Absència aparent de BMAL1-conversació entre múscul esquelètic i ronyó dependent en ratolins Ⅱ

3. Resultats

3.1. Verificació del model iMS-BMAL1 KO

Eleliminatòria per al ratolíel model d'aquest estudi va ser induït per tamoxifè; per tant, es va avaluar l'eficàcia d'aquesta injecció per a tots els ratolins. La PCR de recombinació per a BMAL1 en teixit muscular esquelètic masculí d'iMS-BMAL1 KO va donar dues bandes per confirmar la recombinació mitjançant injecció de tamoxifè, una banda de 431 pb que representa l'al·lel Bmal1 floxed i una banda de 572 pb que representa el producte de recombinació [12] (Figura 1A). ). Una única banda de 431 pb indica una manca de recombinació tal com es veu en els ratolins tractats amb vehicles. Es va verificar el knockout en tots els ratolins mitjançant PCR de recombinació després de l'eutanàsia. En aquest model de ratolí, BMAL1 només s'hauria d'eliminar dins del múscul esquelètic. Es va avaluar l'expressió de la proteïna BMAL1 en seccions de ronyó per assegurar-se que no hi havia cap efecte. L'anàlisi de BMAL1 (taca marró) marcada immune va demostrar que l'expressió de BMAL1 en elel ronyó no està afectaten ratolins iMS-BMAL1 KO (figura 1B). La tinció nuclear marró BMAL1 es va trobar a totes les cèl·lules renals dels dos grups.

Figura 1. L'expressió de BMAL1 no està alterada als ronyons d'iMS-BMAL1 KO. (A) Assaig de PCR de recombinació en teixit muscular esquelètic. Els cebadors directes i inversos de l'al·lel Bmal1 floxat van donar una banda de 431 pb, que es va veure en iMS-BMAL1 KO i ratolins control. Un segon cebador directe va detectar el producte recombinat amb una banda de 572 pb, que només es va veure a iMS-BMAL1 KO. ArroWindica la banda que es troba en ratolins eliminadors. (B) Imatges representatives de seccions de ronyó que demostren l'expressió de la proteïna BMAL1 en ratolins control i iMS-BMAL1 KO. La figura mostra l'escorça renal. Els marcadors indiquen cèl·lules tacades de BMAL1-positives. La barra d'escala representa 0,05 mm. Els ratolins que es mostren a la figura són de la cohort d'avançament de fase. S=escala estàndard, ratolins de control CL =, ratolins KO=iMS-BMAL1KO.

3.2. Fluid i solut

Manipulació en condicions basals i després de l'esgotament del potassi Com que el ronyó és tan resistent a la pertorbació fisiològica, especialment en els ratolins C57Bl/6 [15], vam desafiar una cohort de ratolins que utilitzaven la privació de potassi en la dieta. Anteriorment hem demostrat que els ratolins KO mascles BMAL1 específics del ronyó presenten un fenotip de manipulació de sodi en resposta a una dieta K zero [10]. Tant els ratolins control com iMS-BMAL1 KO van excretar un 34% menys de sodi després d'una dieta esgotada en potassi en comparació amb la línia de base; tanmateix, no hi va haver cap diferència en l'excreció de sodi entre els dos grups a partir de l'orina recollida durant els períodes actius o inactius (figura 2A, B). Com era d'esperar, l'excreció de potassi va baixar a nivells mínims en 24 hores després de l'esgotament de potassi durant els períodes actius i inactius (figura 2C, D). No hi va haver cap diferència entre els ratolins control i iMS-BMAL1 KO en l'excreció de potassi. L'aigua corporal total va augmentar un 6% després de l'esgotament de potassi en ambdós grups (figura 2E). A més, hi va haver una tendència que els ratolins iMS-BMAL1 KO tinguessin més aigua corporal total que el control amb els ratolins iMS-BMAL1 KO amb nivells un 2-3% més alts que els controls, tot i que això no va ser significatiu (p=0.06). ).

Figura 2. No hi va haver cap diferència en la manipulació de sodi entre els grups després de l'esgotament de potassi. L'excreció de sodi durant la nit (A) i (B) durant el dia del control masculí i iMS-BMAL1 KOratolins tractats amb una dieta normal i cinc dies amb una dieta esgotada en potassi. Excreció de potassi durant la nit (C) i durant el dia (D) en els mateixos ratolins. Les recollides d'orina es van realitzar cada 12 h (E) L'aigua corporal total es va normalitzar al pes corporal dels ratolins abans i després del tractament de cinc dies amb una dieta esgotada en potassi. (F) Anàlisi estadística per a cada panell de la figura 2. n=4-5. Els valors són mitjans + SEM. Es va utilitzar ANOVA bidireccional per comparar grups. La prova de comparacions múltiples de Sidak es va utilitzar per comparar entre control i KO dins dels grups de tractament. *=p < 0.05, **=p < 0,001UNaV=excreció urinària de sodi; UKV= excreció urinària de potassi; Normal=dieta normal; LowK= dia de tractament amb dieta esgotada en potassi.

