Activitats anti-melanogèniques i antioxidants de l'extracte d'etanol de Kummerovia Striata: Kummerovia Striata regula l'activitat anti-melanogènica mitjançant la regulació a la baixa de l'expressió TRP-1, TRP-2 i MITF

RESUM

Kummerovia striata (K. striata) s'utilitza com a medicina tradicional per a la teràpia relacionada amb la inflamació. Per determinar si té activitats anti-melanogèniques i antioxidants beneficioses, hem investigat les activitats biològiques de l'extracte d'etanol de Kummerovia striata (EKS) mitjançant una varietat de sistemes de models de cultiu cel·lular i in vitro. L'activitat anti-melanogènica es va avaluar en cèl·lules de melanoma B16F10 en termes de síntesi de melanina i activitat inhibidora de la tirosinasa in vitro. Els assajos d'antioxidants es van realitzar amb sal diamoni de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) i 2,2ʹ-casino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-àcid sulfònic) (ABTS). EKS va mostrar fortes activitats antioxidants en assajos DPPH i ABTS. Els nivells de transcripció de l'ARNm i els nivells d'expressió de proteïnes de la tirosinasa, la proteïna 1 relacionada amb la tirosinasa, la proteïna 2 relacionada amb la tirosinasa i el factor de transcripció associat a la microftàlmia van disminuir de manera dependent de la dosi amb el tractament amb EKS.

A més, EKS no va afectar la viabilitat cel·lular a diferents concentracions utilitzades en aquest estudi, cosa que indica que el mecanisme d'acció de la inhibició de la síntesi de melanina mediada per EKS no implica citotoxicitat. A més, vam confirmar que l'àcid p-cumàric i la quercetina són compostos importants per a les propietats anti-melanogènesi i antioxidants de l'EKS. Col·lectivament, els nostres resultats demostren per primera vegada que EKS posseeix activitats anti-melanogèniques i antioxidants. Una avaluació i desenvolupament addicionals de l'EKS com a suplement funcional o cosmètic pot ser útil per blanquejar la pell i reduir les arrugues.

Per blanquejar, hem trobat que Cistanche té un efecte blanquejador i Cistanche és ric en vitamina C, que es considera un agent blanquejador molt eficaç. La vitamina C pot inhibir la síntesi de melanina, un tipus de melanina que pot atenuar la pell de les persones. Al mateix temps, la vitamina C també pot afavorir la producció de col·lagen, que és una substància que fa que la pell sigui més ferma i elàstica.

A més dels ingredients anteriors, Cistanche també conté una varietat d'aminoàcids i oligoelements, que també són molt beneficiosos per a la salut de la pell. Per exemple, el zinc que conté Cistanche pot ajudar a tractar l'acne i les cremades solars, alhora que prevé l'envelliment de la pell. A més, Cistanche també té un bon efecte protector sobre el fetge i el sistema immunitari.

Feu clic al producte suplementari cistanche deserticola

1. Introducció

Els estudis sobre l'envelliment extern han informat que la pell té un paper important en la identificació de l'envelliment humà [1,2]. L'envelliment de la pell es pot dividir en dos tipus: l'envelliment cronològic, que s'acompanya d'un deteriorament progressiu de l'estructura i la funció de la pell al llarg del temps, i l'altre és l'envelliment exògen (fotoenvelliment) on la textura de la pell canvia a causa de llargs temps. exposició a llarg termini a la llum solar [3,4]. Els radicals lliures i les espècies reactives d'oxigen són els components més importants que alimenten l'envelliment de la pell. Indueixen estrès oxidatiu a les cèl·lules de la pell, i les substàncies generades durant aquest procés provoquen un augment de la producció de melanina i arrugues.

La melanina es sintetitza mitjançant l'oxidació de la tirosinasa o L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) mitjançant l'activitat de la tirosinasa i la proteïna 1 relacionada amb la tirosinasa (TRP-1). Els melanòcits tenen un paper important en la protecció de la pell del dany per radiació [5,6]. La biosíntesi de melanina als melanòcits està mediada per l'enzim tirosinasa que regula la formació de L-DOPA mitjançant la hidròlisi de la tirosina i la formació de DOPA quinona mitjançant l'oxidació de DOPA [7,8]. A més, el factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF) és un factor de transcripció clau que regula la transcripció d'enzims melanogènics (és a dir, tirosinasa, TRP-1 i TRP{-2) [9,10]. La tirosinasa i la TRP-1 estan regulades transcripcionalment per MITF, que té un paper important en la via de síntesi de melanina [11,12].

