir-NC. HE: hematoxilina i eosina EG, etilenglicol; TRPV5: subfamília V del canal catiònic potencial del receptor transitori membre 5; UMOD: uromodulina; NC: control negatiu; IHC: immunohistoquímica

3.2. Inducció d'oxalat

Expressió UMOD regulada a la baixa que es va associar positivament amb l'enriquiment de TRPV5 a la superfície cel·lular. Es va trobar que l'expressió d'ARNm d'UMOD estava regulada a la baixa a les cèl·lules NRK-52E induïdes per oxalat (figura 2 (a), p <0:001), així com el seu nivell de proteïna (Figura 2(b), p <0:01). Els resultats de CoIP van verificar que UMOD estava considerablement coimmunoprecipitat per TRPV5 etiquetat amb bandera i, per contra, TRPV5 va ser coimmunoprecipitat per anti-UMOD (Figura 2 (c)). A continuació, hem preregulat l'expressió UMOD a les cèl·lules NRK-52E que es va verificar mitjançant qRT-PCR i Western blot. La notable elevació de l'expressió UMOD determinada en l'ARNm (figura 2 (d), p <0:001) i els nivells de proteïnes (figura 2 (e), p <0:001) va significar l'èxit de la transfecció. A més, els resultats de l'assaig de biotinilació de la superfície cel·lular van revelar que TRPV5 era molt en abundància a la superfície de cèl·lules NRK- 52E cotransfectades amb sobreexpressió UMOD i TRPV5, en comparació amb el seu control negatiu (Figura 3 (a)).

3.3. UMOD

Regulació del paper protector de TRPV5 en cèl·lules induïdes per oxalat. (Figura 3 (a)). Per desvelar la interacció d'UMOD i TRPV5 a les cèl·lules NRK-52E induïdes per oxalat, vam realitzar la transfecció de siUMOD. QRT PCR va determinar que l'ARNm UMOD s'expressa a un nivell baix a les cèl·lules transfectades amb siUMOD (figura 3(b), p <0:001) i un resultat similar en el seu nivell de proteïna es va mesurar mitjançant Western blot (figura 3 (c), p <0:001). Posteriorment, els assajos de MTT i d'adhesió de cristalls van demostrar que siUMOD va compensar notablement l'efecte promotor de TRPV5 sobre la viabilitat cel·lular (Figura 3 (d), p <0:01) i l'efecte inhibidor de TRPV5 sobre l'adhesió de CaOx (Figura 3 (e)) en cèl·lules NRK-52E induïdes per oxalat. A més, vam mesurar el contingut de Ca2+ després de transfeccions divergents. Tal com es descriuen els resultats a la figura 3 (f), TRPV5 va restringir notablement la reducció induïda per oxalat de la concentració intracel·lular de Ca2+ de cèl·lules NRK-52 E, que es va restaurar parcialment amb l'addició de Simon (p <0: 001).

3.4. miR-103a-3p

UMOD dirigit i està mediat en la regulació de l'eix UMOD/TRPV5 en cèl·lules induïdes per oxalat. Amb l'ajuda del lloc web TargetScan, el resultat de la predicció gènica va manifestar que miR-103a-3p pot contenir llocs d'unió per a UMOD (figura 4 (a)). Aleshores, l'assaig de luciferasa va detectar l'activitat de la luciferasa suprimida a les cèl·lules cotransfectades amb miR-103a{-3p mimic i UMOD WT (Figura 4 (b), p <0:{{21} }}01). Per esbrinar l'efecte regulador de miR{{10}}a-3p a UMOD, hem implementat la inhibició de miR{- 103a-3p a NRK{{14} }Cèl·lules E, amb la detecció de qRT-PCR que confirma que l'expressió de miR-103a-3p estava fortament regulada a la baixa després de la transfecció de l'inhibidor de miR{- 103a-3p ( Figura 4(c), p <0:001). Curiosament, es va demostrar que l'expressió d'ARNm d'UMOD estava elevada després de la inhibició de miR-103a-3p, que es va anul·lar visiblement amb l'addició de silenciament UMOD (figura 4 (d), p <0:01). ). Mitjançant la detecció de Western blot, es va trobar que l'alteració de l'expressió de la proteïna UMOD era la mateixa que les que es produeixen en l'expressió d'ARNm UMOD (figura 4 (e), p <0:01). A més, vam realitzar experiments de rescat sobre les funcions cel·lulars. Com s'ha demostrat, el paper regulador de l'eix UMOD/TRPV5 en la viabilitat cel·lular (Figura 5 (a), p <0:001), l'adhesió de CaOx (Figura 5 (b)) i la concentració intracel·lular de Ca2+ (Figura 5 (b)) 5(c), p <0:01) es va revertir sorprenentment amb l'inhibidor de miR- 103a-3p.

