Nanopartícules antivirals d'òxid de zinc mediades per hesperidina i estudi comparatiu in silico entre fenòlics antivirals com a anti-SARS-CoV-2

Per a més informació Correu electrònictina.xiang@wecistanche.com

Des del gener de 2020, Elsevier ha creat un centre de recursos COVID-19 amb informació gratuïta en anglès i mandarí sobre el nou coronavirus COVID-19. El centre de recursos COVID-19 està allotjat a Elsevier Connect, el lloc web de notícies i informació pública de l'empresa. Elsevier concedeix permís per fer que totes les investigacions relacionades amb la COVID-19-que estiguin disponibles al centre de recursos COVID-19, inclòs aquest contingut de recerca, estiguin disponibles immediatament a PubMed Central i altres dipòsits finançats amb fons públics, com ara l'OMS. Base de dades COVID amb drets de reutilització i anàlisis de recerca sense restriccions en qualsevol forma o per qualsevol mitjà amb reconeixement de la font original. Elsevier concedeix aquests permisos de manera gratuïta mentre el centre de recursos COVID-19 roman actiu.

RESUMEl coronavirus 2 de la síndrome respiratòria aguda severa (SARS-CoV-2), que va causar el coronavirus (COVID-19), és el virus responsable de més de 69.613.607 milions d'infeccions i de més d'1.582.966 morts a tot el món. Es va considerar que totes les mesures i protocols de tractament només eren de suport i no curatius. Durant aquesta pandèmia de coronavirus actual, la recerca de medicina farmacèutica o tradicional complementària i integradora per ajudar amb la prevenció, el tractament i la recuperació ha estat avantatjosa. Aquests fitofarmacèutics i nutracèutics poden ser més econòmics, disponibles, segurs i tenir menors efectes secundaris. Es tracta d'un estudi comparatiu in silico de deu fenòlicsantiviralagents contra SARS-CoV-2, així com l'aïllament del metabòlit més actiu de fonts naturals. També es van preparar nanopartícules d'òxid de zinc (ZnO NPs) utilitzant aquests metabòlits com a agent reductor. Tots els compostos provats van mostrar una activitat anti-SARS-CoV-2 prevista.Hesperidinava mostrar la puntuació d'acoblament més alta, això ens porta a aïllar-lo de les pells de taronja i vam confirmar la seva estructura mitjançant anàlisi espectroscòpica convencional. A més, la síntesi de nanopartícules d'òxid de zinc d'hesperidina es va caracteritzar per UV, IR, XRD i TEM. L'activitat antiviral in vitro d'hesperidina i ZnO NPs es va avaluar contra el virus de l'hepatitis A com a exemple de virus ARN. Tanmateix, els ZnO NP i l'hesperidina van mostrar activitat antiviral contra el VHA, però els ZnO NP van mostrar una activitat més gran quehesperidina. Per tant, l'hesperidina i les seves nanopartícules de ZnO mediades són agents antivirals voluntaris, i es requereixen estudis posteriors contra SARS-CoV-2 com a tractament potencial.

Paraules clau: SARS-CoV-2 Nutracèutics Acoblament molecular Nanopartícules d'òxid de zinc Hesperidina

1. Introducció

La pandèmia actual de COVID-19 és responsable de més de 69 milions d'infeccions i més d'1,5 milions de morts a tot el món fins ara, 2,3 milions d'infeccions i més de 55,000 morts a l'Àfrica i més de 119,{{9} } infeccions i més de 6.000 morts a Egipte [1]. En la majoria de les persones infectades amb SARS-CoV-2, els símptomes inclouen una malaltia respiratòria lleu a moderada que es podria recuperar sense consultar al metge. Tanmateix, les persones amb malalties cròniques com les malalties cardiovasculars, la diabetis, les malalties respiratòries cròniques o el càncer tenen un major risc de desenvolupar símptomes respiratoris aguts. La transmissió de COVID-19 s'evita mantenint la distància social, rentant-se les mans o utilitzant l'esterilització amb alcohol i no tocant la cara. On es transmet a través de gotes de saliva del nas de la persona quan un individu infectat tos o esternuda [1]. Es va considerar que totes les mesures i protocols només eren de suport però no curatius. Tanmateix, hi ha molts assaigs clínics actuals que avaluen medicaments potencials [1]. Des que es va reivindicar la COVID-19 com una pandèmia global, va ser necessari buscar medicina farmacèutica o tradicional, complementària i integradora per ajudar amb la prevenció, el tractament i la recuperació [2].

Els productes naturals són fonts no aprofitades de compostos que es poden utilitzar en la prevenció i tractament de diferents malalties. A més, els compostos naturals sovint han servit com a candidats a fàrmacs més barats i segurs contra diverses malalties, es va informar que molts compostos nutracèutics tenienactivitats antivirals[3]. En l'última dècada, el nombre de nousfàrmacs antiviralsextret de fonts naturals ha augmentat significativament. Els productes naturals ajuden al descobriment de medicaments antivirals, directament o indirectament [4].