3.3.Avaluació de la funció mitocondrial

Anteriorment, les ineficiències metabòliques estan relacionades amb la supressió de BMAL1 [7,12,16,17. Per determinar si un efecte del knockout de BMAL1 del múscul esquelètic va influir en els mitocondris renals, primer vam avaluar l'expressió de la proteïna de desacoblament mitocondrial 1 (UCP1) a l'escorça renal de ratolins iMS-BMAL1 KO en comparació amb el control. L'expressió de proteïna UCP1 cortical renal basal va tendir a ser més alta en els ratolins iMS-BMAL1 KO en comparació amb els controls, però no va assolir importància (figura 3A, B; p=0.058). A causa de les subtils diferències en l'UCP1 cortical, es va dur a terme un enfocament més rigorós per avaluar l'efecte d'iMS-BMAL1 KO sobre la funció mitocondrial renal realitzant assajos de respirometria d'alta resolució en mitocondris aïllats deregions corticals dels ronyons. La funció respiratòria mitocondrial cortical renal en qualsevol estat respiratori mesurat (L, PCI, PCI + II, ECI + II, ECII, ECIV), així com les proporcions de control de flux eren similars entre els grups (figura 3C, D). La relació de control respiratori, un indicador de la respiració acoblada (PCI/L), va tenir una mitjana de 3,4 i 3,3 per als ratolins control i iMS-BMAL1 KO, respectivament. La capacitat de recanvi (o reserva), la diferència entre la capacitat màxima OXPHOS (PCI+II) i la capacitat màxima ETS (ECI+II), va ser del 22% i del 19% de l'ECI+II per als controls i els ratolins iMS-BMAL1 KO, respectivament, i ho va fer. no difereixen significativament.

3.4. Marcadors inflamatoris al ronyó

Anteriorment s'ha demostrat que el múscul esquelètic provoca un augment de la inflamació al ronyó per l'alliberament de residus metabòlics. Es van mesurar panells de marcadors inflamatoris i de lesions a l'escorça renal i la medul·la dels ratolins iMS-BMAL1 KO i control. Els nivells d'interleucina cortical (lL) 6 van ser més de 7 vegades més grans en els ratolins iMS-BMAL1 KO en comparació amb els controls (taula 1). De la mateixa manera, hi va haver una tendència que els nivells d'IL-6 fossin més alts al teixit medul·lar dels ratolins iMS-BMAL1 KO en comparació amb els controls, però això no va arribar a ser significatiu (p= 0.07). També es va trobar que l'inhibidor del teixit medul·lar dels nivells de metaloproteinasa 1 (TlMP-1) era més alt en els ratolins iMS-BMAL1 KO, gairebé dues vegades més que els controls (taula 1). No hi va haver cap diferència en els nivells de factor de creixement de fibroblasts 23, IL-10, renina o molècules de lesió renal al teixit cortical o medul·lar d'iMS-BMAL1 KO versus ratolins control. A més, no es va trobar cap diferència en els nivells corticals IL-5, IL-17 o TIMP{-1 entre els dos grups (taula 1).

3.5. Lesió i funció renal

L'estrès circadià del comportament, com el jet lag, provoca efectes nocius sobre la salut general [18,19]. Com que la privació de potassi en la dieta no semblava afectar de manera diferent els ratolins iMS-BMAL1 KO en termes de funció excretora renal, vam plantejar la hipòtesi que la interrupció circadiana del comportament podria alterar la funció renal en iMS-BMAL1 KO en comparació amb els ratolins control. L'avanç de fase és un mètode comú per provocar una interrupció circadiana [20, 21]. Els ratolins es van sotmetre a un protocol d'avançament de fase de 2-setmanes i 14-h per canviar els períodes de nit/dia. El GFR era similar entre iMS-BMAL1 KO i els ratolins de control abans i després de l'avanç de fase (figura 4A). Es va observar una lesió tubular mínima en ratolins iMS-BMAL1 KO i controls després de l'avaluació histològica de les seccions de ronyó recollides després de l'avanç de fase (figura 4B).