3.5. miR-103a-3p

Silenciar la deposició de CaOx mitigada induïda per EG en teixits renals in vivo mitjançant l'activació de l'eix UMOD/TRPV5. Per reforçar encara més les nostres troballes in vitro, vam construir el model de rata d'hiperoxalúria per a l'estudi in vivo. Tal com s'il·lustra a les figures 6 (a) i 6 (b), es va observar una deposició substancial de cristalls de CaOx als teixits renals del grup EG en comparació amb la del grup control i aquesta tendència es va invertir amb miR-103a{{ 5}}p Santiagomir (p <0:001). Aleshores, els resultats de Western blot van indicar que EG va reduir fortament els nivells de proteïnes UMOD i TRPV5, que es va restaurar notablement per l'antagomir miR-103a- 3p (figura 6 (c), p <0:05). ). Per IHC, ens vam adonar que l'expressió TRPV5 estava regulada a la baixa al grup EG en comparació amb el grup control i es va regular al grup EG + antagomir en comparació amb el grup EG + antagomir-NC (Figura 6 (d)).

4. Discussió

En el context de tractaments quirúrgics cada vegada més diversos contra els càlculs renals, el que cal subratllar rau en mètodes destacats per prevenir-ne l'aparició i la recurrència [27]. El component més comú dels càlculs renals són els cristalls de CaOx. Molts factors influeixen en el desenvolupament de càlculs renals continguts en Ca2+-, i la hipercalculiúria és, amb diferència, el principal factor de risc reconegut [28]. Tsuruoka et al. va demostrar que a través dels túbuls renals, la reabsorció reduïda de Ca2+ és fonamental en la inducció de la hipercalciuria i que la reabsorció activa de calci podria estar regulada per diversos factors [29]. Més tard, Worcester et al. va proposar que els nivells urinaris postprandials de Ca2+ eren molt més alts en pacients amb hipercalciuria en comparació amb els controls, fins i tot quan la secreció d'hormona paratiroïdal en sang i la càrrega renal estaven al mateix nivell [30]. En conjunt, s'observa que la reabsorció tubular renal deteriorada pot ser la principal raó de la hipercalciuria. Per tant, aquest estudi va explorar el mecanisme molecular subjacent que regula els nivells urinaris de Ca2+ des de la perspectiva de la reabsorció de Ca{2+, per proposar canals transcendentals per prevenir i tractar els càlculs renals.

TRPV5 actua com un canal de Ca2+ epitelial tubular renal que media el transport i la reabsorció de Ca2+ al ronyó [31]. Jang et al. va assenyalar que l'expressió de la proteïna TRPV5 es va reduir obertament als teixits renals de rates úriques amb hipercalcèmia, però es va restaurar mitjançant l'administració d'hidroclorotiazida, cosa que indica que el mecanisme de tractament amb hidroclorotiazida per a la hipercalciuria es pot aconseguir mitjançant la regulació de l'expressió de la proteïna TRPV5 als teixits renals [32]. Els estudis han validat que l'oxalúria elevada indueix la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS), danya les cèl·lules epitelials tubulars renals i altera l'estructura de la fosfatidilserina a la membrana cel·lular, donant lloc a l'adhesió de CaOx a la superfície de les cèl·lules epitelials tubulars renals [33]. A la investigació anterior, vam descobrir que TRPV5 reduït notablement va aparèixer després d'haver induït una lesió de cèl·lules NRK-52E per oxalat, la tendència de la qual es va invertir després de la transfecció de la sobreexpressió de TRPV5. A més, la regulació de TRPV5 va millorar la viabilitat cel·lular i va inhibir l'adhesió de CaOx a les cèl·lules NRK-52E induïdes per oxa tarda, cosa que indica que TRPV5 genera un efecte preventiu crític sobre la formació de càlculs de CaOx induïda per oxalat al ronyó.

CISTANCHE PER A MILLORAR OXALAT DE CALCI

Com a canal principal per a la reabsorció de Ca2+, l'activitat i l'expressió de TRPV5 podrien estar regulades per múltiples factors [34]. Per exemple, un estudi recent va confirmar que UMOD prevé la formació de càlculs renals estimulant la reabsorció de Ca2+ mitjançant TRPV5 [35]. A més, es va observar que el 87,5% dels ratolins amb eliminació d'UMOD van formar càlculs d'oxalat de calci i fosfat de calci a la CNT, la medul·la renal i les papil·les als 15 mesos d'edat. Totes aquestes troballes van suggerir que UMOD podria interactuar amb TRPV5 en la formació de càlculs renals, cosa que encara no s'ha confirmat. Tanmateix, el nostre estudi va identificar per primera vegada l'existència de la interacció que UMOD regulava positivament el funcionament de l'expressió TRPV5 a les cèl·lules NRK-52E lesionades reforçant la viabilitat cel·lular, reduint l'adhesió de CaOx i millorant la reabsorció de Ca{{12} }.

