Activitat antinociceptiva dels estolons de salsa Cistanche, que creixen a la República del Kazakhstan

Material vegetal

Salsa de Cistanche(CAMey.) Beck, Orobanchaceae,es van recollir estolons al desert de Moinkum, poble de Bakanas, el juliol de 2014 a Almati. El material vegetal va ser identificat pel Dr. G. Sitpayeva de l'Institut de Botànica i Fitointroducció del Ministeri d'Educació i Ciències de la República de Kazakhstan, on es va dipositar amb el número 01-04/306.

Anàlisi química

Estolons deC. salsa(2 g) es van sotmetre a una extracció de microones. Inicialment el material es va triturar a 0.001–2.000 mm i després es va col·locar en un recipient hermètic per extreure's durant 10 minuts a 100–1100 graus amb etanol al 80 per cent ( proporció 1:10). L'extracte d'hidroetanol (CSHE) es va analitzar mitjançant HPLC-MS. L'extracte brut es va dissoldre en metanol (9,6 mg/ml) i es va filtrar a través d'un 0,45mm Membrana de tefló abans de l'anàlisi. Un model de cromatògraf líquid HP de la sèrie 1100 (empresa Agilent Technologies, Inc., CA, EUA), equipat amb un desgasificador de buit que flueix, una bomba de gradient de baixa pressió de quatre canals i una màquina automàtica.injector. Els compostos fenòlics es van separar cromatogràficament per una columna Zorbax Eclipse XDB-C18, 2.1× 50 mm, farcit amb polímer de gel de sílice octadecilsilil (1.8μ). L'anàlisi cromatogràfica es va dur a terme amb un flux de fase mòbil de 0.2ml/min, pressió de funcionament de l'eluent de 175–200 kPa, temperatura del forn de columna de 30 graus, 2 ml de volum de mostra, mode d'alimentació de l'eluent de gradient: 0–36 min 10 per cent A – 90 per cent B; 36 min - 100 per cent de B (eluent A: metanol, eluent B: solució d'àcid fòrmic al 0,2 per cent). La detecció es va realitzar per UV a les longituds d'ona de 254, 334, 350, 410, 450 i 550nm. Per a la identificació dels compostos químics de l'extracte es va utilitzar la comparació dels temps de retenció, UV i espectres de masses obtinguts amb els dels compostos de referència. L'anàlisi quantitativa es va realitzar mitjançant l'ús de verbascòsid estàndardi equinacòsid analitzats en les mateixes condicions cromatogràfiques. Les seves corbes de calibratge van permetre el càlcul de la quantitat d'uns altres fenilpropanoidesglucòsid en l'extracte d'etanol d'aquesta planta. El mètode no va ser validat.

Els animals

Ratolins Swiss Webster (20-25g, dos mesos d'edat) es van utilitzar en aquest estudi (donat per Instituto Vital Brasil, Niterói, RJ, Brasil). Els animals es van mantenir en condicions estàndard (cicle llum-foscor de 12 h, 22 ± 2 graus i 70-80 per cent d'humitat. Menjar i aigua.ad libitum). Els animals només rebien aigua per evitar la interferència dels aliments amb l'absorció de substàncies 12h abans de l'inici dels experiments. L'aclimatació a les condicions de laboratori es va produir durant almenys 1 h abans de cada prova. Tots els protocols es van dur a terme d'acord amb les Directrius sobre estàndards ètics per a la investigació del dolor experimental en animals i van seguir els principis i directrius adoptats pel Consell Nacional per al Control deExperimentació Animal (CONCEA), aprovat per laBiomedical Science Institute/UFRJ, Comitè Ètic per a la Investigació Animal i va rebre el número DFBCICB015-04/16. Tots els protocols experimentals es van realitzar durant la fase de llum. El nombre d'animals per grup es va mantenir al mínim i segons les normes de CONCEA. Al final de cada experiment, els ratolins van ser assassinats per una sobredosi de ketamina/xilazina.

Tractaments

En aquest estudi CSHE es va avaluar en 10, 30 i 100 mg/kg. L'extracte es va dissoldre en sulfòxid de dimetil (DMSO, Fisher Biotech) per tal de preparar una solució de reserva a 100ºC. mg/ml. Es va utilitzar PBS com a diluent per a la preparació de les diferents dosis. Solucions que contenen 10, 30 i 100mg/kg d'extracte hidroetanol deC. salsaestaven preparats. Els fàrmacs estàndard utilitzats van ser la morfina 2,5mg/kg (Merck, diluït en solució salina tampó fosfat (PBS)), àcid acetilsalicílic 200mg/kg (Sigma Aldrich, dissolt amb 5M d'hidròxid de sodi(NaOH) en 0,9 per cent de solució salina) i capsazepina 10 nMol per pota. Es va donar solució salina més DMSO (a la mateixa concentració que en el tractament més alt amb extracte) al grup control negatiu. Tots els tractaments (extracte provat i estàndards) es van administrar per via oral. L'única excepció va ser la capsazepina que es va administrar per injecció intraplantar.

