Efecte anti-melanogènic de l'extracte etanòlic de sorgo bicolor sobre la melanogènesi induïda per IBMX en cèl·lules de melanoma B16/F10

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo i Ho Jin Heo

Resum:Per avaluar la possibilitat com a agent blanquejador de la pellSorgo bicolor(S. bicolor), el seuantioxidantactivitat i efecte anti-melanogènic sobre la 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) induïda permelanogènesien cèl·lules de melanoma B16/F10 es van investigar. El resultat del contingut fenòlic total (TPC) va indicar que el 60% d'extracte d'etanolS. bicolor(ESB) té el contingut més alt que altres extractes d'etanol.AntioxidantL'activitat es va avaluar mitjançant la sal de diamoni 2,2'-azino-bis-({3-etilbenzotiazolina-6-àcid sulfònic) (ABTS)/1,1-difenil-2-picril-hidrazil Activitats d'eliminació de radicals (DPPH) i efecte inhibidor del malondialdehid (MDA). Aquests resultats van mostrar que l'ESB té un significatantioxidantactivitats. També es va avaluar l'efecte inhibidor contra la tirosinasa utilitzant L-tirosina (valor IC50=89,25 µg/mL) i 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) com a substrats. A més, el tractament amb ESB va inhibir eficaçment la producció de melanina a les cèl·lules de melanoma B16/F10 induïdes per IBMX. Per confirmar el mecanisme de l'efecte anti-melanogènic de l'ESB, vam examinar proteïnes relacionades amb la melanogènesi. ESB regulat a la baixamelanogènesien disminuir l'expressió del factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF), la tirosinasa i la proteïna relacionada amb la tirosinasa (TRP)-1. Finalment, es van analitzar l'àcid 9-hidroxioctadecadienoic (9-HODE), 1,3-O-dicafeoilglicerol i la tricina com a compostos principals de l'ESB mitjançant la cromatografia líquida d'ultra rendiment-separació de mobilitat d'ions-quadrupol temps de vol/espectrometria tandemma (UPLC-IMS-QTOF/MS2). Aquestes troballes suggereixen que l'ESB pot tenir el potencial fisiològic d'utilitzar-se com a material per blanquejar la pell.

Paraules clau:anti-melanogènesi; cèl·lula de melanoma B16/F10; àcid hidroxioctadecadienoic;Sorgumbicolor; 3-isobutil-1-metilxantina

Cistanche inhibeix la formació de melanina.

1. Introducció

La melanina es genera mitjançant un procés, anomenatmelanogènesidins dels melanosomes intracel·lulars dels melanòcits, i la producció i distribució de melanina determinen el color de la pell, els ulls i el cabell. A més, la melanina té un paper vital en la protecció de la pell de diverses molècules i estímuls, com ara la radiació ultraviolada (UV), les espècies reactives d'oxigen (ROS), l'hormona estimulant dels melanòcits (-MSH) i els agents elevadors d'adenosina monofosfat cíclica (cAMP), inclosa la forskolina i IBMX [1]. En particular, la radiació UV, directa i indirectament, danya les cèl·lules de la pell mitjançant generacions de ROS, com ara radicals hidroxil, anions superòxid i peròxid d'hidrogen [2]. El ROS generat provoca trencaments d'ADN de cadena simple i doble i ataca molècules estructurals cel·lulars importants com proteïnes i lípids [2]. Així, la melanina iantioxidantenzims com la glutatió peroxidasa, la superòxid dismutasa i la catalasa mantenen un nivell constant eliminant el ROS produït. Tanmateix, la producció excessiva de ROS com a resultat de diversos factors activa la melanogènesi a la pell, i l'acumulació anormal de melanina indueix efectes negatius d'hiperpigmentació, provocant taques d'edat o fetge, taques i pigues [3,4]. Actualment, s'utilitzen compostos naturals com l'àcid kògic, la hidroquinona, l'arbutina i l'àcid ascòrbic, coneguts com a inhibidors de la síntesi de melanina, com a additius per blanquejar la pell. Tanmateix, aquests ingredients no només tenen una mala penetració a la pell, sinó que també causen citotoxicitat i inflamació amb l'administració a llarg termini [5]. En aquest sentit, cal desenvolupar un agent blanquejador no irritant i eficaç per tractar la hiperpigmentació de la pell humana, així com estudiar materials de recursos naturals per a això.

Les cèl·lules de la pell humana solen generar melanina com a reacció de fotoprotecció. La melanogènesi és un procés complex que es regula mitjançant una varietat de vies de senyalització i, finalment, tots els senyals regulen MITF. Com que el MITF activat promou l'expressió de la família de gens de la tirosinasa (tirosinasa i TRP),melanogènesicomença de debò [6]. En general, el primer pas en la melanogènesi és que la tirosinasa catalitza l'oxidació de la L-tirosina a 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) i, posteriorment, oxida la L-DOPA a DOPA quinona. A continuació, el TRP-2 converteix el crom DOPA en àcid 5,6-dihidroxiindol-2-carboxílic (DHICA) o 5,6-dihidroxiindol (DHI). Finalment, DHICA i DHI s'oxiden pel TRP-1, donant lloc a la producció de melanina [6].

