Efectes antial·lèrgics i antiinflamatoris de la neferina sobre les cèl·lules RBL-2H3

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:Els mastòcits tenen un paper molt important en l'al·lèrgia i la inflamació de la pell, incloent la dermatitis atòpica i la psoriasi. En el passat, es va trobar que la referència té efectes antiinflamatoris i antienvelliment a la pell, però el seu efecte sobre els mastòcits encara no s'ha estudiat amb detall. En aquest estudi, hem utilitzat mastocits (cèl·lules RBL-2H3) i models de ratolí per estudiar els efectes antial·lèrgics i inflamatoris de referència. En primer lloc, vam trobar que la referència inhibeix la desgranulació dels mastòcits i l'expressió de citocines. A més, vam observar que quan els mastòcits van ser estimulats per A23187/phorbol 12-mirstat-13-acetat (PMA), l'elevació del calci intracel·lular es va inhibir per referència. La fosforilació de la via MAPK/NF-KB també es redueix mitjançant el pretractament de referència. Els resultats d'estudis in vivo mostren que la referència pot millorar l'aspecte de la dermatitis i la infiltració dels mastòcits causada pel dinitroclorobencene (DNCB). A més, també es restauren les expressions de proteïnes de barrera a la pell.cistanchFinalment, es va trobar que la referència pot reduir el comportament de rascat causat pel compost 48/80. En conjunt, els nostres resultats indiquen que la referència és un molt bon producte natural antial·lèrgic i antiinflamatori. El seu efecte sobre els mastòcits contribueix al seu mecanisme farmacològic.

Paraules clau:referència; producte natural; mastòcit; dermatitis; picor

Feu clic aquí per saber-ne més

1. Introducció

Molts estudis han confirmat que les malalties al·lèrgiques són el resultat no només de l'activació immune innata sinó també de l'activació adaptativa. Entre ells, els mastòcits tenen un paper molt important en una varietat de malalties al·lèrgiques com la rinitis al·lèrgica, l'asma i la dermatitis al·lèrgica. Els mastòcits expressen receptors IgE (FceRI) a les seves membranes cel·lulars, i els receptors FceRI tenen una alta afinitat pels anticossos IgE [1,2]. Quan la IgE específica de l'antigen s'uneix a FceRI, es produeix una interacció i es produeix una reacció al·lèrgica. L'agregació de FceRI pot activar receptors de tirosina cinases, iniciar reaccions aigües avall i promoure la fosforilació de diverses proteïnes clau (com la proteïna cinasa activada per mitògens; MAPK), que finalment condueix a l'afluència d'ions calci (Ca2 plus), que és un esdeveniment clau en la desgranulació dels mastòcits [3].cistanche AustràliaEls mastòcits activats es degranulen i alliberen mediadors químics. Aquests mediadors químics utilitzats en reaccions al·lèrgiques poden causar inflamació [4], de manera que el tractament dels símptomes al·lèrgics implica inhibidors de la desgranulació dels mastòcits. Per tant, la inhibició de la desgranulació dels mastòcits mediada per IgE s'utilitza sovint per identificar nous compostos per prevenir i tractar malalties al·lèrgiques. S'ha establert que els anticossos i antígens anti-dinitrofenil (DNP) IgE poden induir reaccions d'hipersensibilitat cutània passiva (PCA) com a model típic in vivo d'hipersensibilitat immediata i com a fàrmac d'investigació per al potencial d'al·lèrgies anti-antigèniques [5,6] ]. A més, la desgranulació dels mastòcits també pot ser causada per estimulants no immunes, com els compostos 48/80 i A23187. El ionòfor de calci A23187, fa temps que se sap que estimula la secreció dels mastòcits amb l'alliberament de mediadors preformats, com la histamina dels seus grànuls, que serveix d'exemple [4]El compost 48/80 és un polímer mixt de p-metoxi-N-metilfenetilamina. reticulat per formaldehid, que s'utilitza àmpliament per a l'estimulació independent dels mastòcits [7,8] Per tant, s'han utilitzat habitualment quantitats adequades de compost 48/80 i A23187 com a reactius per estudiar el mecanisme de les reaccions al·lèrgiques. Segons avaluacions estadístiques, aproximadament un 15-20 per cent de la població pateix dermatitis atòpica. Tant si són nens com adults els que pateixen aquesta malaltia, sense un tractament adequat, la dermatitis atòpica pot causar malestar psicològic als pacients i carregar els seus costos de salut familiar i social [9]. Malauradament, no hi ha cap mètode de tractament adequat per curar la dermatitis al·lèrgica. Les opcions de tractament actuals encara eviten els al·lèrgens que causen malalties, i l'ús continu d'esteroides és l'estàndard d'or del tractament. Els inevitables al·lèrgens i els efectes secundaris dels fàrmacs han provocat el desenvolupament urgent de nous fàrmacs terapèutics. Els compostos naturals aïllats d'herbes i plantes medicinals són fonts potencials d'agents terapèutics per prevenir i tractar malalties inflamatòries i millorar la qualitat de vida dels pacients amb trastorns al·lèrgics.