Kummerovia striata (Thunb. ex Murray) Schindl (K. striata) és una planta anual autòctona de l'est d'Àsia, incloent Corea, Xina i Japó. La planta s'ha utilitzat durant molt de temps com a herba medicinal tradicional en la teràpia antiinflamatòria. Aquest estudi tenia com a objectiu analitzar les potencials activitats anti-melanogèniques i antioxidants d'un extracte d'etanol de K. striata (EKS) i els seus dos compostos. Les activitats antioxidants es van avaluar en termes de les seves activitats d'eliminació de radicals lliures utilitzant 2,2ʹ-casino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-àcid sulfònic) sal diamoni (ABTS) i 2,{{11} Assajos de }}difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). Les activitats anti-tirosinasa es van avaluar mitjançant l'assaig d'inhibició de la tirosinasa. Hem trobat que EKS i els seus compostos són candidats prometedors per al seu ús en productes cosmètics per blanquejar la pell i reduir les arrugues.

2. Materials i mètodes

2.1. Condicions de cultiu cel·lular

Les línies cel·lulars de melanoma murí B16F10 es van comprar a la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Les cèl·lules es van cultivar al medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM, Gibco, San Jose, CA, EUA) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS) i penicil·lina/estreptomicina (Gibco, EUA) en una atmosfera humidificada que contenia un 5% de CO2 a l'aire. a 37 graus.

2.2. Reactius

Els anticossos següents es van comprar de fonts comercials: anti-tirosinasa, anti-TRP-1, anti-TRP-2 i anti-MITF (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, EUA); anticossos anti- -actina i conjugats IgG-peroxidasa de rave picant de ratolí i conill (Cell Signaling, Beverly, MA, EUA).

2.3. Preparació de l'extracte de Kummerovia striata

Les parts aèries de K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler es van recollir a Gimpo, Gyeonggi, Corea del Sud el setembre de 2013 i es van identificar pel professor Joa Sub Oh, Facultat de Farmàcia, Universitat Dankook, Cheonan, Corea del Sud. S'ha dipositat un exemplar de val (G63) al Bio-center, Gyeonggido Business & Science Accelerator, Suwon, Corea del Sud. Les parts aèries de K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler (1,8 kg) es van extreure amb un 70 per cent d'EtOH (3 × 18 L) a temperatura ambient. Els extractes d'EtOH combinats es van concentrar al buit a 40 graus per produir 180 g de residu. L'extracte d'EtOH es va suspendre en aigua destil·lada i després es va repartir seqüencialment amb diclorometà (CH2Cl2), acetat d'etil (EtOAc) i butanol (n-BuOH). La fracció MC (7,52 g) es va separar mitjançant cromatografia en columna líquida [columna de vidre (7,5 × 40 cm) empaquetada amb gel de sílice (70–230 malla)] utilitzant mescles de gradient com a eluents (CH2Cl2 → MeOH).

Les fraccions eluents F001-F{006 es van obtenir a partir d'aquesta separació cromatogràfica líquida inicial. La fracció F003 es va purificar mitjançant cromatografia en columna utilitzant una columna de vidre (5, 0 × 40 cm) empaquetada amb gel ODS-C18. A continuació, la columna es va eluir amb H2O → MeOH donant lloc a set subfraccions (F007-F013). L'àcid p-cumàric (15, 2 mg) es va aïllar de F007 mitjançant cromatografia en columna líquida [columna de vidre (3, 0 × 40 cm) empaquetada amb ODS-C18] mitjançant elució en gradient (H2O → MeOH). La quercetina (13, 5 mg) es va aïllar de F004 mitjançant cromatografia en columna líquida [columna de vidre (3, 0 × 40 cm) empaquetada amb ODS-C18] mitjançant elució en gradient (H2O → MeOH). Les seves estructures es van dilucidar mitjançant una combinació de ressonància magnètica nuclear (RMN) 1D i 2D i espectrometria de masses, així com per comparació amb la literatura informada [13,14].

2.4. Procediments generals

Els espectres de RMN 1D i 2D [1H-1Espectroscòpia de correlació H (COSY), coherència quàntica única heteronuclear (HSQC) i correlació d'enllaços múltiples heteronuclears (HMBC)] es van mesurar en un Bruker Ascend III 70{ {25}} Espectròmetre RMN de MHz (Rheinstetten, Alemanya) amb tetrametilsilà com a estàndard intern. Els desplaçaments químics es van expressar com a valors δ. Els espectres de masses d'ionització per electrospray (ESI) es van obtenir en un espectròmetre de masses LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). La cromatografia en columna oberta es va realitzar mitjançant gel de sílice (gel Kiesel 60, malla 70–230 i malla 230–400; Merck) i gel ODS-C18 ODS-A (12 nm S7 μm, YMC GEL, Japó). La cromatografia en capa fina es va realitzar mitjançant gel de sílice prerevestit 60 F254 (0,25 mm, Merck) i gel de sílice prerevestit 60 RP-18 F-254S (0,25 mm, Merck), respectivament. Tots els productes químics i dissolvents eren de grau analític i s'utilitzaven sense més purificació.