Els miRNA estan implicats en el desenvolupament i la progressió de les malalties renals mitjançant la seva regulació dirigida dels ARNm. Es va trobar que miR-21 contribueix a la lesió de cèl·lules tubulars renals induïda per oxalat mitjançant la regulació positiva de PPARA [36]. A més, Jiang et al. va informar que la inhibició de miR-155-5p per regular l'expressió de MGP podria atenuar de manera observable la lesió per estrès oxidatiu induïda per oxalat al ronyó [37]. No obstant això, s'han dedicat pocs estudis a determinar el mecanisme de regulació de miRNA en UMOD que afecta la formació de càlculs renals. Per obtenir més informació sobre la patogènesi d'aquesta malaltia, aquest estudi va utilitzar l'anàlisi bioinformàtica i l'assaig de la luciferasa per trobar el miRNA, miR-103a-3p, que podria regular l'UMOD. En la investigació de malalties renals, s'ha confirmat que el cicle miR-103a-3p té un impacte profund en la inflamació renal i la fibrosi [38]. Peters et al. també va suggerir que miR-103a-3p es podria considerar un biomarcador potencial en la malaltia renal crònica [39]. En el nostre estudi, curiosament, vam verificar el mecanisme molecular de miR-103a-3p en càlculs renals que el silenciament de miR{- 103a-3p podria alleujar la lesió induïda per oxalat en Cèl·lules NRK-52E activant l'eix UMOD/TRPV5. A més, vam demostrar aquest mecanisme regulador encara més fortament mitjançant experiments in vivo en models de rates induïts per EG. Tanmateix, hi ha una manca de consideració en aquest estudi, ja que implica un sol tipus de cèl·lula i un nombre relativament reduït de variables d'estudi en els experiments in vitro.

CISTANCHE PER A MILLORAR OXALAT DE CALCI

5. Conclusions

En general, el nostre estudi actual va revelar que el silenciament de miR-103a-3p millora la deposició de CaOx al ronyó de rata mitjançant l'activació de l'eix UMOD/TRPV5, que estableix una nova base teòrica per a estratègies de prevenció, diagnòstic i tractament. cap als càlculs renals des de la perspectiva de la reabsorció de Ca2+.

Disponibilitat de les dades Els conjunts de dades analitzats generats durant l'estudi estan disponibles a l'autor corresponent a petició raonable.

Conflictes d'interessos Els autors declaren que no hi ha cap conflicte d'interessos pel que fa a la publicació d'aquest article.

Referències

[1] RE Hautmann i M. Straub, "Càlculs urinaris. Metabolisme i diagnòstic", Urologe A, vol. 45, núm. 4, pàgs. 181–184, 2006. [2] Z. Kirkali, R. Rasooly, RA Star i GP Rodgers, "Urinary stone disease: progress, status, and needs", Urologia, vol. 86, no. 4, pàgines 651–653, 2015.

[3] AL Rodgers, "Raça, ètnia i urolitiasi: una revisió crítica", Urolithiasis, vol. 41, núm. 2, pàgines 99–103, 2013.

[4] K. Sakhaee, "Avenços recents en la fisiopatologia de la nefrolitiasi", Kidney International, vol. 75, núm. 6, pàgines 585–595, 2009.

[5] T. Knoll, AB Schubert, D. Fahlenkamp, ​​DB Leusmann, G. Wendt-Nordahl i G. Schubert, "Urolithiasis through the ages: data on more than 200,000 urinary stone analysis," The Journal of Urology, vol. 185, núm. 4, pàg. 1304–1311, 2011. [6] T. Mitchell, P. Kumar, T. Reddy, et al., "Dietary oxalate and kidney stone formation", American Journal of Physiology. Fisiologia Renal, vol. 316, núm. 3, pàgines F409–f413, 2019. [7] SR Khan, MS Pearle, WG Robertson, et al., "Pedres renals", Nature Reviews. Disease Primers, vol. 2, no. 1, pàg. 16008, 2016.

[8] CY Pak, HJ Heller, MS Pearle, CV Odvina, JR Poindexter i RD Peterson, "Prevenció de la formació de càlculs i la pèrdua òssia en la hipercalciuria d'absorció mitjançant intervencions dietètiques i farmacològiques combinades", The Journal of Urology, vol. 169, núm. 2, pàgines 465–469, 2003.

[9] GC Curhan, WC Willett, EL Knight i MJ Stampfer, "Dietary factors and the risk of incident kidney stones in younger women: nurses' health study II", Archives of Internal Medicine, vol. 164, núm. 8, pàgines 885–891, 2004.

[10] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, et al., "Plantes dietàries per a la prevenció i gestió de càlculs renals: evidència preclínica i clínica i mecanismes moleculars", International Journal of Molecular Sciences, vol. 19, núm. 3, pàg. 765, 2018.