IBMX i altres metilxantines estimulen la melanogènesi inhibint la fosfodiesterasa i augmentant així els nivells d'AMPc [7]. L'AMPc activat per IBMX fosforila les vies de senyalització de la cinasa regulada per senyal extracel·lular (ERK) i les fosfoinosítid 3-cinases/proteïna quinasa B (PI3K/Akt) i, finalment, condueix a l'activació de MITF en processos de melanogènesi [7]. Per tant, la regulació a la baixa d'aquestes proteïnes es pot considerar un factor important per a l'efecte anti-blanqueig.

Sorgo bicolor(S. bicolor), que pertany a la família Poaceae, es considera un cultiu important a les regions intropicals, com ara Àfrica, Amèrica Central i regions àrides, i és el quart cultiu de cereals més important del món després del blat, l'arròs i el blat de moro [8]. ]. Estudis recents han demostrat que S. bicolor és beneficiós per als humans perquè conté fitoquímics com compostos fenòlics, tanins i antocians [9]. Aquests fitoquímics han guanyat més atenció a causa de la sevaantioxidant, efectes antiobesitat, antidiabetis i antiinflamatoris [10–14]. Tot i que hi ha diversos resultats d'investigació, encara no s'han realitzat estudis sobre l'efecte de blanqueig de la pell de S. bicolor. Per tant, el present estudi pretenia investigar l'activitat antioxidant i els efectes anti-melanogènics deS. bicolori per examinar els seus efectes sobre IBMX induïtsmelanogènesien cèl·lules de melanoma B16/F10.

2. Materials i Mètodes

2.1. Productes químics

Reactiu de Folin-Ciocalteu, L-DOPA, L-tirosina, àcid L-ascòrbic, arbutina, acarbosa, dimetilsulfòxid (DMSO), albúmina sèrica bovina, -glucosidasa, tirosinasa de bolets, albúmina sèrica bovina,3-(4,{ {6}}dimetil-2-tiazolil)-2,5-bromur de difeniltetrazoli (MTT) i IBMX es van comprar a Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). MITF (bsm-51339M) i tirosinasa (bs{-0819R) es van comprar a Bioss (Beijing, Xina). TRP-1 (sc-166857) i -actina (sc-69879) es van comprar a Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA). Els anticossos secundaris (anti-conill i anti-ratolí) es van obtenir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA).

2.2. Preparació de la mostra

S. bicolor(20 g) es va extreure amb diverses concentracions d'etanol (0, 20, 40, 60, 80 i 95 per cent; 1 L) a 40 graus durant 2 h mitjançant un condensador de reflux. Els extractes es van filtrar amb paper de filtre (WhatmanInternational Limited, Kent, Regne Unit) i es van concentrar mitjançant un evaporador al buit (N-1000; EYELA Co., Tòquio, Japó). Després de liofilitzar els extractes amb un assecador de congelació al buit (Il Shin Lab Co., Ltd., Yangju, Corea), els extractes secs es van emmagatzemar a -20 graus fins que s'utilitzen.

2.3. Activitat antioxidant in vitro

2.3.1. Contingut fenòlic total (TPC)

Els continguts fenòlics totals es van examinar basant-se en el principi que el reactiu de Folin-Ciocalteu es redueix a un producte de reacció blau en condicions alcalines. Una mostra (1 ml) barrejada amb el reactiu de Folin-Ciocalteu i un 7% de carbonat de sodi. La mescla es va activar durant 2 h, i després es va mesurar l'absorbància a 760 nm mitjançant un espectrofotòmetre (UV -1201; Shimadzu, Kyoto, Japó). El TPC es va calcular a partir de la corba estàndard de l'àcid gàl·lic i els resultats es van expressar com a GAE g-1.

2.3.2. Activitat d'eliminació radical

La solució de cations radicals ABTS es va produir barrejant 2,45 mM de persulfat de potassi i 7 mMABTS amb 10{{10}} mM tampó de fosfat de potassi (pH 7,4) que contenia 150 mM i permetent reaccionen durant 24 h a temperatura ambient. A continuació, la solució ABTS es va diluir amb aigua destil·lada per obtenir una absorbància de 0,700 ± 0,020 a 734 nm. Es va deixar que la mostra reaccionés amb 980 µL de la solució ABTS durant 10 min a 37 graus i després es va mesurar l'absorbància a 734 nm mitjançant un espectrofotòmetre (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japó). La solució de radicals DPPH es va preparar per dissoldre 0,1 mM de DPPH en metanol al 80%. La solució DPPH es va diluir fins a una absorbància d'1,000 ± 0,020 a 517 nm. Es van barrejar 50 µL de la mostra amb 1, 45 mL de solució de DPPH i es van fer reaccionar durant 30 min a la foscor. Després de reaccionar, la mescla es va determinar a 517 nm.

2.3.3. Efecte inhibidor sobre la peroxidació lipídica

Per mesurar l'efecte inhibidor de la peroxidació lipídica al teixit cerebral, es va utilitzar el mètode de substància reactiva àcid tiobarbitúric (TBA). El teixit cerebral es va homogenar en tampó Tris-HCl 20 mM (pH7, 4) i es va centrifugar a 6000 × g durant 20 min. El sobrenedant es va afegir a 0, 1 mM d'àcid L-ascòrbic i 10 µM de sulfat fèrric a 37 graus durant 1 h d'incubació. A continuació, es va afegir un 30 per cent d'àcid tricloroacètic i un 1 per cent de TBA a la barreja, que es va incubar en un bany d'aigua a 80 graus durant 20 min. A continuació, es va mesurar el complex TBA-MDA mitjançant un espectrofotòmetre (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japó) a 532 nm.