Cistanche pot anti-envelliment

La referència prové del nucli de lotus (l'embrió de la llavor) de la planta Nelumbo nucifera i és un alcaloide important de la bisbenzilisoquinolina. Hi ha proves que la referència té una àmplia gamma de propietats farmacològiques, com ara efectes anticancerígens, antioxidants, antiinflamatoris i neuroprotectors, en moltes malalties [10-15].avantatges de cistancheKhan et al. va trobar que la referència produeix efectes anti-fotoenvelliment mitjançant la inhibició de l'augment mediat per UV dels nivells de ROS i malondialdehid (MDA) en queratinòcits i fibroblasts humans. dermatitis o altres malalties inflamatòries relacionades amb la pell[18]. Tanmateix, encara no està clar si la referència té un efecte anti-al·lèrgia cutània als mastòcits. En aquest estudi, el nostre objectiu és investigar els efectes de la referència sobre les malalties al·lèrgiques mediades per mastòcits, utilitzant línies de mastòcits humans (cèl·lules RBL-2H3) i un compost 48/{80-i anafilaxi induïda per DNCB. model de ratolins.

La referencia proviene del nucli de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existeix una evidència de la referència que té una àmplia gamma de propietats farmacològiques, com a efectes anticancerígens, antioxidants, antiinflamatoris i neuroprotectors, en moltes malalties [10-15]. Beneficis de la cistanche Khan et al. Va trobar que la referència produeix efectes anti-fotoenvejecimiento a inhibir l'augment dels nivells de ROS i malondialdehído (MDA) mediat per UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descobrim que la referència té potencial com a medicina alternativa per al tractament. de dermatitis atòpica u altres malalties inflamatòries relacionades amb la pell[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En aquest estudi, el nostre objectiu ha d'investigar els efectes de referència en les malalties alèrgiques mitjanes per mastocits, utilitzant línies de mastocitos humans (cèlules RBL-2H3) i un model de ratones amb anafilàxia inducida per compost 48/80 i DNCB. .

2. Resultats

2.1.Prova de citotoxicitat de neferina en mastòcits de rata (RBL-2H3)

Com que les cèl·lules H3-2H3 de la leucèmia basòfila de rata (RBL), un anàleg de mastòcits que allibera histamina, són cèl·lules adequades per examinar els efectes de la inflamació mediada pels mastòcits [19], hem utilitzat aquestes cèl·lules per investigar l'antial·lèrgia. efectes de referència. Primer, vam provar si la referència pot produir citotoxicitat als mastòcits. Quan les cèl·lules es tracten prèviament amb referència d'1 a 30 μM durant 24 h, la viabilitat cel·lular de les cèl·lules no es veurà afectada pel tractament de referència (figura 1).

2.2.La neferina redueix l'efecte degranulació de RBL-2H3 estimulat per diferents activadors

Les cèl·lules RBL-2H3 s'utilitzen habitualment per a estudis in vitro de desgranulació. [20-22]Estimulació de les cèl·lules RBL-2H3 amb IgE antidinitrofenol (DNP) i albúmina sèrica humana conjugada amb DNP (HSA) desencadena la desgranulació. A més, se sap que els mastòcits es degranulen en resposta a compostos sintètics, com el compost 48/80 i l'ionòfor de calci A23187, i aquests compostos s'han utilitzat com a reactius convenients per a estudis directes dels mecanismes de respostes al·lèrgiques in vitro [23, 24]. Els resultats van mostrar que el citoplasma de RBL-2H3 que no va ser activat per l'activador contenia grànuls secretors limitats.colesterol de cistancheEl tractament de referència (10 μM) per si sol no va afectar l'activitat de RBL -2 H3 (figura 2A, B). Tanmateix, l'addició de diferents activadors, inclosos el compost 48/80, A23187 i anti-DNP/IgE més DNP/HSA, va omplir clarament el citoplasma amb grànuls secretors. Sota el microscopi electrònic, es pot veure que hi ha un gran nombre de grànuls secretors al citoplasma, i alguns grànuls secretors fins i tot es fusionen amb la membrana cel·lular, donant lloc a la desgranulació (figura 2C-E). Després del pretractament amb referència 10 uM, els grànuls secretors del citoplasma es van reduir significativament (figura 2F-H). Aquests resultats indiquen que la referència pot inhibir eficaçment l'activació i la desgranulació de RBL-2H3 estimulada per l'activador.