2.5. Assaig de viabilitat cel·lular

Es va realitzar un assaig de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il){-2,5-difenil-tetrazoli (MTT) per determinar l'efecte de l'EKS a la cèl·lula viabilitat. Les cèl·lules de melanoma de ratolí B16F10 es van cultivar en plaques de 96-pou (1 × 104 cèl·lules/pou) i es van tractar amb EKS durant 24 h. En total, es van afegir 100 μL de medi sense sèrum que contenia una solució MTT al 10 per cent (5 mg/ml) i es van incubar durant 3 h. El medi es va eliminar i es va rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS). A continuació, es van afegir 100 μL de dimetil sulfòxid (DMSO) a cada pou i es van dissoldre en un agitador. L'absorbància es va mesurar a 540 nm mitjançant un lector ELISA (Molecular Device, EUA).

2.6. Contingut de melanina cel·lular

Les cèl·lules B16F10 es van cultivar en plaques 6-pous a una densitat d'1 × 105 cèl·lules per pou i es van incubar durant 24 h. La melanogènesi es va induir amb 100 nM d'hormona estimulant de melanòcits (-MSH). Les cèl·lules es van tractar amb arbutina (un control positiu) i EKS a diferents concentracions i es van cultivar durant 72 h. Després de rentar-se dues vegades amb PBS, es va afegir tampó de lisi [100 mM de fosfat de sodi (pH 6,8) i 0,1 mM de fluorur de fenilmetà sulfonil (PMSF), 1 per cent de Tritó X-100] i es va dissoldre a -80 graus durant 30 min. Després de la recol·lecció de cèl·lules, es va fer reaccionar NaOH 1 N que contenia un 10 per cent de DMSO a 65 graus durant 1 h per dissoldre el pellet i es va mesurar l'absorbància a 405 nm.

2.7. Assaig d'inhibició de la tirosinasa

L'activitat inhibidora de la tirosinasa es va mesurar mitjançant el mètode descrit per Yagi et al. [15]. La reacció es va dur a terme en tampó de fosfat de potassi 0,1 M (pH 6,5) que contenia 1,5 mM de L-tirosina i 1250 unitats/ml de tirosinasa de bolets. La mescla de reacció es va incubar a 37 graus durant 20 min. Les mostres de prova es van analitzar per a la inhibició de la tirosinasa mesurant el seu efecte sobre l'activitat de la tirosinasa mitjançant un lector ELISA a 490 nm. L'arbutina es va utilitzar com a control positiu.

2.8. Assaig d'activitat d'eliminació de radicals DPPH

L'activitat d'eliminació de radicals DPPH es va mesurar mitjançant el mètode descrit per Blois [16] i Ozgen et al. [17]. Breument, es van afegir 100 μL de solució de DPPH dissolts en metanol a 100 μL d'EKS, que es van diluir a la concentració requerida, i la reacció es va dur a terme a temperatura ambient durant 30 min. L'absorbància es va mesurar a 517 nm mitjançant un lector ELISA (Molecular Device, EUA). Es va utilitzar l'hidroxianisol butilat antioxidant (BHA) com a control positiu i es va determinar el valor IC50 d'EKS.

2.9. Activitat d'eliminació radical de l'ABTS

L'activitat d'eliminació de radicals ABTS es va mesurar mitjançant un mètode descrit anteriorment [18, 19]. ABTS plus es va formar barrejant una solució ABTS de 7 mM i una solució de persulfat de potassi (K2S2O8) de 2, 45 mM amb ABTS: K2S2O8 (proporció 2: 1) durant 12-16 h per formar un catió (ABTS plus). El valor d'absorbància a 734 nm era 1,35 ± 0,05. En total, 100 μL de la solució diluïda i 100 μL d'EKS diluïts a les concentracions requerides es van fer reaccionar a temperatura ambient durant 6 min, i es va mesurar l'absorbància a 734 nm mitjançant un lector ELISA. Es va utilitzar BHA, un antioxidant, com a control positiu i es va determinar el valor IC50 d'EKS.

2.10. Reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa (RT-PCR)

Les cèl·lules de melanoma B16F10 es van sembrar en plaques 6-pous a una densitat d'1 × 106 cèl·lules/pou i es van tractar amb EKS (100–400 ug/mL) durant 72 h. Per extreure l'ARN total, es va afegir reactiu Trizol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.) a cada pou per lisar les cèl·lules i es van afegir 200 μL de cloroform. A continuació, es va centrifugar la barreja a 13,000 rpm durant 20 min a 4 graus, i el sobrenedant es va barrejar amb isopropanol durant 30 min a -70 graus. Després de la centrifugació a 13,000 rpm durant 20 min a 4 graus, es va eliminar el sobrenedant i es va afegir un 70% d'aigua d'EtOH-dietilpirocarbonat a cada tub. Després de la centrifugació a 13,000 rpm durant 5 min a 4 graus, el sobrenedant es va eliminar i es va assecar a temperatura ambient.