3.6. Efectes extrarenals de iMS-BMAL1 KO

Atesa la manca d'un fenotip al ronyó dels ratolins iMS-BMAL1 KO, vam provar el pulmó per determinar si la pèrdua específica del múscul esquelètic de BMAL1 afecta negativament a altres teixits. Els pulmons es van recollir de ratolins seguint el protocol d'avançament de fase per a citometria de flux per avaluar marcadors inflamatoris [14]. Vam trobar que el perfil d'ajust de cèl·lules derivades de la medul·la òssia de la infiltració de cèl·lules supressores derivades de mieloides monocítica i neutròfila immunomoduladora (Mo-MDSC i PMN-MDSC, respectivament) va augmentar als pulmons dels ratolins iMS-BMAL1 KO en comparació amb els controls (figura 5). ). Aquestes troballes suggereixen una reprogramació potencial de la població de cèl·lules immunitàries amb interrupció de la senyalització BMAL1 al múscul esquelètic.

Figura 4. La interrupció del rellotge del múscul esquelètic no afecta la funció renal ni provoca lesió tubular. ( A ) Taxa de filtració glomerular mesurada mitjançant un monitor subcutani abans i després de l'avanç de fase en els ratolins control i iMS-BMAL1 KO. n=5. (B) Imatges representatives de seccions de ronyó tenyides amb hematoxilina i eosina de ratolins control i iMS-BMAL1 KO després de l'avanç de fase. Es mostra la regió cortical. La barra d'escala representa 0,05 mm. (C) Percentatge de túbuls que presenten signes de lesió observats en seccions de ronyó tacades d'ambdós grups de ratolins. n=4–5. Totes les dades es presenten com a mitjana ± SEM. Es va utilitzar ANOVA bidireccional per comparar les dades de la taxa de filtració glomerular dels grups. La prova t de Student es va utilitzar per comparar grups a partir de dades d'avaluació de lesions tubulars. GFR=taxa de filtració glomerular; NS=no significatiu

mitjana ± SEM. La prova t de Student es va utilitzar per a les comparacions entre grups. Mo-MDSC=cèl·lules supressores derivades del mieloide monocític; PMN-MDSC=polimorfonuclear

4. Discussió

La principal troballa d'aquest estudi és que la supressió de BMAL1 al múscul esquelètic no va contribuir a canvis en la funció renal ni va provocar una lesió renal visible en les condicions provades. Hi ha diverses maneres en què el múscul esquelètic pot afectar negativament la funció renal, inclosa l'alliberament de residus metabòlics i les contribucions a la resistència a la insulina [22,23]. A més, la interrupció del rellotge del múscul esquelètic produeix un fenotip d'envelliment en ratolins (una altra característica del desenvolupament de la malaltia renal) [6,16]. Malgrat que els ratolins iMS-BMAL1 KO presentaven característiques d'envelliment i signes d'augment de la inflamació renal, no es va detectar cap dany renal ni disminució de la funció renal.

Els canvis patològics renals induïts per l'edat inclouen el desenvolupament del glomerulóscle. rosis, fibrosi intersticial i pèrdua tubular [24,. Aquestes progressions en la lesió renal condueixen a una disminució de la GFR i a una disfunció en la manipulació de soluts i aigua. En aquest estudi, es va avaluar la GFR i la manipulació de soluts per determinar la funció renal. Els ratolins van ser desafiats amb (1) un canvi en el potassi dietètic per alterar la manipulació de soluts o (2) un canvi en l'horari nit/dia per exposar qualsevol possible anomalia en la funció renal. Els estudis en ratolins i humans mostren constantment que l'esgotament de potassi en la dieta condueix a un augment de la retenció de sodi [25-28]. Els dos grups de ratolins en aquest estudi van demostrar la retenció de sodi després d'una dieta esgotada en potassi, com s'esperava, però no hi va haver cap diferència en la manipulació de soluts entre els grups abans o després de la manipulació dietètica. El GFR també va ser similar entre els grups abans i després de l'avançament de la fase. No vam observar cap signe de lesió renal, no hi va haver cap diferència en l'alimentació o l'activitat entre aquests grups de ratolins d'estudis anteriors [7,12]. En general, no hi va haver canvis en la funció renal similars al que es veu en un fenotip envellit.