2.3. La neferina inhibeix l'elevació de calci intracel·lular induïda per PMA/A23187- en RBL-2H3

Els ions de calci juguen el paper de missatger secundari en el procés d'activació cel·lular. A23187 és la forma més eficaç d'augmentar la penetració dels ions de calci a través de les membranes cel·lulars i estimular l'activació dels mastòcits. L'acetat de miristat de Phorbol (PMA) pot activar la proteïna cinasa Cand i augmentar els ions de calci intracel·lulars per millorar l'efecte de l'A23187. L'augment dels ions de calci als mastòcits també s'ha considerat un factor important per induir l'activació dels mastòcits de manera que afecta la desgranulació dels mastòcits i allibera més citocines i quimiocines inflamatòries.efectes secundaris de cistanche deserticola,Per tant, aquest estudi va intentar explorar si la referència pot inhibir la concentració d'ions calci en RBL-2H3 quan inhibeix la inflamació. El grup experimental es va dividir en pretractament de referència o sense durant 20 min, i es va afegir 1 mM de CaClz i PMA/A23187 per estimular i activar RBL-2H3. Els resultats experimentals van mostrar que el tractament de RBL-2H3 només amb diferents concentracions de referència no va afectar l'augment de la concentració intracel·lular d'ions calci. En el grup d'afluència de Ca2t induït per PMA/A23187-, la concentració intracel·lular d'ions calci va augmentar significativament. Les cèl·lules RBL -2H3 es van tractar prèviament durant 20 min amb referència (3 μM i 10 μM) i la concentració d'ions calci es va reduir significativament (figura 3).

2.4. La neferina va reduir l'expressió d'ARNm de citocines proinflamatòries a PMA/A23187 estimulades per RBL-2H3

La resposta immune de la pell augmentarà el nombre de mastòcits al cos, i els mastòcits produiran citocines proinflamatòries i acceleraran el progrés de la malaltia. Les citocines proinflamatòries, especialment TNF-a, IL-6, IL-1 i IL{-8, no només indueixen inflamació sinó que també provoquen infiltració de leucòcits, formació de granulomes i fibrosi tissular. PMA/A23187 actua sobre els mastòcits i els indueix a produir IL-16, IL{-6, TSLP i TNF- , provocant inflamació relacionada amb l'al·lèrgia. Per tant, vam tractar prèviament RBL-2H3 amb referència durant 20 min i vam estimular amb PMA/A23187 durant 6 h per detectar si la referència pot regular a la baixa l'expressió d'ARNm d'IL-1, IL{{ 19}}, TSLP i TNF-a. Els resultats van mostrar que en el grup tractat només amb referència, l'expressió de l'ARNm de citocines no es va veure afectada i l'expressió d'ARNm en el grup que va induir la inflamació per PMA/A23187 va augmentar significativament. En el grup tractat amb referència, es va observar que els nivells d'expressió d'ARNm d'IL-1, IL{-6, TSLP i TNF-a estaven suprimits significativament (figura 4).

2.5.La neferina inhibeix PMA/A23187-fosforilació induïda de la via MAPK a RBL-2H3

Estudis anteriors han assenyalat que els mastòcits necessiten alliberar ions de calci intracel·lulars per activar MAPK. A més, la via de senyalització MAPK regula l'expressió de monòcits, limfòcits T, limfòcits B, citocines i quimiocines, i indueix autoimmunitat. Aquest mecanisme és similar a la via d'activació de PMA/A23187. En aquest estudi, vam explorar si la referència pot participar en la regulació de les vies MAPK. Es van tractar diferents concentracions de referència (1, 3 i 10 uM) a RBL-2H3 durant 20 min i després es van estimular amb PMA/A23187 durant 30 min per induir la inflamació. Els resultats van mostrar que quan es va tractar RBL-2H3 només amb diferents concentracions de referència, l'activació de les proteïnes p38, JNK i ERK no es va veure afectada. En el grup tractat només amb PMA/A23187, vam trobar que les proteïnes p38, JNK i ERK estaven activades i tenien una fosforilació significativa. En el grup pretractat amb referència, es va observar que per a concentracions més altes de referència, la fosforilació de les proteïnes p38, JNK i ERK es va reduir significativament (figura 5A-C).

2.6. La neferina inhibeix PMA/A23187-fosforilació induïda de la via NF-B a RBL-2H3

L'expressió de citocines proinflamatòries depèn de l'activació del factor de transcripció NF-kB als mastòcits. Quan la proteïna IKB va ser fosforilada i degradada, NF-kB es va alliberar i es va migrar al nucli, unint-se amb els seus corresponents elements sensibles a l'ADN i afavorint la transcripció de mediadors proinflamatoris. Es van produir moltes citocines i quimiocines, que regulen la resposta immune, la diferenciació i la inflamació. Per tant, vam explorar si el pretractament amb referència afecta la fosforilació de proteïnes induïda per PMA/A23187. Hem tractat diferents concentracions de referència (1, 3 i 10 μM) a RBL-2H3. Després de 20 min, PMA/A23187 va estimular RBL-2H3 durant 1 h o 2 h per induir la inflamació. Els resultats van mostrar que el tractament de RBL-2H3 només amb diferents concentracions de referència no va afectar la fosforilació de IKBa i NF-KB. Quan es va utilitzar PMA/A23187 per a l'estimulació, es va observar un augment significatiu de la fosforilació d'IkBo i NF-KB. En el grup pretractat amb referència, es va trobar que la fosforilació d'IkBa (figura 6A) i NF-KB (figura 6B) es va reduir significativament.