2.4. Efecte inhibidor de la tirosinasa

L'efecte inhibidor de la tirosinasa es va determinar utilitzant L-tirosina com a substrat. Es va afegir una mostra a una placa de 96-pou i es va barrejar amb 0, 1 M tampó de fosfat sòdic, tirosinasa i 0, 1 mML de substrat de tirosina per reaccionar a 37 graus. Després de la incubació, es va mesurar l'activitat enzimàtica mitjançant un microplatereader (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, EUA) a 490 nm. A més, es va utilitzar L-DOPA com a substrat per mesurar l'activitat inhibidora de la tirosinasa. Es van afegir tampó de fosfat sòdic de 67 mM, tirosinasa i substrat de 10 mML-DOPA a la mostra per reaccionar a 37 graus durant 10 min. L'activitat de la tirosinasa es va mesurar a 415 nm.

Cistanche inhibeix la formació de melanina

2.5. -Efecte inhibidor de la glucosidasa

L'efecte inhibidor de la -glucosidasa es va mesurar barrejant 0.1 M tampó de fosfat de sodi i -glucosidasa a 37 graus durant 10 min. Després d'activar-se, la barreja es va afegir a 5 mM4-nitrofenil- - D-glucopiranòsid en tampó a 37 graus durant 5 min, i després es va mesurar l'absorbància a 405 nm mitjançant un lector de microplaques (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, EUA).

2.6. Assaig de viabilitat cel·lular

La citotoxicitat de la mostra es va estimar mitjançant un assaig MTT. Les cèl·lules de melanoma B16/F10 es van cultivar a 1 × 104 cèl·lules/pou en una placa de 96-pous durant 24 h. A continuació, les mostres es van tractar a concentracions d'1, 2, 5 i 10 µg/mL. Les mostres es van tractar durant 48 h, després de les quals es van tractar les cèl·lules amb 10 µg/mL de solució de MTT durant 3 h. Finalment, es va eliminar el medi i es va afegir DMSO per solubilitzar el formazà. La quantitat de formazan es va quantificar mitjançant un lector de microplaques (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, EUA) a 570 nm (longitud d'ona d'excitació) i 655 nm (longitud d'ona d'emissió).

2.7. Mesura del contingut de melanina cel·lular

Per mesurar la quantitat de melanina, es van cultivar cèl·lules de melanoma B16/F10 en una placa de 24-pous a una adensitat de 4 × 104 cèl·lules/pou per sobre durant 24 h. A continuació, es van tractar les cèl·lules amb IBMX 100 mM i ESB o control positiu (arbutina) durant 48 h addicionals. Després del tractament, les cèl·lules es van rentar i es van recollir amb solució salina tampó fosfat (PBS). Les cèl·lules collides es van centrifugar a 16,000×g durant 10 min, i el pellet obtingut es va dissoldre amb hidròxid de sodi 1 N que contenia un 10 per cent de DMSO a 90 graus durant 20 min. El contingut de melanina es va mesurar a 490 nm mitjançant un lector de microplaques (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, EUA).

2.8. Anàlisi Western Blot

Les cèl·lules de melanoma B16/F10 pretractades es van rentar amb PBS i es van lisar amb un tampó RIPA que contenia un 1% d'inhibidors de la proteasa en gel. Les concentracions de proteïnes es van determinar mitjançant un assaig de proteïnes Bradford i les proteïnes iguals es van desnaturalitzar amb un tampó Laemmli durant 10 min a 95 graus. Les proteïnes desnaturalitzades es van separar mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE) i després es van transferir a membranes de difluorur de polivinilidè (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EUA). A continuació, es van bloquejar les membranes amb un 5 per cent de llet desnatada en solució salina tamponada amb Tris amb un 0, 1 per cent de Tween20 (TBST) durant 1 h i després van reaccionar amb anticossos primaris durant la nit a 4 graus. Les membranes van reaccionar amb els anticossos secundaris durant 1 h i es van visualitzar els complexos immunes mitjançant un reactiu de quimioluminescència millorat (Bionote, Hwaseong, Corea). Les imatges de la banda van ser detectades i analitzades per Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).

2.9. Anàlisi UPLC-IMS-QTOF/MS2

Els principals compostos en els extractes etanòlics del 60 per cent deS. bicolorvan ser analitzats per UPLC-IMS QTOF/MS2 (Vion, Waters Corp., Milford, MA, EUA). La separació cromatogràfica es va dur a terme mitjançant una columna Acquity UPLC BEH C18 (2,1 × 10{{10}} mm, mida de partícula 1,7 µm; Waters Corp.) a un cabal de 0,35 ml/min. Les fases mòbils consistien en dissolvent A (0,1 per cent d'àcid fòrmic en aigua destil·lada) i B (acetonitril), i les condicions d'anàlisi incloïen el següent gradient de temps: 1 per cent de B a 0-1 min, 1-100 per cent de B a 1-7 min, 100 per cent de B als 7-8 min, 100-1 per cent de B als 8-8,2 min, 1 per cent de B als 8,2-10 min. L'espectrometria de masses es va realitzar en el mode negatiu d'ionització electrospray (ESI) en les condicions següents: temperatura de la font, 100 ◦C; temperatura de la línia de desolvació, 400 ◦C; energia de col·lisió de rampa, 10–30 V; tensió capil·lar, 2,5 kV. Els compostos fenòlics es van detectar mitjançant una exploració completa que va des de m/z 50 fins a 1500.