Dolor agut induït per formalina

Es va injectar una solució de formalina al 2,5 per cent (37 per cent de formaldehid) (20ul) a la regió plantar de la pota posterior dreta dels ratolins 60min després del tractament (extracte hidroetanol deC. salsao àcid acetilsalicílic 200 mg/kg o morfina 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Els animals es van col·locar individualment en una cambra de vidre transparent i es va registrar i analitzar la durada en segons en segons que van passar llepar-se la pota després de la injecció de formol durant dos períodes separats, dolor neurogènic de fase inicial (0-5 minuts després de la injecció) i dolor inflamatori de fase tardana (15-30 min després de la injecció).

Nocicepció induïda per capsaicina

Aquesta prova es va basar en el mètode descrit per Sakurada et al. amb algunes modificacions (Sakurada et al., 1992). Capsaicina (20 ul) C18H27NO3(Galena, Campinas, SP) es va injectar a la regió plantar de la pota posterior dreta dels ratolins (1,6 ug/pota) una hora després del tractament (extracte d'hidroetanol deC. salsao capsazepina 10 nMol/pata). Els animals es van col·locar individualment en una cambra de vidre i la durada (s) de llepar-se les potes es va registrar entre 0 i 5.min després de la injecció de capsaicina i després analitzat.

Nocicepció induïda per glutamat

En el mètode descrit per Beirith et al. (2002), solució de glutamat en PBS (20 ul) (l-àcid glutàmic, Sigma-Aldrich, 3,7 ng/pota) es va injectar a la regió plantar de la pota posterior dreta dels ratolins una hora després del tractament (extracte d'hidroetanol deC. salsao morfina 2,5 mg/kg). Els animals es van col·locar individualment en una cambra de vidre i es va registrar la durada de la llepada de potes (segons) entre 0 i 15 minuts després de la injecció de glutamat i després es va analitzar.

Anàlisi estadística

Les dades químiques es presenten com a mitjana ± SD de cinc experiments. Tots els grups experimentals farmacològics estaven formats per un mínim de sis ratolins. L'anàlisi de la variància unidireccional (ANOVA) seguida de la prova de Dunnett va permetre visualitzar la significació estadística entre grups mitjançant el programari GraphPad Prism 5.0.pels valors es van considerar significatius quan eren inferiors a 0,05 (p < 0.05).

Discussió

Es van identificar un total de deu glucòsids fenilpropanoidesC. salsa(creixent al Kazakhstan) extracte d'hidroetanol. Echinacòsid (10,98 mg/g), acteòsid (9,44 mg/g) i tubulòsid B (7,94 mg/g) van ser els principals compostos identificats. Les dades obtingudes es van correlacionar amb la literatura disponible per a espècies deCistanchecreixent a diferents regions d'Àsia (Zhou et al., 2014, Xie et al., 2005, Jiang et al., 2009). L'echinacòsid i l'acteòsid són els components principals, que formen la base per a l'estandardització de les espècies oficials.C. deserticolaiC. tubulosa, inclosa a la Farmacopea Xinesa l'any 2005. Proposem que aquests compostos també es podrien utilitzar per a l'estandardització deC. salsaestolons del Kazakhstan, ja que són els principals en l'extracte d'hidroetanol estudiat.

Segons els resultats farmacològics d'aquest estudi, és possible suggerir que el CSHE és un agent eficaç contra el dolor i la inflamació neurogènics tal com s'observa en la prova de formalina. Segons el nostre millor coneixementC. salsamai s'ha provat en relació a les seves accions antinociceptives. Un estudi del 2002 ambC. deserticola(Lin et al., 2002) ha demostrat que aquesta planta presentava activitats antinociceptives i antiinflamatòries quan es va analitzar en models com la contorsió total, la formalina i l'edema de la pota.. Tot i que no hi va haver cap intent d'investigar els principals constituents dels extractes que estaven actius, van considerar que l'extracte de butanol i la capa d'aigua són els actius. No és sorprenent que aquests dissolvents estiguin a l'escala de polaritat que coincideix amb el fenilpropanoideglucòsids que es troben aC. salsa. A més, Lin i els seus companys de treball van establir que l'acció antinociceptiva deC. deserticolaextractes no es va deure a l'acció del compost en el receptor d'opiaciso relacionats amb el sistema immunitari. En el nostre estudi, l'extracte ric en fenilpropanoides va mostrar activitat en ambdues fases de la prova de formalina. L'activitat observada es va deure, de fet, a la diana farmacològica investigada i no a cap alteració motora possible com ho demostra el test de la vareta rotativa. Els resultats de les proves de formalina indiquen el potencial de dolor neurogènic, així com el dolor induït permediadors inflamatoris. Inicialment vam decidir investigar la via del dolor neurogènic. Com que compostos similars d'altres espècies estudiades anteriorment no mostraven cap activitat del receptor d'opiacis, vam decidir provar altres models, com ara models de glutamat i capsaicina.