A continuació, es va transcriure inversament 1 ug d'ARN total extret a ADNc monocatenari amb oligo dT mitjançant Taq DNA polimerasa i SuperScript®III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.). L'ADNc es va amplificar en MyGene™Series Peltier Thermal Cycler Model MG96 G (LongGene Scientific Instruments, Hangzhou, Xina) utilitzant primers específics i premescla AccuPower® Pfu PCR (Bioneer Corporation, Daejeon, República de Corea). Les condicions del cicle de PCR van ser de 5 min a 95 graus seguits de 30 cicles de 30 s a 95 graus, 30 s a 60 graus, 1 min a 72 graus i una extensió final de 10 min a 72 graus. Després de l'amplificació, els productes de PCR es van electroforitzar en gel d'agarosa a l'1,5 per cent que contenia bromur d'etidi i es van analitzar mitjançant un transil·luminador UV.

2.11. Anàlisi Western blot

Les cèl·lules de melanoma B16F10 es van cultivar en DMEM suplementat amb un 10 per cent de FBS a una densitat d'1 × 106 cèl·lules en plaques de 6-pous a 37 graus i un 5 per cent de CO2 durant 24 h. Després d'eliminar el medi de cultiu, EKS (100-400 ug/ml) diluït al medi es va tractar durant 72 h. Les cèl·lules es van rentar amb PBS, es van collir amb tampó RIPA (Sigma Aldrich) i es van centrifugar a 15, 000 rpm durant 15 min a 4 graus. Les proteïnes totals es van extreure de les cèl·lules i es van quantificar mitjançant el mètode Bradford. Les proteïnes es van separar mitjançant electroforesi en gel de dodecil sulfat de sodi-poliacrilamida al 8% i es van transferir a una membrana de nitrocel·lulosa (Whatman, Dassel, Alemanya). La membrana es va bloquejar amb un 5% de BSA durant 1 h a temperatura ambient i es va incubar durant la nit amb anticòs primari a 4 graus. A continuació, es va rentar la membrana i es va incubar amb anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa de rave durant 1 h a temperatura ambient. La membrana es va rentar i es va detectar amb SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, EUA).

2.12. Anàlisi estadística

L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant una prova t de Student amb Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, EUA). Els resultats es presenten com a mitjanes ± desviació estàndard, i p< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference. 

Fig. 1. Efectes de l'extracte etanòlic de Kummerovia striata sobre la inhibició de la tirosinasa, la viabilitat cel·lular i la síntesi de melanina (A) Es va analitzar l'activitat inhibidora de la tirosinasa de l'extracte etanòlic de Kummerovia striata (EKS) mesurant la quantitat de dopacrom generat en la reacció. L'arbutina es va utilitzar com a control positiu. (B) Contingut de melanina a les cèl·lules B16F10 estimulades amb 100 nM MSH. El contingut de melanina es va calcular com a percentatge del contingut en control. ( C ) Les cèl·lules de melanoma de ratolí B16F10 es van tractar amb EKS (25-400 ug / ml) i arbutina (400 ug / ml). La citotoxicitat de l'EKS i l'arbutina es va determinar mitjançant un assaig MTT. Els valors representen la mitjana ± SD de tres rèpliques independents. La significació estadística s'indica com a * P < 0, 05, ** P < 0, 01, en comparació amb mostres no tractades o cèl·lules tractades amb -MSH.

\

Fig. 2. Activitat antioxidant de l'extracte d'etanol de Kummerowia striata (A i B) Es va determinar l'activitat d'eliminació de radicals lliures tal com es descriu. L'activitat antioxidant es va mesurar mitjançant l'assaig d'activitat d'eliminació de radicals DPPH i la prova ABTS més de cations radicals. Es va utilitzar hidroxianisol butilat com a control positiu. Els valors representen la mitjana ± SD de tres rèpliques independents. La significació estadística s'indica com a *P <0.05, **P <0,01, en comparació amb les mostres no tractades.

3. Resultats

3.1. Efectes anti-melanogènesi de l'EKS

Per determinar les activitats anti-melanogèniques de l'EKS, vam utilitzar un assaig de tirosinasa de bolets utilitzant L-tirosina com a substrat i tirosinasa de bolets com a font enzimàtica. Atès que la tirosinasa és un enzim clau que catalitza el pas limitant de la velocitat en la biosíntesi de melanina, primer vam mesurar la capacitat inhibidora de la tirosinasa de l'EKS. Com es mostra a la figura 1A, EKS va exercir un efecte inhibidor significatiu sobre l'activitat de la tirosinasa de manera dependent de la dosi. Aquests resultats suggereixen que l'EKS va mostrar efectes inhibidors sobre l'activitat de la tirosinasa dels bolets i l'efecte inhibidor de l'EKS va ser similar al de l'arbutina utilitzada com a control positiu.