2.10. Anàlisi estadística

Tots els resultats es van presentar com a mitjanes ± desviació estàndard (SD). La diferència estadística entre grups es va determinar mitjançant una anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) mitjançant la nova prova d'interval múltiple de Duncan (p <{1}}.05) amb="" la="" versió="" 9.4="" del="" programari="" sas="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" eua)="" .i="" la="" interrelació="" entre="">antioxidantefectes (activitat d'eliminació de radicals ABTS/DPPH i efecte inhibidor de MDA) i l'efecte inhibidor demelanogènesienzims mediats (tirosinasa i -glucosidasa) es va avaluar l'anàlisi de correlació de Pearson.

3. Resultats

3.1. Continguts fenòlics totals

Per comparar elantioxidantactivitat de cada extracte etanòlicS. bicolor, es va investigar el TPC. Tal com es mostra a la figura 1, els TPC eren diferents entre els extractes etanòlics; l'extracte etanòlic del 60 per cent (150,08 ± 1,13 mg GAE/g) va ser significativament més gran que les altres extraccions (0 per cent; 70,83 ± 1,18, 20 per cent; 100,42 ± 0,72, 40 per cent; ; 114,67 ± 1,46, 80 per cent; 118,33 ± 3,17 i 95 per cent; 73,67 ± 1,46 mg GAE/g). Per tant, l'extracte etanòlic del 60 per cent es va utilitzar per a més anàlisis experimentals.

3.2. Activitat d'eliminació radical

Elantioxidantactivitat de l'extracte etanòlic al 60 per centS. bicolor(ESB) es va mesurar mitjançant l'assaig ABTS/DPPH i l'assaig MDA, i els resultats es van mostrar a la figura 2. L'activitat d'eliminació de radicals ABTS de l'ESB es va mostrar al 97,98 per cent a una concentració de 1000 ug/mL i vitamina C (99,82 per cent). , que s'utilitza com a control positiu i també tenia una activitat similar d'eliminació de radicals a la mateixa concentració (figura 2A). I, ESB va mostrar un efecte d'inhibició del 50 per cent (valor IC50) del radical ABTS a una concentració de 409,71 ug/mL. Tal com es mostra a la figura 2B, l'activitat d'eliminació de radicals DPPH de l'ESB es va mostrar un 79,44 per cent a una concentració de 1000 ug/mL i el valor IC50 es va indicar a 612,53 ug/mL. L'efecte inhibidor de la producció de MDA d'ESB va mostrar un efecte inhibidor del 89,54 per cent a una concentració de 50 ug/ml i va mostrar un efecte inhibidor més alt que la catequina (71,03 per cent), que és el control positiu, a la mateixa concentració (figura 2C). A més, es va observar el valor IC50 de MDA a concentracions de 16,56 ug/mL d'ESB.

3.3. Efecte inhibidor dels enzims mediats per la melanogènesi

L'efecte inhibidor demelanogènesiEls enzims mediats es van avaluar mitjançant tirosinasa i -glucosidasa (Figura 3). Per mesurar l'activitat inhibidora de la tirosinasa contra la síntesi de melanina, es van realitzar experiments amb L-tirosina i L-DOPA com a substrat en condicions lliures de cèl·lules. Com a resultat, el valor IC50 va ser de 89,25 µg/mL quan L La tirosina es va utilitzar com a substrat (figura 3A), però la L-DOPA no va poder observar més del 5 0 per cent de l'efecte inhibidor (figura 3B). En aquest moment, el valor IC50 del control positiu (arbutina) per a la L-tirosina era de 74,35 µg/mL, que era superior a l'ESB. Es va trobar que l'ESB tenia un millor efecte inhibidor sobre la tirosinasa amb L-tirosina que amb L-DOPA com a substrat. Per tant, segons els resultats de l'assaig amb dos substrats, es considera que l'efecte inhibidor de la tirosinasa de l'ESB està relacionat amb l'oxidació de L-tirosina a L-DOPA en lloc de l'oxidació de L-DOPA a DOPA quinona en la melanogènesi. L'efecte inhibidor de la tirosinasa utilitzant L-DOPA com a substrat i activitat d'eliminació de radicals (ABTS; 0.943, p <0,05, dpph;="" 0,952,="" p=""><0,05) va="" indicar="" les="" fortes="" correlacions="" positives="" a="" la="" taula="">

Per mesurar l'efecte inhibidor de lamelanogènesimediat per l'enzim, es va mesurar l'activitat inhibidora contra la -glucosidasa de l'ESB. Com es mostra a la figura 3C, l'ESB va inhibir la -glucosidasa en un 33,72 per cent a una concentració de 200 µg/mL. I l'IC50 de l'ESB va ser de 46,29 µg/mL, que és aproximadament cinc vegades més gran que l'acarbosa (216,05 µg/mL). Aquests resultats indiquen que l'ESB té una millor activitat inhibidora de la glucosidasa que l'acarbosa com a control positiu. L'efecte inhibidor de la -glucosidasa va revelar fortes correlacions positives amb l'efecte inhibidor de la MDA (0, 966, p < 0,="" 05)="" a="" la="" taula="">