Per tant, el cribratge de biblioteques de compostos naturals mitjançant mètodes de cribratge computacionals com l'acoblament molecular pot estalviar temps i diners en el desenvolupament de fàrmacs [3]

D'altra banda, s'han demostrat compostos que contenen Znic (Zn).propietats antiviralscap a una sèrie de virus d'acord amb aquests processos físics, com ara l'adhesió de virus, la infecció per virus i la descoberta. A més de la inhibició de la proteasa viral i la polimerasa [5]. Generalment, el Zn és un element essencial que es troba als teixits del nostre cos com el múscul, el cervell, la pell, els ossos. També és un component essencial de diferents sistemes enzimàtics implicats en el metabolisme i la biosíntesi d'àcids nucleics i proteïnes [5].

Cal tenir en compte que els NP de ZnO són ​​més fàcilment absorbits pel cos que el propi zinc. Els NP de ZnO s'utilitzen actualment a la indústria alimentària com a additius i en envasos. A més, el ZnO va ser classificat com a substància segura per l'Administració d'Aliments i Medicaments dels EUA. Per tant, els NP de ZnO són ​​atractius per al seu ús en aplicacions biomèdiques. Els NP de ZnO es caracteritzen pel seu baix cost econòmic i la seva baixa toxicitat, per tant, els NP de ZnO es poden utilitzar àmpliament per a aplicacions biomèdiques com a antibacterians, anticancerígens, antidiabètics, antiinflamatoris, lliurament de fàrmacs i cicatrització de ferides [6].

Recentment, es va informar que els compostos que contenen Zn mostren activitat anti-SARS-CoV-2 [7] Per tant, els medicaments que contenen Zn es prescriuen habitualment als protocols de protecció de COVID-19. En conseqüència, la síntesi verda de ZnO NP mereix una atenció específica.

En aquest treball, una sèrie de compostos fenòlics fitofarmacèutics de plantes i aliments medicinals d'ús habitual (nutracèutics) es sotmeten a un estudi molecular in silico per explorar l'activitat antiviral contra la proteasa principal del SARS CoV-2 (Mpro) i experimentalment el compost d'acoblament més alt. es provarà al costat de les seves nanopartícules de ZnO mediades contra el virus de l'hepatitis A (HAV), un virus d'ARN similar al SARS-COV- 2.

2. Materials i mètodes

2.1. Acoblament molecular

La proteasa principal (Mpro) és un enzim important codificat pel genoma del coronavirus, amb un paper essencial en el procés de replicació i transcripció del virus, el que el converteix en un objectiu farmacèutic adequat per al SARS-CoV-2. Per revelar el mecanisme d'inhibició de compostos polifenòlics seleccionats com la rutina, la corilagina, la diosmina, la miricetina -3-O-xilosil-(1→2)-ramnòsid, l'epigalocatequina-3-O-gallat,hesperidina, lioniresinol, miricetina, naringenina i quercetina 3-O-glucurònid versus l'estructura cristal·lina del SARS-CoV-2 Mpro (6lu7) [8] que es van utilitzar amb una resolució de 2,1 Aᵒ. S'utilitzava per a l'acoblament molecular in silico. Aquesta proteïna està formada per dos polipèptids coneguts com a protòmers A i B. Aquest dímer té una simetria cristal·logràfica al llarg d'un doble eix. Conté tres dominis; el domini I (residus 8–101), el domini II (residus 102–184) amb una estructura de fulls antiparal·lels i el domini III (residus 201–303) té cinc hèlixs disposades com a cúmuls esfèrics antiparal·lels. On el domini III està connectat amb el domini II mitjançant una regió de bucle llarg (residus 185-200). SARS-CoV-2, Mpro, té una activitat catalítica acoblada Cys-His, on el lloc d'unió al substrat es troba en una escletxa entre el domini I i el domini II [8] com a la figura 1. En l'estudi actual , els procediments d'acoblament molecular van ser executats pel servei Swiss Dock [9]. Utilitzant EADock DSS, que realitza l'acoblament cec, i les seves energies CHARMM es van avaluar en una graella on es van estimar les energies més favorables amb FACTS i agrupades. Aquests cúmuls es poden visualitzar i interpretar mitjançant Quimera tal com s'informa a la literatura [10].

2.2. Materials vegetals, extracció i aïllament

Les pells de taronja (500 g) es van comprar a una fàbrica de sucs local. Es van extreure pells de taronja (200 g) amb 2 L d'aigua destil·lada calenta fins a l'esgotament. L'extracte es va filtrar i es va evaporar per concentrar-se més al buit. L'extracte d'aigua es va repartir amb CH2Cl2 seguit de butanol. La subfracció de butanol es va aplicar a fulls de paper de filtre Whatman de 3 MM utilitzant BAW com a eluent [12, 11] per produir una banda important de color porpra fosc sota llum ultraviolada (UV). La banda porpra fosc es va aïllar i es va macerar en metanol, després es va evaporar al buit mitjançant un evaporador rotatiu. El material sec es va aplicar a una columna Sephadex LH -20 utilitzant EtOH/H2O (1:1) com a eluent per produir 120 mg dehesperidina.

2.3. Ressonància magnètica nuclear (RMN)

Els espectres de ressonància magnètica nuclear (RMN) 1H es van registrar en un espectròmetre Bruker Avance III, RMN de 400 MHz i 100 MHz per a RMN 13C. Els desplaçaments químics 1H (δ) es van mesurar en ppm, en relació amb els canvis químics de TMS i 13C-NMR a dimetilsulfòxid-d6 i es van convertir a l'escala TMS afegint 39, 5.