Hi ha una gran abundància de mitocondris alassociada al ronyóamb un alt consum d'oxigen, que només és el segon després del cor [29]. Un subministrament d'ATP és extremadament important per a la funció renal, i el deteriorament mitocondrial s'ha relacionat amb la progressió de la malaltia renal [22,30]. A partir d'informes anteriors sobre ineficiències metabòliques en ratolins BMAL1-KO específics i globals del múscul esquelètic [7,12,16,17], vam avaluar la funció mitocondrial renal. L'absència de BMAL1 al múscul esquelètic i els canvis associats en aquest model de ratolí no van afectar la funció respiratòria mitocondrial al ronyó.

L'homeòstasi dels electròlits està molt influenciada per laaccions del múscul esquelètic, especialment en resposta a la privació de potassi [31]. Aquí no es va avaluar el paper potencial del múscul esquelètic BMAL1 en el canvi intracel·lular de l'equilibri de potassi en resposta a l'esgotament de potassi. Aquest estudi es va centrar en el ronyó, que és el regulador final de l'equilibri electròlit. Curiosament, els ratolins iMS-BMAL1 KO van mostrar una menor excreció de potassi durant la fase de repòs amb una dieta normal en comparació amb els ratolins control. Cal tenir en compte que no es va observar cap diferència durant la fase activa, que és quan té lloc la major part de l'excreció. A més, quan es combinen les dades de fase activa i inactiva, no hi ha cap diferència en l'excreció de 24-hora. Una limitació d'aquest estudi és que no vam poder avaluar el potassi sèric al final de l'estudi d'esgotament de potassi en la dieta. Aquest és un paràmetre important a tenir en compte a l'hora d'avaluar la diafonia entre el múscul esquelètic i el ronyó.

Els ratolins iMS-BMAL1 KO presentaven moltes característiques d'un fenotip poc saludable i envellit, com ara una marxa alterada, mobilitat reduïda, debilitat muscular i captació deteriorada de glucosa [6,7,12,16]. Els indicadors d'un impacte negatiu de la supressió de BMAL1 al múscul esquelètic en altres òrgans eren evidents. Aquest estudi va examinar l'efecte sobre el ronyó. Encara que nivells elevats de TIMP-1 i IL-6 s'han associat amb el desenvolupament demalaltia renal[32,33], les dades d'aquest estudi indiquen que la funció renal no es veu afectada malgrat un augment significatiu d'aquests marcadors. Com es demostra amb un augment de la infiltració de monòcits i neutròfils del teixit pulmonar dels ratolins iMS-BMAL1 KO, òrgans addicionals, inclosos els pulmons, poden demostrar una funció alterada.

S'ha demostrat que l'administració de tamoxifè provoca efectes secundaris adversos. S'ha demostrat que el tamoxifè indueix el desenvolupament d'hèrnies en ratolins mascles [34]. D'altra banda, el tamoxifè ha demostrat característiques antifibròtiques en amalaltia renalmodel [35]. En aquest estudi, es va necessitar un tractament amb dosis baixes de tamoxifè durant només cinc dies per induir suficientment l'eliminació de BMAL1 del múscul esquelètic. Els ratolins no es van mantenir amb tamoxifè durant un llarg període. A més, no es van realitzar experiments amb ratolins fins cinc setmanes després del tractament amb tamoxifè. És poc probable que el tamoxifè hagi afectat els resultats d'aquest estudi.

5. Conclusions

En conclusió, els ratolins mascles amb supressió de BMAL1 del múscul esquelètic no van mostrar una funció renal alterada nilesió renalsota les condicions provades. La troballa d'inflamació als pulmons indica que els òrgans extrarenals poden veure's afectats per la interrupció del rellotge del múscul esquelètic, independentment de qualsevol canvi al ronyó. En general, el ronyó mostra resiliència al fenotip d'envelliment que mostren els ratolins iMS-BMAL1 KO.

Contribucions de l'autor:

Conceptualització, GRC, SEW, AJB, KAE i MLG; Curació de dades, SEW, CAW, MAG-M., CMD, EE, K.-YC, SHM i DB; Anàlisi formal, GRC, CMD, EE, K.-YC, SHM, DB, AJB, KAE i MLG; Adquisició de finançament, KAE i MLG; Investigació, GRC; Metodologia, GRC, CAW, AJB i MLG; Administració de projectes, MLG; Recursos, MLG; Redacció-esborrany original, GRC, KAE i MLG; Redacció-revisió i edició, GRC, SEW, CAW, MAG-M., CMD, EE, K.-YC, AJB, KAE i MLG Tots els autors han llegit i acceptat la versió publicada del manuscrit.