3.4. Viabilitat cel·lular i síntesi de melanina cel·lular

Per confirmar la citotoxicitat de l'ESB, es van tractar cèl·lules de melanoma B16/F10 amb ESB durant 24 h a concentracions de 1, 2, 5, 10 i 20 µg/mL. Els resultats van mostrar que l'ESB no va afectar la viabilitat cel·lular a les concentracions indicades en comparació amb el control (figura 4A). Per tant, els experiments es van dur a terme seleccionant concentracions de 2, 5 i 10 µg/mL. Posteriorment, es van tractar cèl·lules de melanoma B16/F10 amb IBMX per analitzar l'efecte de l'ESB en la producció de melanina. Com es mostra a la figura 4B, el nivell de contingut de melanina va augmentar fins al 316,85 per cent quan es tractava amb IBMX. D'altra banda, el grup tractat amb ESB (108,60 per cent) a una concentració de 10 µg/mL va mostrar un contingut de melanina significativament disminuït en comparació amb el grup tractat amb IBMX, i continguts similars de melanina en comparació amb el grup d'arbutina (101,79 per cent) com a control positiu.

3.5. Via de la melanogènesi a les cèl·lules de melanoma B16/F10

Melanogènesiés un procés essencial per protegir la pell humana dels estímuls externs, i aquest procés està regulat per diversos mecanismes. En aquest estudi, es va mesurar el nivell d'expressió de molècules que regulen la melanogènesi per confirmar el possible mecanisme inhibidor de la producció de melanina induïda per ESB a IBMX a les cèl·lules de melanoma B16/F10 (figura 5). Els resultats van mostrar que ESB va disminuir de manera efectiva l'expressió MITF induïda per IBMX (figura 5A, B). Així, l'expressió de la tirosinasa (Figura 5A, C) i TRP -1 (Figura 5A, D) es va reduir mitjançant MITF reduït amb tractament ESB. Com a resultat, el tractament amb ESB va regular a la baixa l'expressió de proteïnes relacionades a les cèl·lules de melanoma B16/F10 de melanogènesi induïda per IBMX.

3.6. Anàlisi UPLC-IMS-QTOF/MS2

Es va escanejar per LC/MS un perfil dels principals compostos d'ESB en un rang de m/z 50-1500, i els cromatogrames de pic de base es mostren a la figura 6. Es van realitzar una identificació i caracterització addicionals dels compostos en comparació amb les dades de la literatura utilitzant MS2fragmentationdata (taula 2). A partir dels fragments de la literatura anterior, el pic 2 va ser 1-O-cafeoilglicerol (m/z 253,07, 179,03, 161,02 i 135,04) [15]; pic 3, dicafeoilglicèrids (m/z 415,10, 253,07, 179,03 i 135,04) [16]; pic 4, 1,3-O-dicafeoilglicerol (m/z 415,10, 253,07, 179,03, 161,02 i 135,04) [16];pic 5, p-cumaroil-cafeoilglicerol (m/z 253,07, 179,03, 161,02, 135,03) i 135,04) [17]; pic 6, feruloil-cafeoilglicerol (m/z 429,12, 253,07, 193,05, 161,02 i 134,03) [18]; pic 7, tricina (m/z 329,23.314,04, 299,01 i 271,02) [19]; i el pic 9, 9-àcid hidroxioctadecadienoic (9-HODE) (m/z 295,22, 277,21 i 171,10) [20], respectivament. Entre ells, es van identificar 1,3-O-dicafeoilglicerol (figura 6B), tricina (figura 6C) i 9-HODE (figura 6D) com a compostos principals.

efectes del cistanche:anti-oxidació

4. Discussió

MelanogènesiS'informa que és causat per l'augment de l'estrès oxidatiu per estímuls externs. L'estrès oxidatiu provoca l'oxidació de l'ADN i les proteïnes, la peroxidació lipídica i l'augment dels àcids grassos insaturats. Aquest estrès també condueix a un augment innecessari de la síntesi de melanina en els melanòcits de la pell. Així, l'excés de melanina generada pot provocar pigmentació i pot provocar càncer de pell. IBMX estimula la melanogènesi inhibint la fosfodiesterasa i augmentant així els nivells d'AMPc [7]. A mesura que augmenta el nivell d'AMPc a les cèl·lules, provoca l'activació de les vies de senyalització ERK i PI3K/Akt que promouen la generació de proteïnes associades a la melanogènesi. Per tant, vam investigar l'efecte blanquejador de l'ESB sobre la melanogènesi induïda per IBMX en cèl·lules de melanoma B16/F10.