A continuació, per determinar l'efecte de l'EKS sobre la síntesi de melanina, es va quantificar el contingut de melanina de les cèl·lules de melanoma B16F10 tractades amb EKS. Com es mostra a la figura 1B, el tractament amb EKS va disminuir el contingut de melanina a les cèl·lules del melanoma de manera dependent de la dosi, cosa que indica que la disminució de la melanina cel·lular podria ser deguda a la inhibició de les activitats de la tirosinasa. A més, la investigació de l'efecte de l'EKS sobre la viabilitat de les cèl·lules del melanoma B16F10 va demostrar que l'EKS no tenia cap efecte citotòxic significatiu sobre les cèl·lules B16F10 a la concentració utilitzada (Fig. 1C). Aquestes troballes mostren clarament que l'EKS exerceix efectes anti-melanogènics mitjançant la inhibició de l'activitat de la tirosinasa i la síntesi de melanina a les cèl·lules de melanoma B16F10 sense induir citotoxicitat.

3.2. Activitat antioxidant de l'EKS

L'activitat d'eliminació de l'EKS es va determinar mitjançant radicals lliures DPPH (Fig. 2A). L'EKS va mostrar una activitat antioxidant més alta (activitat d'eliminació del=50,22 per cent, IC50=98,71 ug/ml). La capacitat d'eliminació de l'EKS també es va avaluar mitjançant un catió radical ABTS (Fig. 2B). La capacitat d'eliminació de radicals ABTS d'EKS era similar a la del control positiu BHA (capacitat d'eliminació=99,53 per cent, IC50=24,64 ug/ml). Aquests resultats indiquen que EKS té una activitat antioxidant més alta.

3.3. Efecte de l'EKS sobre l'expressió dels gens de síntesi de melanina

Per investigar els mecanismes moleculars pels quals EKS regula la melanogènesi més, vam examinar els canvis en l'expressió de gens i proteïnes melanogèniques, com la tirosinasa, TRP-1, TRP-2 i MITF, que tenen un paper fonamental. en la melanogènesi [20]. Com es mostra a la figura 3A, l'expressió d'ARNm de tirosinasa, TRP-1, TRP-2 i MITF va ser activada per -MSH; tanmateix, el tractament amb EKS va disminuir significativament l'expressió d'ARNm (100–400 ug/ml). A més, EKS va mostrar una potent activitat inhibidora similar a la de l'arbutina de control positiu. A continuació, es va avaluar l'efecte de l'EKS sobre l'expressió de proteïnes relacionades amb la melanogènesi mitjançant l'anàlisi de western blot. Com es mostra a la figura 3B, el tractament amb EKS va inhibir notablement els nivells d'expressió induïts per -MSH de tirosinasa, TRP-1, TRP-2 i MITF a les cèl·lules B16F10. En conjunt, aquestes troballes demostren que els efectes inhibidors de l'EKS sobre la melanogènesi a les cèl·lules B16F10 podrien estar mediats per la regulació a la baixa de gens i proteïnes melanogèniques, com la tirosinasa, TRP1, TRP-2 i MITF.

Fig. 3. Efectes de l'extracte d'etanol de Kummerowia striata en el procés de biosíntesi de melanina (A) L'expressió de la tirosinasa, TRP1, TRP2 i MITF a nivell d'ARNm es va determinar mitjançant RT-PCR. L'arbutina es va utilitzar com a control positiu. Els ARNm de tirosinasa, TRP1, TRP2 i MITF es van analitzar mitjançant el protocol de densitometria. L'arbutina es va utilitzar com a control positiu. ( B ) L'expressió de tirosinasa, TRP1, TRP2 i MITF a nivell de proteïnes es va determinar mitjançant western blotting. L'arbutina es va utilitzar com a control positiu. La tirosinasa, TRP1, TRP2 i MITF es van analitzar mitjançant el protocol de densitometria. L'arbutina es va utilitzar com a control positiu. Els valors representen la mitjana ± SD de tres rèpliques independents. La significació estadística s'indica com a *P <{{10}},05, **P <0,01, en comparació amb cèl·lules tractades amb -MSH.

Fig. 4. Activitat inhibidora de la tirosinasa i activitat antioxidant dels compostos actius de l'extracte d'etanol de Kummerowia striata (A) Es va analitzar l'activitat inhibidora de la tirosinasa de l'àcid p-cumàric i la quercetina (12,5–50 μM). (B) L'activitat anti-melanogènica de l'àcid cumàric i la quercetina (100-400 μM) es va analitzar a les cèl·lules B16F10. ( C ) Es va mesurar l'activitat antioxidant de l'àcid p-cumàric i la quercetina (6, 25-100 μM) utilitzant ABTS més la prova de cations radicals. L'arbutina i el BHA es van utilitzar com a control positiu. Els valors representen la mitjana ± SD de tres rèpliques independents. La significació estadística s'indica com a * P < 0, 05, ** P < 0, 01, en comparació amb les mostres no tractades.