2.4. Síntesi de nanopartícules d'òxid de zinc (ZnO NPs)

amb 500 mg d'acetat de zinc dissolts en 50 ml d'aigua bidestil·lada i escalfat al bany maria bullint durant 20 min. Després es van afegir cinc gotes d'hidròxid d'amoni a la reacció per augmentar el pH a 12, on es forma un precipitat de ZnO NPs. La mescla es va deixar durant mitja hora per a la reducció completa de l'acetat de zinc a ZnO NPs. El precipitat format es va centrifugar a 8000 rpm, seguit de rentats dues vegades amb aigua bi-destil·lada i dos rentats amb etanol per produir pellets blancs de ZnO NPs després de la liofilització.

2.5. Caracterització de nanopartícules metàl·liques

2.5.1. Anàlisi espectral UV-vis

Les preparacions de ZnO NPs es van examinar mitjançant un espectrofotòmetre UV, Shimadzu, UV-1601 (Shimadzu Corporation, Japó). Els espectres UV es van registrar entre 200-400 nm.

2.5.2. Anàlisi FT-IR

Els grups funcionals de les nanopartícules d'òxid de zinc sintetitzats i el compost d'hesperidina es van caracteritzar mitjançant un espectròmetre FTIR 6100 (Jasco, Japó) en el rang de 4000 – 400 cm−1.

2.5.3. Microscòpia electrònica de transmissió (TEM)

La morfologia i la mida de partícules dels NP de ZnO mediats per l'hesperidina es van determinar mitjançant TEM (JEOL-JEM-1011, Japó). Les gotes de la suspensió de nanopartícules es van col·locar en una graella de coure recoberta de carboni i el dissolvent es va evaporar a temperatura ambient abans de gravar la imatge TEM.

2.5.4. Difracció de raigs X (XRD)

El patró de difracció de raigs X ZnO NPs registrat amb el difractòmetre de raigs X PANLYTICAL utilitzant radiació Cu K de longitud d'ona 1d706; =0,1541 nm en el rang d'exploració 21d703;=20− 70∘.

2.6. Avaluació de l'activitat antiviral

El cribratge antiviral es va realitzar mitjançant un assaig d'inhibició de placa al Centre Regional de Micologia i Biotecnologia (RCMB, Universitat Al Azhar, El Caire, Egipte).

2.6.1. Línia cel·lular de mamífers

Les cèl·lules Vero derivades de ronyons de mico verd africà es van obtenir de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA).

Les cèl·lules Vero es van propagar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS) inactivat per calor, tampó HEPES, 1% de L-glutamina i 50 ug/mL de gentamicina. Totes les cèl·lules es van cultivar a 37 ◦ C en una atmosfera humidificada amb un 5% de CO2 i es van subcultivar dues vegades durant 7 dies [14].

2.6.2. Avaluació de la citotoxicitat

d'hesperidina i ZnO NP es van afegir després de 24 h d'implantació. Es van afegir dilucions de dues vegades en sèrie de les mostres provades (començant des de 3000 ug/ml fins a 2 ug/ml) a monocapes de cèl·lules confluents distribuïdes en plaques de microtitulació de fons pla 96-pou (Falcon, Jersey, NJ, EUA). ) amb una pipeta multicanal. Les plaques de microtitulació es van incubar a 37 ◦ C en una incubadora humidificada amb un 5% de CO2 durant un període de 2 dies. Es van utilitzar tres pous per a cada concentració de les mostres investigades. Les cèl·lules control es van incubar sense mostres de prova i amb o sense DMSO.

Després del període d'incubació, el rendiment de cèl·lules viables es va determinar mitjançant un assaig colorimètric MTT [15]. Es va representar la relació entre les cèl·lules supervivents i la concentració de mostres provades per obtenir les corbes de supervivència de la línia cel·lular Vero després del tractament amb els compostos especificats. La concentració citotòxica del 50 per cent (CC50), la concentració necessària per provocar efectes tòxics en el 50 per cent de les cèl·lules intactes, es va estimar a partir de gràfics de la corba de dosi-resposta per a cada concentració mitjançant el programari GraphPad Prism (San Diego, CA. EUA). Es va determinar la concentració màxima no tòxica [MNTC] de cada hesperidina i ZnO NPs i es va utilitzar per a estudis biològics posteriors.

2.6.3. Propagació del virus

La soca citopatògena HAV HM175 (ATCC VR-1402) de VHA es va propagar i analitzar en cèl·lules Vero confluents [16]. Els virus infecciosos es van enumerar determinant la dosi infecciosa del 50% de cultiu de teixits amb vuit pous per dilució i 20 μL d'inòcul per pou mitjançant el mètode Spearman-Karber [17].

3. Resultats i discussió

Es van seleccionar deu compostos fenòlics nutracèutics segons la seva disponibilitat i difusió com a formes de dosificació farmacèutiques derivades de fonts d'aliments nutritius naturals.