Els compostos fenòlics com a metabòlits secundaris de les plantes tenen la propietat d'estar estabilitzats per una estructura de ressonància quan reaccionen amb els radicals [21]. A més, els compostos fenòlics actuen com a factors importants per a l'activitat antioxidant, com l'activitat d'eliminació de radicals ABTS/DPPH, i actuen com a inhibidors de la formació de pigments perquè tenen una estructura química com la de la L-tirosina [22, 23]. Un assaig ABTS/DPPH és el mètode més comú i més senzill per estimar in vitroantioxidantactivitat. En aquest estudi, ESB ha mostrat una alta activitat d'eliminació de radicals de TPC (figura 1) i ABTS / DPPH (figura 2A, B). Especialment, l'ESB va ser més gran en l'activitat d'eliminació de radicals ABTS que en l'activitat d'eliminació de radicals DPPH. L'assaig DPPH s'utilitza per mesurar l'activitat d'eliminació de radicals dels compostos hidrofòbics, mentre que l'assaig ABTS permet mesurar l'activitat d'eliminació de radicals contra compostos hidròfobs i hidròfils [24]. Per tant, es va confirmar que l'activitat d'eliminació de radicals de l'ESB estava més afectada pel compost hidròfil.

L'exposició a la radiació UV provoca la producció de ROS i té efectes directes i indirectes sobre la pell. En particular, les ROS indueixen la peroxidació lipídica atacant els àcids grassos insaturats, que són components de les membranes cel·lulars [2]. L'acumulació de peròxids lipídics condueix a la destrucció del sistema antioxidant de la pell, provocant pigmentació, inflamació i envelliment [25]. En aquest estudi, ESB va mostrar una inhibició excel·lent de la peroxidació lipídica (figura 2C). Es va informar que els compostos fenòlics continguts a les plantes naturals estaven associats amb l'activitat d'eliminació de radicals [26]. Així mateix, Maresca et al. [27] va informar que l'eliminació de ROS amb antioxidants és eficaç per inhibir la biosíntesi de melanina. Un estudi recent va informar que les fraccions d'acetat d'etil i d'aglicona de la fulla de Dendropanax morbifera poden actuar com a protectors de cèl·lules de la pell i antioxidants naturals protegint les cèl·lules HaCaT contra l'estrès oxidatiu [28]. A més, el tractament amb les mateixes fraccions va mostrar un millor efecte anti-melanogènic que l'arbutina, utilitzada com a control positiu, contra la generació excessiva de melanina induïda per -MSH a les cèl·lules de melanoma B16/F10 [28].

Hi ha diversos mecanismes associatsmelanogènesi, i l'objectiu comú dels agents per blanquejar la pell és la regulació de la tirosinasa, que és un enzim important en la melanogènesi. La tirosinasa, un enzim que conté coure, catalitza dues reaccions en aquesta via: la hidroxilació de L-tirosina a L-DOPA i l'oxidació de L-DOPA a DOPA quinona [6]. Quan s'exposa a grans quantitats d'UV o ROS, augmenta l'activitat de la tirosinasa i també augmenta la síntesi de melanina. Per tant, els resultats de mesurar l'efecte inhibidor de la tirosinasa en relació amb la síntesi de melanina van demostrar que es va trobar que l'ESB tenia un millor efecte inhibidor sobre la tirosinasa utilitzant L-tirosina que utilitzant L-DOPA com a substrat (Figura 3A, B). Un estudi recent va informar de la correlació entre la TPC i la inhibició de la tirosinasa perquè els compostos fenòlics tenen una estructura química similar a la de la L-tirosina, un substrat de la tirosinasa. Segons Choi et al. [29], es va observar que l'eficiència de l'activitat d'eliminació de radicals lliures i l'efecte inhibidor de la tirosinasa augmentaven en proporció al temps de fermentació de Cheonggukjang, que es va deure a que la quantitat de TPC augmentava amb el temps de fermentació. Im & Lee [30] va observar que la fracció d'acetat d'etil del 75 per cent d'extracte etanòlic de Taraxacum core num tenia abundant TPC i activitat antioxidant, i l'efecte inhibidor de la tirosinasa era superior a altres fraccions (hexà, cloroform, butanol i aquosa).