2.7. Efecte de la neferina sobre la dermatitis atòpica induïda per 4-dinitroclorobencene (DNCB)

Un model animal per a la investigació de malalties, el DNCB és un irritant representatiu que causa dermatitis atòpica[25]. El nostre experiment utilitza un 1 per cent de dinitroclorobenceno (DNCB) dissolt en un 75 per cent d'alcohol per induir la primera etapa de resposta de sensibilització. La referència (3mg/kg i 10 mg/kg) i la dexametasona (Dexa,{{10}},2 mg/kg) dissoltes en DMSO es van administrar per via intraperitoneal el cinquè dia durant deu dies . Els dies 8, 1 i 14, es va aplicar un 0,5 per cent de DNCB com a segona etapa per induir la inflamació. Els ratolins es van dividir en quatre grups: grup control, grup DNCB, grup tractat amb referència i grup tractat amb dexametasona, i després, després de la comparació entre els grups, es van observar les diferències. Vam observar que el DNCB va induir una reacció d'inflamació de la pell atòpica a la pell dels ratolins. Després d'aplicar DNCB, es va trobar que la pell dels ratolins augmentava envermelliment i descamació. Tot això es deu a la proliferació anormal de queratinòcits, la infiltració i l'agregació de cèl·lules immunitàries. El grup tractat amb referència de 3 mg/kg i dexametasona 0,2 mg/kg durant quatre dies havia alleujat l'envermelliment. Vam continuar observant l'estat de la pell dorsal dels ratolins fins al dia 15. En comparació amb el grup control, el grup DNCB tenia condicions de pell molt vermelles i inflamades, i hi havia caspa i ferides que semblaven ser causades per picor i dolor. . Podem trobar una tendència de grau decreixent després dels tractaments de referència i dexametasona (Figura 7A). Es va utilitzar una taca de blau de toluidina per observar el nombre de mastòcits agregats. Els mastòcits semblaven morats quan es van observar al microscopi. Es pot demostrar quantitativament que molts mastòcits es van infiltrar i acumular a la dermis al grup experimental DNCB, van augmentar significativament en comparació amb el grup control. En el grup tractat amb referència i dexametasona, es va reduir la infiltració, l'agregació i el nombre de mastòcits (figura 7B, C).

2.8.La neferina millora l'expressió d'ARNm de molècules relacionades amb la barrera després del tractament de DNCB

La inflamació relacionada amb la pell causada per l'AD pot provocar una funció anormal de la barrera cutània. Si la barrera de la pell és defectuosa, és més fàcil que els antígens o els irritants penetrin a l'epidermis de la pell i entrin al cos per induir reaccions relacionades amb el sistema immunitari. Al mateix temps, es suprimirà la producció de proteïnes de diferenciació, incloses la filagrina, la loricrina i la involucrina. Per tant, restaurar la barrera de la pell danyada és molt important per prevenir i tractar l'AD [26]. En el nostre estudi, hem utilitzat referències per intervenir en el model animal de dermatitis atòpica induïda per DNCB. Després de sacrificar ratolins, el teixit de la pell dorsal es va fonamentar per a l'anàlisi RI-qPCR per avaluar si la referència pot millorar la reducció de l'expressió d'ARNm en filagrina, loricrina i involucrina després del tractament de DNCB. Els resultats van mostrar que el grup experimental DNCB havia reduït significativament l'expressió d'ARNm de filagrina, loricrina i involucrina en comparació amb el grup control. L'expressió d'ARNm de filagrina, loricrina i involucrina va augmentar significativament en el grup tractat amb referència i dexametasona en comparació amb el grup DNCB (figura 8).

A més, vam demostrar que la referència té un efecte de rascat antial·lèrgic. Hem utilitzat un agent de desgranulació de mastòcits, el compost 48/80, per induir un comportament de rascat en ratolins BALB/c. Com es mostra a la figura 9, vam trobar que el tractament de referència va inhibir el comportament de rascat causat pel compost 48/80 (50 ug/lloc). L'administració repetida de dosis més baixes i més altes de referència (3 i 10 mg/kg) durant 5 dies consecutius va reduir significativament el nombre de rascades causades pel compost 48/80.