Aquests nutracèutics eren diosmina, rutina, naringenina, quercetina 3-Oglucouronide, miricetina 3-O-xilosil-(1→2)-ramnòsid, miricetina, epigalocatequina-3-O-gallat, corilagina i lioniresinol. L'hesperidina, la diosmina i la rutina estan àmpliament disponibles a les botigues farmacèutiques amb diversos noms comercials i es poden derivar de diversos aliments nutritius naturals que tenen propietats antivirals, per exemple, s'ha informat que l'hesperidina de les pells de cítrics téactivitat antiviral[18]. A partir del cribratge in silico, també es va predir que l'hesperidina s'orientaria al lloc d'interacció entre els receptors Spike del SARS-CoV-2 i ACE2, bloquejant així l'entrada del virus a les cèl·lules pulmonars humanes. Per tant, l'hesperidina podria ser un medicament profilàctic prometedor contra la COVID-19 [19].

A més, la naringenina de les pells de cítrics es va informar com a agent antiviral contra el virus Zika [20], la rutina [21] va mostrar resultats significatius com a antiviral [19]. L'epigalocatequina-3-O-gallate del te verd téefectes antiviralscontra diversos virus d'ADN i ARN [22]. La corilagina prevé el dany hepàtic inhibint la replicació del VHC i modulant l'estrès oxidatiu [23]. S'ha informat d'activitat anti-VIH per a la miricetina i els seus derivats glicosilats [24]. A més, s'ha informat que hi ha diversos lignansantiviralpropietats [25].

3.1. Acoblament molecular

En la investigació actual, es va intentar interpretar i donar suport a les troballes experimentals sobre el mecanisme d'inhibició de la proteasa principal COVID{0}}. Es van acoblar deu compostos polifenòlics mitjançant Swiss Dock Server, on es van aplicar enfocaments basats en receptors a aquests polifenols. L'estructura cristal·lina de la proteasa Covid-19 6lu7, que adopta una forma de cor, amb dos dímers de subunitats idèntiques i dos llocs actius. un inhibidor d'ampli espectre hauria de dirigir-se al lloc actiu His 41 i Cys 148 del coronavirus de ratpenat progenitor, com a l'entrada PDB 4yoi. Aquest estudi va dilucidar el mode d'unió dels compostos fenòlics a l'estructura cristal·lina 6lu7 mitjançant l'acoblament molecular (Fig. 2). L'estudi d'acoblament va confirmar que l'hesperidina pot formar interaccions electrostàtiques amb els residus THR 25, LEU 27, His 41 i Gly143 mentre forma una interacció d'apilament pi amb TYR 118 tal com s'indica a la taula 1.

La majoria dels compostos polifenòlics van mostrar activitat d'inhibició a la regió d'esquerda entre el domini II, III (ressidus 185-200) i al domini I, tal com es veu a la figura 2, mentre que a la taula 1. els compostos polifenòlics es van enumerar segons les seves energies d'unió. La relació de RMSD amb el mode d'enllaç natiu (l'aptitud completa (blau, eix X esquerre)) i l'energia (l'aptitud simple (vermell, eix y dret)) es va mostrar a la figura A, (fitxer subministrat). . El mode d'acoblament de l'hesperidina es va mostrar a (Figs. B per SARS-CoV-2 Mpro i Fig. C per a HAV 3C Proteinase [26], estructura cristal·lina 2HAL), miricetina (Fig. D, 1,2), diosmina (Fig. E 1,2), epigalocatequina -3-O-gallat (Figs F1,2), rutina (Figs G1,2), quercetina 3-O-glucurònid (Figs H 1,2), corilagina (Figs I1,2), miricetina (Figs J1,2), naringenina (Figs L1,2) i lioniresinol (Figs M1,2), a la fitxa suplementària.

3.2. Aïllament i identificació de l'hesperidina

Com que l'hesperidina va mostrar la puntuació d'acoblament més alta, aquí la vam aïllar d'un residu d'aliments (pells de taronja) i es va avaluar la seva activitat antiviral contra el VHA (un dels virus ARN).

La fracció de butanol de l'extracte aquós de les pells de taronja es va aplicar a fulls de paper de filtre Whatman utilitzant BAW com a eluent, de manera que es va observar una important banda de color morat fosc de naturalesa flavonoïdal a la cromatografia de paper preparativa. L'elució de la banda principal de color violeta fosc amb metanol va provocar l'aïllament d'un compost pur que la seva identitat va ser confirmada per 1 H, 13C com a hesperidina [27] de la següent manera: 1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6). δ 5,50 (dd, J=12,2, 3,4 Hz, 1H, H-2), 2,78 (dd, J =3,24 Hz i 17,16, 1H, H{{22} }ax), 3,26 (dd, J=17,16, 8,22 Hz, 1H, H-3eq), 6,14 (brs, 1H, H{-6), 6,12 (brs, 1H , H-8), 4,97 (d, J =7,2 Hz, 1H, H{-1′′), 4,53 (s, 1H, H{-1′′') ), 1,09 (d, J=6,2, 3H, CH3 de ramnosa). 13C RMN (101 MHz, DMSO-d6) δ 78,89 (C{-2), 42,74 (C{{64} }), 197,48 (C{-4), 163,50 (C{-5), 96,85 (C{-6), 165,60 (C{-7), 96,00 (C{{{79} }), 162,96 (C{-9), 103,79 (C{-10), 131,35 (C{{-1′ ), 118,42 (C{{-2′ ), 146,92 (C{{{{ 94}}′ ), 148,43 (C{-4′ ), 112,50 (C{-5′ ), 114,60 (C{{-6′ ), 56,15 (O-Me), 99,91 (C{-6′ ), {109}}′′), 73,45 (C{-2′′), 76,73 (C{{-3′′), 70,06 (C{{-4′′), 75,98 (C{{121 }}′′), 66,50 (C-6′′), 101,06 (C{-1′′'), 70,73 (C{{-2′′'), 71,17 (C{{{133} }}′′′), 72,53 (C{-4′′'), 68,78 (C{{-5′′'), 18,29 (CH3 de la ramnosa; C-6′′').