La tirosinasa, una de les glicoproteïnes, està glicosilada quan les cadenes polipeptídiques es transloquen al reticle endoplasmàtic. Diversos enzims estan implicats en aquest procés, i entre ells, la inhibició de la -glucosidasa podria inhibir el plegament de la tirosinasa per formar una estructura inactiva sense coure. Com a resultat, la tirosinasa no pot ser transportada al melanosoma i inhibeix la producció de melanina. El polifenol present. en plantes és capaç no només de reduir l'estrès oxidatiu, sinó que també inhibeix els enzims que hidrolitzen els carbohidrats com la -glucosidasa en unir-se a proteïnes [31]. Un estudi anterior va indicar que les cèl·lules de melanoma B16/F10 en presència d'inhibidors de la glicosilació donen lloc a la reducció de la melanogènesi en disminuir el contingut total de tirosinasa [32]. I Choi et al. [33] va informar que la desoxinojirimicina, un dels inhibidors de la -glucosidasa, va bloquejar la glicosilació de la tirosinasa i va inhibir la migració de la tirosinasa als melanosomes. Ando et al. [34] han demostrat que és possible inhibir la síntesi de melanina a les cèl·lules del melanoma controlant la glicosilació de la tirosinasa per inhibidors de la -glucosidasa com el glutatió, la ferritina i la geldanamicina. Kim et al. [35] va informar de les bones correlacions per al pol·len d'abella com a naturalantioxidantentre el TPC i l'efecte inhibidor de la tirosinasa ({{0}},973,p <0.05), i="" també="" el="" tpc="" va="" donar="" la="" correlació="" positiva="" amb="" l'activitat="" d'eliminació="" de="" radicals="" dpph="" (0,897,="" p=""><0,05). i="" els="" resultats="" suggereixen="" que="" els="" polifenols="" com="" a="" antioxidants="" naturals="" podrien="" ser="" potencialment="" efectius="" per="" a="" blanquejar="" la="" pell="" en="" funció="" de="" la="" seva="" excel·lent="" activitat="" antioxidant.="" en="" el="" nostre="" estudi,="" es="" va="" indicar="" que="" l'efecte="" antioxidant="" de="" l'esb="" en="" el="" procés="" d'inhibició="" de="" l'acció="" de="" la="" tirosinasa="" estava="" altament="" correlacionat="" mitjançant="" la="" inhibició="" de="" l'oxidació="" de="" l-dopa="" a="" dopa="" quinona="" i="" la="" glicosilació="" de="" la="" tirosinasa="" (taula="" 1).="" per="" aquest="" motiu,="" l'antioxidant="" l'efecte="" de="" l'esb="" té="" un="" efecte="" sobre="" l'efecte="" de="" blanqueig="" de="" la="" pell="" afectant="" la="" inhibició="" de="">melanogènesi- enzims mediats.

antioxidant natural: cistanche tubulosa

La via de senyalització de PKA és el procés principal implicat en la melanogènesi, i aquest és activat per IBMX, que és un agent elevador de cAMP. La via de senyalització de PKA pot regular factors de transcripció com el MITF i la proteïna d'unió a elements sensibles a cAMP, que estan implicades en l'expressió demelanogènesireguladors com la tirosinasa, la TRP-1 i la TRP-2. En conseqüència, el tractament amb IBMX augmenta l'expressió de MITF i la família de gens de la tirosinasa (tirosinasa i TRP-1) mitjançant l'activació de cAMP [7]. Park et al. [36] va demostrar que la quantitat de síntesi de melanina de l'extracte etanòlic de PapenfusiellaCuomo (65,17 ± 13,40 per cent) a una concentració de 40 µg/mL era similar a l'àcid cògic (72,30 ± 3,92 per cent) com a control positiu i va informar que mostrava potencial. com a material blanquejador natural. En aquest estudi, ESB va mostrar un efecte inhibidor eficaç sobre la síntesi de melanina similar al del control positiu a concentracions baixes (figura 4). Després d'això, per avaluar l'efecte anti-melanogènic detallat de l'ESB, es va realitzar una anàlisi de western blot sobre proteïnes mediades per la melanogènesi mitjançant cèl·lules de melanoma B16/F10.

Akt, que participa en diversos mecanismes, té un paper clau en múltiples processos cel·lulars com l'apoptosi, la glucosa i el metabolisme de la pell. En particular, l'augment de cAMP pel tractament amb IBMX disminueix la fosforilació Akt i la seva activació. A més, Akt inactivat indueix l'activació de GSK-3, la qual cosa significa que no s'aconsegueix la fosforilació, és a dir, el nivell de p-GSK-3 es redueix [7]. Segons la literatura anterior, la part aèria de Pueraria thunbergia rebaixa el MITF activant la via de senyalització Akt/GSK-3 a les cèl·lules de melanoma B16/F10 [37]. També, Huang et al. [38] va demostrar que [6]-school va promoure l'expressió p-Akt i va inhibir la senyalització de la melanogènesi a les cèl·lules de melanoma B16/F10. La GSK activada-3 regula a l'alça la família de gens de la tirosinasa mitjançant la fosforilació de Ser289 de MITF, promovent en conseqüència la melanogènesi. MITF és un factor de transcripció important que s'uneix a un promotor del gen de la tirosinasa i, posteriorment, augmenta l'expressió d'enzims relacionats amb la proliferació de melanòcits imelanogènesi[7]. Quan l'expressió de tirosinasa és promoguda per MITF, posteriorment condueix a un augment dels nivells de TRP-1 i TRP-2 i, com a resultat, aquests enzims melanogènics produeixen melanina [6]. L'estrès oxidatiu causat per la llum UV estimula la pigmentació de la melanina a la pell. Per tant, l'activitat d'eliminació de radicals o ROS és eficaç per suprimir la producció de melanina, i els polifenols amb activitat antioxidant poden tenir excel·lents efectes blanquejants [38]. Choi et al. [39] va demostrar que les tiges de bambú coreà (Henosis de la varietat Phyllostachys nigra) van regular a la baixa el MITF mediat per PKA/CREB mitjançant l'eliminació de radicals ABTS/DPPH. I un extracte etanòlic del 70 per cent de Nelumbo nucifera G. Leaf va inhibir l'expressió de MITF, tirosinasa i TRP amb activitats antioxidants com la capacitat de donació d'electrons i la inhibició de la xantina oxidasa [40]. En aquest experiment, es va demostrar que el tractament amb ESB va disminuir l'expressió de la família de gens MITF i tirosinases (tirosinasa i TRP-1), que promouen l'oxidació de DHICA a DHI en la via de la melanogènesi (figura 5). A partir d'aquests resultats, s'ha demostrat que l'ESB regula a la baixa la melanogènesi mediada per IBMX en funció del seuantioxidantefectes.