3.4. L'àcid p-cumàric i la quercetina d'EKS van mostrar potents activitats anti-melanogèniques i antioxidants

A continuació, vam intentar identificar i purificar els compostos funcionals presents a EKS que presenten potents propietats anti-melanogèniques i antioxidants. Els diferents compostos es van identificar com a luteolina, àcid p-cumàric, àcid rosmarínic, quercetina, genisteïna i (a més)-catequina. Entre ells, l'àcid p-cumàric i la quercetina van inhibir la tirosinasa i la síntesi de melanina i van mostrar una capacitat d'eliminació semblant a l'arbutina, un agent despigmentant conegut, de manera dependent de la dosi (Fig. 4). Aquests resultats indiquen que l'àcid p-cumàric i la quercetina són compostos importants per a les propietats anti-melanogèniques i antioxidants de l'EKS.

4. Discussió

En aquest estudi, vam voler analitzar el potencial anti-melanogènic i antioxidant de l'EKS i els seus dos compostos àcid p-cumàric i quercetina i vam trobar que EKS posseeix potents activitats anti-melanogèniques i antioxidants.

La pigmentació de la pell és causada principalment pels melanòcits de la capa basal de la pell, després de l'estimulació per radiació UV. Els queratinòcits estimulats segreguen -MSH (una petita hormona peptídica) [21]. Així, l'exposició UV indueix la producció de melanina que resulta en hiperpigmentació [22]. Recentment, molts investigadors s'han centrat en el desenvolupament de compostos blanquejants nous i efectius, perquè els cosmètics amb efectes blanquejants constitueixen una gran part del mercat de la cosmètica. Els estudis sobre la inhibició de la biosíntesi de melanina van revelar que l'arbutina, l'àcid cògic i molts altres productes naturals inhibeixen la melanogènesi i la hiperpigmentació. No obstant això, recentment s'han informat dels efectes secundaris de l'arbutina [23] i l'àcid cògic [24] i l'ús d'aquestes substàncies es pot restringir. Per tant, cal desenvolupar materials segurs per blanquejar la pell sense efectes secundaris. Les investigacions recents s'han centrat en el desenvolupament de cosmètics per blanquejar la pell a partir de materials naturals.

Diversos estudis han demostrat les diferents activitats biològiques dels extractes de K. striata. En particular, K. striata és farmacèuticament eficaç per a la inflamació i l'oxidació [25,26]. Tanmateix, els efectes i els mecanismes moleculars de K. striata sobre la melanogènesi no s'han informat fins ara. En el present estudi, demostrem per primera vegada que EKS posseeix activitats anti-melanogèniques i antioxidants.

La tirosinasa, la TRP-1 i la TRP-2 tenen un paper important en la biosíntesi de melanina [27]. Així, el mecanisme subjacent a l'efecte dels agents per blanquejar la pell implica la inhibició de la producció de melanina mitjançant la disminució de l'activitat de la tirosinasa [28]. Se sap que l'expressió dels gens tirosinasa, TRP-1 i TRP-2 està regulada per MITF [29]. En el present estudi, es va trobar que les activitats anti-melanogèniques de l'EKS estaven mediades per la inhibició de l'activitat de la tirosinasa i la síntesi de melanina induïda per -MSH en cèl·lules de melanoma B16F10, sense inducció de citotoxicitat (Fig. 1). Es va trobar que aquestes activitats anti-melanogèniques de l'EKS estaven mediades per la regulació a la baixa de l'ARNm induït per -MSH i l'expressió de proteïnes de tirosinasa, TRP-1, TRP-2 i MITF (Fig. 3). Les activitats antioxidants es van mesurar mitjançant assajos DPPH i ABTS. L'EKS va mostrar una forta activitat antioxidant similar al BHA, que es va utilitzar com a control positiu (Fig. 2). Els compostos actius presents a EKS es van aïllar i es van confirmar com àcid p-cumàric i quercetina. Tot i que s'han informat diverses activitats biològiques, incloses activitats cardioprotectores [30], antiinflamatòries [31,32], antimutàgenes [33] antioxidants [34,35] i anti-melanogèniques [36] per a p-cumàric. àcid i quercetina de diverses plantes, aquest és el primer estudi que informa que l'àcid p-cumàric i la quercetina d'EKS posseeixen activitats anti-melanogèniques i antioxidants.

En aquest estudi, es van avaluar les activitats anti-melanogèniques i antioxidants de l'EKS. EKS va exercir activitats anti-melanogèniques i antioxidants mitjançant la regulació de l'activitat de la tirosinasa i la síntesi de melanina induïda per -MSH a les cèl·lules de melanoma B16F10, sense induir citotoxicitat. Els principals compostos actius van ser l'àcid p-cumàric i la quercetina. Així, les nostres troballes demostren per primera vegada que l'EKS es pot utilitzar com a possible agent despigmentant i antioxidant.

Conflictes d'interès

Els autors declaren cap conflicte d'interessos.