3.3. Formació de nanopartícules de ZnO

L'addició de solució d'acetat de zinc a la solució d'hesperidina en un bany d'aigua escalfat fins a 80 ◦ C seguida de l'addició d'unes gotes d'amoníac va provocar la precipitació de ZnO NPs [13].

3.3.1. Anàlisi UV

El pic d'absorció màxima de ZnO NPs sintetitzats mitjançant hesperidina va mostrar un pic a 335 nm (Fig. 3a) que confirma la formació de ZnO NPs [28]. El ZnO a nanoescala té longituds d'ona més curtes en comparació amb el patró d'absorció estàndard de ZnO, d'acord amb els informes que els òxids materials tendeixen a tenir longituds d'ona més curtes i que els materials a nanoescala tendeixen a tenir longituds d'ona més curtes [29].

3.3.2. Anàlisi FT-IR de ZnO NPs i hesperidina

Els espectres FT-IR (Fig. 3b) dels NPs de ZnO preparats i l'hesperidina es van recollir en el rang d'amplada espectral de 400 a 4000 cm− 1. On es van mostrar pics per als grups O-H que s'estiraven d'aigua al voltant de 3546,04, 3478,29 i 3421 cm. − 1 representen grups O–H d'hesperidina i al voltant de 3382,99 cm− 1 per ZnO NPs. Les fraccions aromàtiques es van confirmar mitjançant l'estirament de doble enllaç de carboni a 2918,50 cm−1. Vibració de flexió del –CO–H alcohòlic confirmada per la presència d'un pic a 1096,12 cm− 1. Les bandes característiques dels modes d'estirament de ZnO NPs s'assignen a 542,9 i 891,2 cm− 1 [13,30].

3.3.3.Anàlisi TEM

L'anàlisi TEM es va realitzar en microscopis electrònics de transmissió de baixa resolució i d'alta resolució i va mostrar la formació dels NP de ZnO hexagonals amb una mida de partícules que oscil·lava entre 20 i 30 nm, figura 4.

3.3.4. Anàlisi XRD

L'aparició de ZnO NPs i la investigació de les seves característiques estructurals es van confirmar per difracció de raigs X (XRD), Fig. 5. ZnO NPs mediades per l'hesperidina flavonoide van mostrar pics amb valors 2θ identificats a 31,618◦, 34,334◦, 34,334◦, 35,47, 35,4, 36,4, 36, 4, 4. ◦, 56.440◦, 62.727◦, 66.245◦, 67.864◦ i 68.925◦ corresponents a (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112) i (201). Aquests pics es van fer coincidir amb els de la targeta de dades (00− 003-0888).

Es va calcular que la mida del cristall de ZnO NPs era de 27, 73 nm. Aquestes dades són molt semblants a les mesures TEM. Per calcular la mida del cristall apliquem l'equació de Scherrer

Mida del cristall {{0}} (0,9 x λ)/ (dcosθ)

Θ=2θ/2, d=l'amplada total a la meitat de la intensitat màxima del pic (en Rad), λ =0, 154060 nm

3.4. Activitat antiviral

3.4.1. Avaluació de la citotoxicitat contra cèl·lules Vero

Les dues mostres d'hesperidina i ZnO NP van mostrar una concentració citotòxica cel·lular del 50% (CC50)=620,8 ± 34,6 i 243,7 ± 12,7 ug/mL, respectivament. Com es mostra a les Figs. K. &L., suppl. fitxer i els valors es van enumerar a les taules C i D. respectivament. Després, es van provar aquests compostosefectes antiviralscontra el VHA a la màxima concentració no tòxica (MNTC) mitjançant el mètode d'assaig de placa il·lustrat a la figura M. (fitxer suplementari).

3.4.2. Activitat anti-HAV

S'ha informat que els flavonoides tenen activitats antivirals tant in vivo com in vitro [31]. Es va informar que el mecanisme d'acció d'alguns flavonoides contra el VIH (també un virus d'ARN) es deu a la inhibició de la fosforilació de proteïnes mediada per citocines. També cal tenir en compte que la senyalització de fosforilació mediada per citocines augmenta en la infecció per COVID-19, donant lloc a la fosforilació de nombroses proteïnes del citoesquelet. Per tant, els flavonoides, que inclouen l'hesperidina, poden inhibir la fosforilació de proteïnes, que al seu torn condueix a una potent activitat antiviral i a la prevenció d'infeccions d'altres cèl·lules [32]. També s'ha informat que els NP de ZnO tenen activitat antiviral [32,33].