A partir de la literatura anterior, es van identificar els principals compostos fenòlics de l'ESB que 1, 3-O-di-cafeoil glicerol (figura 6B), tricina (figura 6C) i 9-HODE (figura 6D) [16 ,19,20]. Entre ells, 9-HODE, que és el compost més abundant de l'ESB, és un dels metabòlits de l'àcid linoleic i mostra un efecte blanquejador sobre la pell irritada mitjançant la inhibició de la tirosinasa [41]. A més, a diferència d'altres compostos alifàtics, s'informa que 9-HODE és estable en tots els experiments d'oxidació i té un efecte blanquejador sobre el dany de ROS [41]. Mentrestant, la tricina (5,7-dihidroxi- 2-({4-hidroxi{-3,{5-di-metoxifenil)-4H-cromè{{24 }}one) ha estat reconegut durant molt de temps pels seus efectes beneficiosos per a la salut, com ara activitats antioxidants, antivirals i antitumorals/anticànceros [42–44]. Mu et al. [45] van informar que la tricina va mostrar un millor efecte inhibidor sobre l'activitat de la tirosinasa en comparació amb l'arbutina com a control positiu. A més, Meng et al. [46] van informar que la tricina aïllada de l'extracte de metanol d'ordi verd jove (Hordeum vulgare L.) va inhibir la biosíntesi de melanina i l'activitat de la tirosinasa a les cèl·lules del melanoma B16/F10 mitjançant el grup hidroxil a la posició C-4 i els grups metoxi a la Posicions C-3',5' de l'esquelet de la tricina. Els fenilpropanoides com l'1-O-cafeoilglicerol, els dicafeoilglicèrids i l'1,3-O-dicafeoilglicerol són compostos orgànics sintetitzats per les plantes a partir de la fenilalanina i la tirosina. Es va informar que el fenilpropanoide i les seves formes glicosilades eren potents antioxidants, ja sigui eliminant directament ROS o actuant com a eliminadors de radicals peroxils que trencaven la cadena [47].

L'àcid p-cumàric, que té una estructura química similar a la L-tirosina, competeix amb la L-tirosina pels llocs actius de la tirosinasa [48]. Es coneix com un fort inhibidor de la tirosinasa i es va informar que el seu efecte anti-melanogènesi és més fort que els compostos estructuralment similars com el cinnamicacid [48]. A més, An et al. [48] ​​van informar que l'àcid p-cumàric, un constituent de Sasa quelpaertensisNakai, va inhibir l'activitat de la tirosinasa utilitzant L-DOPA com a substrat i va reduir la producció de melanina a les cèl·lules de melanoma B16/F10. Per tant, es pot considerar que l'ESB té un excel·lent efecte blanquejador a través de l'àcid p-cumàric. A més, els espectres MS de 1-O-cafeoilglicerol i 1-3-O-dicafeoilglicerol van mostrar patrons de fragmentació similars a m/z 179, 161 i 135, i aquests fragments es van informar com a residu d'àcid cafeic. Tenen un espectre UV similar al d'un derivat de l'àcid cafeic amb un λmax a uns 326 nm, i per tant es consideren un derivat de l'àcid cafeic [48]. Es va informar que l'àcid cafeic, un derivat de diversos compostos, és un potent antioxidant in vitro/in vivo i redueix l'activitat de la tirosinasa imelanogènesien cèl·lules de melanoma B16/F10. En conseqüència, es podria considerar que es deu a l'efecte anti-melanogènic de l'ESBantioxidantsi substàncies per blanquejar la pell com compostos alifàtics i fenòlics.

efectes del cistanche: anti-oxidació

5. Conclusions

Per avaluar la possibilitat com a agent blanquejador de la pellSorgo bicolorEs van avaluar els efectes antioxidants i anti-melanogènics de l'ESB sobre la melanogènesi induïda per IBMX a les cèl·lules de melanoma B16/F10. ESB va exhibir significativaantioxidantactivitats en l'activitat d'eliminació de radicals ABTS/DPPH i efecte inhibidor de la MDA. ESB va impedir el primer pas demelanogènesimitjançant la inhibició de -glucosidasa i tirosinasa utilitzant L-tirosina i L-DOPA com a substrats. Els efectes anti-melanogènics de l'ESB induïts per IBMXmelanogènesies van avaluar en cèl·lules de melanoma B16/F10 i els resultats van mostrar que l'ESB va inhibir la melanogènesi induïda per IBMX a les cèl·lules de melanoma B16/F10. L'acumulació de melanina es va inhibir per la regulació a la baixa de l'expressió de MITF i la família de gens de la tirosinasa (tirosinasa i TRP-1) en la melanogènesi induïda per IBMX. Els principals compostos de l'ESB es van analitzar com a 1,3-O-di-cafeoil glicerol, tricina i 9-HODE. En conseqüència, ESB va mostrar in vitroantioxidantactivitat i un efecte anti-melanogènic a les cèl·lules de melanoma B16/F10 i, per tant, es podria utilitzar com a agent blanquejador de la pell al mercat de la cosmètica.

anti-oxidaciópastilles de cistanche