Finançament

Aquest treball va comptar amb el suport del Programa de Desenvolupament Tecnològic (S2393982) finançat pel Ministeri de Pimes i Startups (MSS, Corea).

Document de transparència

El document de transparència associat a aquest article es pot trobar a la versió en línia.

Referències

[1] P. Limtrakul, S. Yodkeeree, P. Thippraphan, W. Punfa, J. Srisomboon, Efectes anti-envelliment i inhibició de la tirosinasa de l'extracte de butanol de flor de fístula de Cassia, complement BMC. Altern. Med. 16 (2016) 497.

[2] A. Gragnani, S. Cornick, V. Chominski, S. Ribeiro de Noronha, S. Alves Corrêa de Noronha, L. Ferreira, Review of major theories of skin aging, Adv. Envelliment Res. 3 (2014) 265–284.

[3] TD Pedrosa, AO Barros, JR Nogueira, AC Fruet, IC Rodrigues, DQ Calcagno, MA Smith, TP de Souza, SB Barros, MC de Vasconcellos, et al., Anti-wrinkle and anti-whitening effects of jucá ( Libidibia ferrea Mart.) extractes, Arch. Dermatol. Res. 308 (2016) 643–654.

[4] N. Delalle-Lozica, La teràpia local com a prevenció bàsica antienvelliment, Acta Clin. croat. 49 (2010) 529–536.

[5] N. Maddodi, A. Jayanthy, V. Setaluri, Shining light on skin pigmentation: the darker and the brighter side of effects of UV radiation, Photochem. Fotobiol. 88 (2012) 1075–1082.

[6] C. Dessinioti, AJ Stratigos, D. Rigopoulos, AD Katsambas, Una revisió dels trastorns genètics de la hipopigmentació: lliçons apreses de la biologia dels melanòcits, Exp. Dermatol. 18 (2009) 741–749.

[7] A. Nishina, A. Miura, M. Goto, K. Terakado, D. Sato, H. Kimura, Y. Hirai, H. Sato, N. Phay, Mansonone E de Mansonia, els gauges van inhibir la melanogènesi induïda per MSH en cèl·lules B16 mitjançant la inhibició de l'expressió CREB i la fosforilació a la via PI3K/Akt, Biol. Farmàcia. Bou. 41 (2018) 770–776.

[8] VJ Hearing, TM Ekel, Tirosinasa de mamífers. Una comparació de la hidroxilació de la tirosina i la formació de melanina, Biochem. J. 57 (1976) 549–557.

[9] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Plantes i productes naturals per al tractament de la hiperpigmentació de la pell: una revisió, Planta Med. (2018), https://doi.org/10.1055/a0583-0410 [Epub abans de la impressió].

[10] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Tractament d'hiperpigmentació de la pell amb herbes: una revisió de l'evidència clínica, J. Cosmet. Làser Ther. 20 (2018) 123–131.

[11] JJ Hsiao, DE Fisher, The roles of microphthalmia-associated transcription factor and pigmentation in melanoma, Arch. Bioquímica. Biofísica. 563 (2014) 28–34.

[12] LA Garraway, HR Widlund, MA Rubin, G. Getz, AJ Berger, S. Ramaswamy, R. Beroukhim, DA Milner, SR Granter, J. Du, C. Lee, et al., Integrative genomic analysiss identify MITF com a oncogen de supervivència del llinatge amplificat en el melanoma maligne, Nature 436 (2005) 117–122.

[13] X. Zhang, P. Guo, G. Sun, S. Chen, M. Yang, N. Fu, H. Wu, X. Xu, compostos fenòlics i flavonoides dels fruits de Pandanus tectorius Soland, J. Med. . Plantes Res. 6 (2012) 2622–2626.

[14] H. Li, Q. Ma, Y. Liu, J. Qian, J. Zhou, Y. Zhou, Components químics de Polygonum perfoliatum, Chin. J. Appl. Entorn. Biol. 15 (2009) 615–620.

[15] A. Yagi, T. Kanbara, N. Morinobu, Inhibition of mushroom-tyrosinase by aloe extract, Planta Med. 56 (1987) 515–517.

[16] MS Blois, Antioxidant determinations by the use of a stable free radical, Nature 181 (1958) 1199–1200.

[17] U. Ozgen, A. Mavi, Z. Terzi, A. Yιldιrιm, M. Coşkun, PJ Houghton, Antioxidant properties of some medicinal Lamiaceae species, Pharm. Biol. 44 (2006) 107–112.

[18] NJ Miller, C. Rice-Evans, MJ Davies, V. Gopinathan, A. Milner, Un nou mètode per mesurar la capacitat antioxidant i la seva aplicació per controlar l'estat antioxidant en nounats prematurs, Clin. Ciència. 84 (1993) 407–412.

[19] S. Dudonne, X. Vitrac, P. Coutière, M. Woillez, JM Mérillon, Estudi comparatiu de propietats antioxidants i contingut fenòlic total de 30 extractes de plantes d'interès industrial mitjançant assaigs DPPH, ABTS, FRAP, SOD i ORAC. , J. Agric. Química dels Aliments. 57 (2009) 1768–1774.