El glutamat és un neurotransmissor excitadorque té un paper important en la modulació del dolor a tot el sistema nerviós perifèric i central. Aquesta acció està mediada per receptors de glutamat ionotròpics dependents de lligands(iGluRs) i receptors de glutamat metabotròpics. Els iGluR es poden dividir enN-metil-d-aspartat (NMDA) i -amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-àcid propiònic (AMPA) (Kolber, 2015). La investigació ha demostrat que en antagonitzar els receptors NMDA i AMPA amb ketamina ikainat, respectivament, s'observa un efecte antinocicepció. No obstant això, els antagonistes dirigits a aquests receptors fins ara han induït un efecte advers substancial i per aquest motiu s'ha dut a terme una nova investigació centrada en els mGluR amb l'esperança que la medicació mediada a través d'aquest receptor provoqui menys efectes secundaris (Palazzo et al., 2014). Els resultats de les proves del CSHE van demostrar que aquest tractament era eficaç per reduir el dolor induït pel glutamat. Tanmateix, encara es desconeix si aquest efecte està mediat per receptors ionotròpics i/o metabotròpics. La morfina és un dels fàrmacs disponibles que té un efecte sobre la transmissió glutamatèrgica (Deyama et al., 2007).). S'informa a la literatura que l'activació del receptor de glutamat augmenta les respostes TRPV1 (Szteyn et al., 2015). Per aquest motiu, és possible que l'efecte observat per a CSHE es degui a l'activitat sobre TRPV1 i no necessàriament a una resposta directa sobre els receptors de glutamat.

El següent pas d'aquesta investigació va ser dur a terme una prova de llepament de potes utilitzant capsaicina com a agent algèsic, que és un agonista del receptor TRPV1. Els resultats van mostrar que efectivament CSHE va disminuir el dolor a través del receptor TRPV1.

En el cas del CSHE, gairebé en totes les metodologies provades, vam poder observar que la dosi de 30 mg/kg va aconseguir millors resultats que els 100 mg/kg. Això pot ser degut a la saturació de la solució que condueix a compostos precipitats i, efectivament, menys quantitat de fàrmacs biodisponibles.

Confirmar la composició química establerta per a l'extracte kazakh CSHE va ser un pas important perquè els principals constituents presents en ell ja s'han confirmat d'alguna manera les seves accions antinociceptives/antiinflamatòries. Per exemple, l'echinacòsid es va establir com un dels principis actius responsables de l'acció antinociceptiva deEquinàcies(Hostettmann, 2003). A més, un estudi previ de Schapoval i col·laboradors (Schapoval et al., 1998) va assenyalar l'acteòsid com un dels principals principis actius en un extracte d'etanol preparat ambStachytarpheta cayennensistal com s'avalua mitjançant models d'edema de potes i plaques calentes. Backhouse i col·laboradors (Backhouse et al., 2008) també van considerar que l'acteòside era el principi actiu deBuddlejaglobosautilitzant diversos models d'avaluació del dolor, inclosa la prova de formalina. Ara s'estan desenvolupant noves formulacions utilitzant els coneixements més actuals per augmentar l'estabilitat i perllongar l'acció antinociceptiva de l'acteòsid (Isacchi et al., 2016).

Conclusió

Es van identificar deu substàncies de naturalesa fenòlica en els estolons del kazakhC. salsamitjançant anàlisi HPLC/MS. Aquests compostos podrien ser responsables de l'activitat antinociceptiva observada en els models experimentals realitzats aquí. Tenint en compte que al territori de Kazakhstan el gènereCistancheestà representat principalment per espèciesC. salsa, podem recomanar la seva collita i estandardització utilitzant echinacòsid i acteòside com a compostos estàndard, per obtenir una matèria primera de bona qualitat per a la medicina tradicional xinesa.