Es va informar que els compostos que contenen Zn afecten diverses etapes dels cicles de replicació viral, com ara la inactivació del virus, la inhibició de la no recobriment viral, la transcripció del genoma viral, la traducció de proteïnes virals i el processament de poliproteïnes. També cal tenir en compte que l'activitat depèn del tipus de virus i de la concentració de compostos que contenen zinc [34].

En el nostre estudi, les monocapes confluents de cèl·lules Vero es van infectar amb dilucions fixes del virus HAV. Després de la incubació, l'inòcul es va eliminar i es va substituir per MEM sense sèrum que contenia un 1,5 per cent de carboximetil cel·lulosa. A continuació, es van incubar les cèl·lules permetent que el virus formi les plaques. Les cèl·lules es van fixar durant 2 h a 25 ◦ C amb formaldehid que es va afegir directament al medi fins a una concentració del 5 per cent. Les cèl·lules fixes es van rentar àmpliament amb aigua abans de tacar-se amb una solució que contenia un 1% de violeta de cristall i un 10% d'etanol durant 30 min. Després d'esbandir amb aigua, es va comptar el nombre de plaques i es van calcular els títols (recomptes) de virus. Els efectes antivirals de les dues mostres provades, hesperidina i ZnO NPs contra el VHA a la màxima concentració no citotòxica (MNCC) es mostren a la taula B (fitxer suplementari). Les nanopartícules d'òxid de zinc van mostrar una activitat més alta que l'hesperidina a concentracions relativament baixes a causa de l'alta superfície i la petita mida de partícules, que van augmentar l'activitat de les nanopartícules d'òxid de zinc. De la taula B, figura T, (fitxa suplementària). Tant l'hesperidina com la ZnO NP van mostrar activitat antiviral contra el virus de l'hepatitis A (HAV) amb percentatges del 44,75 i 58,83 per cent a la màxima concentració no citotòxica i EC50 iguals a 72,4 i 176,3 ug/mL, respectivament, tal com es mostra a les taules A i B (fitxer suplementari).

4. Conclusions

L'actual malaltia pandèmica COVID-19 és responsable d'una gran quantitat de morbiditat i mortalitat a tot el món. Els compostos fenòlics nutracèutics i fitofarmacèutics del nostre estudi presenten bones puntuacions d'acoblament i podrien ser un objectiu ideal per al tractament del SARS-CoV-2. L'hesperidina, que s'aïlla de les pells de taronja de residus alimentaris, presenta la puntuació d'acoblament més alta (-8,84 Kcal/mol) contra la proteasa principal SARS-CoV{-2 entre els altres compostos provats. L'hesperidina és capaç de reduir els ions de zinc per preparar ZnO NP amb forma hexagonal i mida de partícules d'uns 25 nm. Els ZnO NP mediats per hesperidina presenten més activitat antiviral que la pròpia hesperidina amb percentatges del 44,75 i del 58,83 per cent a la màxima concentració no citotòxica. S'haurien de fer més estudis sobre l'hesperidina, altres nutracèutics, compostos fitofarmacèutics i els seus ZnO NP per trobar tractaments segurs, barats i potencials per a la malaltia pandèmica SARS-CoV-2.

Contribucions dels autors Gouda H. Attia, Yasmin S. Moemen, Mahmoud Youns, Ammar M. Ibrahim, Randa Abdou, Mohamed A. El Raey Gouda H. Attia i Mohamed A. El Raey dissenyen el manuscrit. Gouda H. Attia, Ammar M. Ibrahim i Mohamed A. El Raey van realitzar la separació cromatogràfica i van realitzar l'elucidació de l'estructura de l'hesperidina pura aïllada Gouda H. Attia, Randa Abdou i Mohamed A. El Raey van realitzar la síntesi verda de ZnO NPs i descriure les seves característiques. Yasmin S. Moemen va realitzar tots els estudis d'acoblament molecular i Mohamed A. El-Raey suggereix la proteïna.

Mahmoud Youns i Randa Abdou van realitzar els assajos antivirals i de citotoxicitat i les seves anàlisis de dades. Tots els autors van ser responsables de redactar i escriure la versió final del manuscrit i aprovar-lo.

Finançament

No s'ha rebut cap finançament per a aquesta obra.

Ètica de la investigació

A més, confirmem que qualsevol aspecte del treball tractat en aquest manuscrit que hagi implicat pacients humans s'ha dut a terme amb l'aprovació ètica de tots els organismes rellevants i que aquestes aprovacions es reconeixen dins del manuscrit.

S'ha obtingut l'aprovació de l'IRB (necessari per a estudis i sèries de 3 o més casos)

El consentiment per escrit per publicar informació potencialment identificativa, com ara detalls del cas i fotografies, es va obtenir del pacient o dels seus tutors legals.

Declaració d'Interès Concurrent

Els autors no informen de declaracions d'interès.

Agraïments

Estem agraïts al Deganat d'Investigació Científica, Universitat de Najran, KSA, per proporcionar el finançament per dur a terme aquest projecte (NU/MID/18/024).