[20] M. Otreba, J. Rok, E. Buszman, D. Wrzesniok, Regulació de la melanogènesi: el paper de cAMP i MITF, Postepy Hig. Med. Dosw. 66 (2012) 33–40.

[21] JS Han, JH Sung, SK Lee, Activitat antimelanogenesis de l'extracte de ginseng hidrolitzat (GINST) mitjançant la inhibició de la proteïna cinasa activada per mitogen JNK a les cèl·lules B16F10, J. Food Sci. 81 (2016) H2085–H2092.

[22] M. Chatatikun, A. Chiabchalard, Plantes tailandeses amb alts nivells d'antioxidants, activitat eliminadora de radicals lliures, activitat anti-tirosinasa i anti-collagenasa, complement BMC. Altern. Med. 17 (2017) 487.

[23] C. Couteau, LJ Coiffard, Photostability determination of arbutin, a vegetable whitening agent, Farmaco 55 (2000) 410–413.

[24] Y. Higashi, Y. Fujii, Determinació de l'àcid kojic en un cosmètic per blanquejar la pell mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment juntament amb detecció ultraviolada després de derivatització prèvia a la columna amb 4-fluoro-7-nitro{ {6}},1,3-benzoxazol, J. Cosmet. Ciència. 63 (2017) 205–212.

[25] JY Tao, L. Zhao, ZJ Huang, XY Zhang, SL Zhang, QG Zhang, Zhang BH FeiXiao, QL Feng, GH Zheng, Efectes antiinflamatoris de l'extracte d'etanol de Kummerowia striata (Thunb.) Schindl sobre LPS- cèl·lula RAW264.7 estimulada, Inflamació 31 (2008) 154–166.

[26] J.-H. Lee, J.-S. Park, Activitats antioxidants de les fraccions extretes amb dissolvent de Kummerovia striata (Thunb.) Schindl, Indian J. Sci. Tecnol. 8 (2015) 28–31.

[27] S. Kippenberger, S. Loitsch, F. Solano, A. Bernd, R. Kaufmann, Quantificació de transcripcions de tirosinasa, TRP-1 i Trp-2 en melanòcits humans per transcriptasa inversa competitiva PCR multiplex– regulació per hormones esteroides, J. Invest.Dermatol. 110 (1998) 364–367.

[28] YD Park, SY Kim, YJ Lyou, DY Lee, JM Yang, TXM13 cèl·lules de melanoma humà: una nova font per a la cinètica d'inhibició de la tirosinasa humana i per a la detecció d'agents blanquejants, Biochem. Biol cel·lular. 84 (2006) 112–116.

[29] A. Tuerxuntayi, YQ Liu, A. Tulake, M. Kabas, A. Eblimit, HA Aisa, l'extracte de Kaliziri regula l'expressió de la tirosinasa, TRP-1, TRP-2 i MITF en el melanoma B16 muri. cèl·lules, complement BMC. Altern. Med. 14 (2014) 166.

[30] N. Prasanna, DN Krishnan, M. Rasool, Cardiotoxicitat induïda per arsenit sòdic en rates: paper protector de l'àcid p-cumàric, un polifenol dietètic comú, Toxicol. Mech. Mètodes 23 (2013) 255–262.

[31] SJ Pragasam, V. Venkatesan, M. Rasool, Efecte immunomodulador i antiinflamatori de l'àcid p-cumàric, un polifenol dietètic comú en la inflamació experimental en rates, Inflammation 36 (2013) 169-176.

[32] M. Lee, M. Son, E. Ryu, Kim JG Yu SS, BW Kang, GH Sung, H. Cho, H. Kang, l'apoptosi induïda per quercetina prevé la infecció per EBV, Oncotarget 6 (2015) 12603–12624 .

[33] LR Ferguson, IF Lim, AE Pearson, J. Ralph, PJ Harris, Bacterial anti mutagènesi per àcids hidroxicinàmics de les parets cel·lulars vegetals, Mutat. Res. 542 (2003) 49–58.

[34] C. Castelluccio, G. Paganga, N. Melikian, GP Bolwell, J. Pridham, J. Sampson, C. Rice-Evans, Antioxidant potential of intermediates in phenylpropanoid metabolism in higher plants, FEBS Lett. 368 (1995) 188–192.

[35] IM Erden, A. Kahraman, The protector effect of flavonol quercetin against ultraviolet-induced oxidative stress in rats, Toxicology 154 (2000) 21–29.

[36] SM An, Koh JS i Boo YC: l'àcid p-cumàric no només inhibeix l'activitat de la tirosinasa humana in vitro sinó també la melanogènesi a les cèl·lules exposades a UVB, Phytother. Res. 24 (2010) 1175–1180.

For more information:1950477648nn@gmail.com