Referències

1. Jo, SH; Yamazaki, S.; Lowrey, PL; Shimomura, K.; Ko, CH; Buhr, ED; Siepka, SM; Hong, Hong Kong; Oh, WJ; Jo, OJ; et al. Període 2: l'informe en temps real de la luciferasa de la dinàmica circadiana revela oscil·lacions circadianes persistents als teixits perifèrics del ratolí. Proc. Natl. Acad. Ciència. EUA 2004, 101, 5339–5346. [CrossRef] [PubMed]

2. Partch, CL; Verd, CB; Takahashi, JS Arquitectura molecular del rellotge circadià dels mamífers. Tendències Cell Biol. 2014, 24, 90–99. [CrossRef] [PubMed]

3. Gumz, ML Bases moleculars de la ritmicitat circadiana en fisiologia i fisiopatologia renals. Exp. Physiol. 2016, 101, 1025–1029. [Ref creuat]

4. Richards, J.; Gumz, ML Mecanisme del rellotge circadià en fisiologia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2013, 304, R1053–R1064. [CrossRef] [PubMed]

5. Egstrand, S.; Mace, ML; Olgaard, K.; Lewin, E. El rellotge circadià vascular en la malaltia renal crònica. Cells 2021, 10, 1769. [CrossRef] [PubMed]

6. Schroder, EA; Harfmann, BD; Zhang, X.; Srikuea, R.; Anglaterra, JH; Hodge, BA; Wen, Y.; Riley, LA; Yu, Q.; Christie, A.; et al. El rellotge muscular intrínsec és necessari per a la salut musculoesquelètica. J. Physiol. 2015, 593, 5387–5404. [Ref creuat]

7. Harfmann, BD; Schroder, EA; Kachman, MT; Hodge, BA; Zhang, X.; Esser, KA La pèrdua específica del múscul de bmal1 condueix a una interrupció del metabolisme de la glucosa dels teixits i de l'homeòstasi sistèmica de la glucosa. Esquelet. Muscle 2016, 6, 12. [CrossRef]

8. O'Sullivan, ED; Hughes, J.; Ferenbach, DA Envelliment renal: causes i conseqüències. J. Am. Soc. Nefrol. 2017, 28, 407–420. [Ref creuat]

9. Xie, Z.; Su, W.; Liu, S.; Zhao, G.; Esser, K.; Schroder, EA; Lefta, M.; Stauss, HM; Guo, Z.; Gong, MC Smooth-muscle bmal1 participa en la regulació del ritme circadià de la pressió arterial. J. Clin. Investig. 2015, 125, 324–336. [CrossRef] 10. Crislip, GR; Douma, LG; Masten, SH; Cheng, KY; Lynch, IJ; Johnston, JG; Barral, D.; Glasford, KB; Holzworth, MR; Verlander, JW; et al. Diferències en la contribució renal bmal1 a na. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 318, F1463–F1477. [Ref creuat]

11. Morla, L.; Ribera, O.; Lynch, IJ; Merritt, ME; Wingo, CS Un mètode no invasiu per estudiar l'evolució del volum de líquid extracel·lular en ratolins mitjançant ressonància magnètica nuclear en el domini del temps. Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 319, F115–F124. [CrossRef] [PubMed]

12. Hodge, BA; Wen, Y.; Riley, LA; Zhang, X.; Anglaterra, JH; Harfmann, BD; Schroder, EA; Esser, KA El rellotge molecular endogen orquestra la separació temporal del metabolisme del substrat al múscul esquelètic. Esquelet. Muscle 2015, 5, 17. [CrossRef] [PubMed]

13. Harrison, DK; Fasching, M.; Fontana-Ayoub, M.; Gnaiger, E. Estats redox del citocrom i control respiratori en mitocondris de ratolí i cor de vedella a nivells d'hipòxia en estat estacionari. J. Appl. Physiol. (1985) 2015, 119, 1210–1218. [CrossRef] [PubMed]

14. Oliveira, AC; Fu, C.; Lu, Y.; Williams, MA; Pi, L.; Brantly, ML; Ventetuolo, CE; Raizada, MK; Mehrad, B.; Scott, EW; et al. L'eix de senyalització de quimiocines entre les cèl·lules endotelials i mieloides regula el desenvolupament de la hipertensió pulmonar associada a la fibrosi pulmonar i la hipòxia. Am. J. Physiol. Mol de cèl·lules pulmonars. Physiol. 2019, 317, L434–L444. [Ref creuat]

15. Rabe, M.; Schaefer, F. Models de ratolins no transgènics de malaltia renal. Nephron 2016, 133, 53–61. [Ref creuat]