Annex A. Dades complementàries

El material complementari relacionat amb aquest article es pot trobar, a la versió en línia, a DOI: https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.111724.

Gouda H. Attiaa,b , Yasmine S. Moemenc , Mahmoud Younsd , Ammar M. Ibrahime ,  Randa Abdouf,g , Mohamed A. El Raeyh, *  

a Departament de Farmacognosia, Facultat de Farmàcia, Universitat de Najran, Najran, Aràbia Saudita
b Departament de Farmacognosia, Facultat de Farmàcia, Universitat Kafr El-Shiekh, Kafr El-Shiekh, Egipte
c Departament de Patologia Clínica, National Liver Institute, Menoufia University, Menoufia, Egipte
d Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Farmàcia, Universitat de Helwan, El Caire, Egipte
e Facultat de Ciències Mèdiques Aplicades, Universitat de Najran, Najran, Aràbia Saudita
f Departament de Farmacognòsia, Facultat de Farmàcia, Universitat Umm Al-Qura, La Meca, Aràbia Saudita
g Departament de Farmacognosia, Facultat de Farmàcia, Universitat Helwan, El Caire, Egipte
h Departament de Fitoquímica i Sistemàtica Vegetal, Divisió Farmacèutica, Centre Nacional de Recerca, Dokki, El Caire, Egipte

Referències

[1] Organització Mundial de la Salut, OMS Coronavirus Disease (COVID-19), 2020 (Consultat el 22 d'octubre de 2020), https://www.worldometers. info/coronavirus/#països.

[2] J. Hunter, S. Arentz, J. Goldenberg, G. Yang, J. Beardsley, D. Mertz, S. Leeder, Rapid review protocol: zinc for the prevention or treatment of COVID-19 and other infeccions de les vies respiratòries relacionades amb el coronavirus, Integr. Med. Res. 9 (2020), 100457. [3] GJ Kotwal, Nutracèutics antivirals a partir de suc de magrana (Punica granatum), a Handb. Nutracèutics, vol. I, CRC Press, 2009, pàgs. 338–346.

[4] L.-T. Lin, W.-C. Hsu, C.-C. Lin, Productes naturals antivirals i herbes medicinals, J. Tradit. Complement. Med. 4 (2014) 24–35.

[5] A. Kumar, Y. Kubota, M. Chernov, H. Kasuya, Potencial paper of zinc supplementation in la profilaxi i el tractament de COVID-19, Med. Hipòtesis (2020), 109848.

[6] J. Jiang, J. Pi, J. Cai, L'avanç de nanopartícules d'òxid de zinc per a aplicacions biomèdiques, Bioinorg. Chem. Appl. (2018), https://doi.org/10.1155/2018/1062562.

[7] AJW Te Velthuis, SHE van den Worm, AC Sims, RS Baric, EJ Snijder, MJ van Hemert, Zn2 plus inhibeix l'activitat de la ARN polimerasa de coronavirus i arterivirus in vitro i els ionòfors de zinc bloquegen la replicació d'aquests virus en cultiu cel·lular, PLoS Pathog. 6 (2010), e1001176.

[8] Z. Jin, X. Du, Y. Xu, Y. Deng, M. Liu, Y. Zhao, B. Zhang, X. Li, L. Zhang, C. Peng, Structure of M pro from SARS- CoV-2 i descobriment dels seus inhibidors, Nature (2020) 1–5.

[9] A. Grosdidier, V. Zoete, O. Michielin, SwissDock, un servei web d'acoblament de molècules petites de proteïnes basat en EADock DSS, Nucleic Acids Res. (2011), https://doi.org/ 10.1093/nar/gkr366.

[10] A. Kucukelbir, FJ Sigworth, HD Tagare, Quantifying the local resolution of cryo-EM density maps, Nat. Methods 11 (2014) 63–65.

[11] HH Barakat, M. El-Raey, SA Nada, I. Zeid, M. Nawwar, Constitutive phenolics and hepatoprotective activity of Eugenia supra-axillaris leaves, EJ Chem. 54 (2011) 313–323.

[12] SM Osman, WA El Kashak, M. Wink, MA El Raey, New isorhamnetin derivatives from Salsola imbricata Forssk. Fulles amb diferent activitat antiinflamatòria, Pharmacogn. Mag. 12 (2016) S47.

[13] GH Attia, HS Alyami, MAA Orabi, AH Gaara, MA El Raey, Activitat antimicrobiana de nanopartícules de plata i zinc mediada per Calyx verd d'albergínia, Int. J. Pharmacol. 16 (2020) 236–243.

[14] P. Vijayan, C. Raghu, G. Ashok, SA Dhanaraj, B. Suresh, Activitat antiviral de plantes medicinals de Nilgiris, Indian J. Med. Res. 120 (2004) 24–29.

[15] T. Mosmann, Assaig colorimètric ràpid per al creixement i la supervivència cel·lular: aplicació als assaigs de proliferació i citotoxicitat, J. Immunol. Methods 65 (1983) 55–63.

[16] W. Randazzo, J. Piqueras, J. Rodríguez-Díaz, R. Aznar, G. S´ anchez, Improving efficient of viability-qPCR for selective detection of infectious HAV in food and water samples, J. Appl. Microbiol. 124 (2018) 958–964.

[17] RM Pinto, JM Diez, A. Bosch, Use of the colonic carcinoma cell line CaCo-2 for in vivo amplification and detection of enteric virus, J. Med. Virol. 44 (1994) 310–315.

[18] Z. Ding, G. Sun, Z. Zhu, Comunicació curta L'hesperidina atenua la lesió pulmonar induïda pel virus de la grip A (H1N1) en rates a través del seu efecte antiinflamatori, Antivir. Allà. 23 (2018) 611–615.

[19] C. Wu, Y. Liu, Y. Yang, P. Zhang, W. Zhong, Y. Wang, Q. Wang, Y. Xu, M. Li, X. Li, Analysis of therapeutic targets for SARS- CoV-2 i descobriment de possibles fàrmacs per mètodes computacionals, Acta Pharm. Sin. B (2020).

[20] AHD Cataneo, D. Kuczera, AC Koishi, C. Zanluca, GF Silveira, TB de Arruda, AA Suzukawa, LO Bortot, M. Dias-Baruffi, WA Verri, The citrus flavonoid naringenin impairs the in vitro infection of human cèl·lules pel virus Zika, Sci. Rep. 9 (2019) 1–15.

[21] Y.-J. Lin, Y.-C. Chang, N.-W. Hsiao, J.-L. Hsieh, C.-Y. Wang, S.-H. Kung, F.-J. Tsai, Y.-C. Lan, C.-W. Lin, Fisetin i rutina com a inhibidors de la proteasa 3C de l'enterovirus A71, J. Virol. Methods 182 (2012) 93–98.

[22] K. Kaihatsu, M. Yamabe, Y. Ebara, Mecanisme d'acció antiviral de l'epigallocatequina -3-O-gallate i els seus èsters d'àcids grassos, Molecules 23 (2018) 2475.

[23] BU Reddy, R. Mullick, A. Kumar, G. Sharma, P. Bag, CL Roy, G. Sudha, H. Tandon, P. Dave, A. Shukla, A natural small molecule inhibitor corilagin blocks replication HCV i modula l'estrès oxidatiu per reduir el dany hepàtic, Antiviral Res. 150 (2018) 47–59.

[24] JT Ortega, AI Su´arez, ML Serrano, J. Baptista, FH Pujol, HR Rangel, The role of the glycosyl moety of myricetin derivives in anti-HIV-1 activity in vitro, AIDS Res. Allà. 14 (2017) 1–6.

[25] RB Teponno, S. Kusari, M. Spiteller, Recent advances in research on lignans and neolignans, Nat. Prod. Rep 33 (2016) 1044–1092.

[26] J. Yin, MM Cherney, EM Bergmann, J. Zhang, C. Huitema, H. Pettersson, LD Eltis, JC Vederas, MNG James, Un catió episulfur (anell de tiirani) atrapat al lloc actiu de la proteinasa HAV 3C. inactivat per inhibidors de cetona basats en pèptids, J. Mol. Biol. 361 (2006) 673–686.

[27] VM Chari, M. Jordan, H. Wagner, PW Thies, A 13C-NMR study of the structure of an acil-linarin from Valeriana wallichii, Phytochemistry 16 (1977) 1110–1112.

[28] N. Srinivasan, C. Rangasami, JC Kannan, Estructura de síntesi i propietats òptiques de nanopartícules d'òxid de zinc, Int J Appl Eng Res. 10 (2015) 343–345.

[29] S. Fakhari, M. Jamzad, H. Kabiri Fard, Síntesi verda de nanopartícules d'òxid de zinc: una comparació, Green Chem. Lett. Rev. 12 (2019) 19–24.

[30] N. Bala, S. Saha, M. Chakraborty, M. Maiti, S. Das, R. Basu, P. Nandy, Síntesi verda de nanopartícules d'òxid de zinc amb extracte de fulla d'Hibiscus subdariffa: efecte de la temperatura sobre la síntesi, anti -activitat bacteriana, i activitat antidiabètica, RSC Adv. 5 (2015) 4993–5003.

[31] H. Zakaryan, E. Arabyan, A. Oo, K. Zandi, Flavonoids: promising natural composts against viral infections, Arch. Virol. 162 (2017) 2539–2551.

[32] M. Bouhaddou, D. Memon, B. Meyer, KM White, VV Rezelj, MC Marrero, BJ Polacco, JE Melnyk, S. Ulferts, RM Kaake, The global phosphorylation landscape of SARS-CoV-2 infecció, cel·la 182 (2020) 685–712.

[33] H. Ghaffari, A. Tavakoli, A. Moradi, A. Tabarraei, F. Bokharaei-Salim, M. Zahmatkeshan, M. Farahmand, D. Javanmard, SJ Kiani, M. Esghaei, Inhibition of H1N1 influenza virus infection per nanopartícules d'òxid de zinc: una altra aplicació emergent de la nanomedicina, J. Biomed. Ciència. 26 (2019) 1–10.

[34] SA Read, S. Obeid, C. Ahlenstiel, G. Ahlenstiel, El paper del zinc en la immunitat antiviral, Adv. Nutr. 10 (2019) 696–710.