caLlenguatge
Casa / Coneixement / Contingut

Coneixement

L'autofluorescència com a biomarcador no invasiu de senescència i productes finals de glicació avançada a Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

DISCUSSIÓ

Anteriorment, l'autofluorescència s'ha utilitzat per controlar la lipofuscina, el pigment de l'edat, com a biomarcador de la senescència.4,13. Encara que vam observar vermellFluorescència indicativa de la lipofuscina com s'ha vist en estudis anteriors9, blauFlLa uorescència es va detectar en una etapa anterior de la vida quan es van examinar els cucs mitjançant un M165 FCFlestereomicroscopi d'orescència (Leica Microsystems, Tòquio, Japó) (dades no mostrades). L'objectiu del present estudi era examinar si l'autofluorescència blava podria servir com a marcador més sensible per rastrejar la senescència de cucs individuals.

anti- senescence cistanche function

Cistanche PerAntisenescència

Buy Cistanche

Producte Cistanche anti-envelliment llest per enviar


ElFlla uorescència mesurada en cucs individuals va augmentar amb l'edat; quants menys cucsFluorescent, com més llarga sigui la seva esperança de vida. Així, blauFlLa uorescència pot proporcionar un biomarcador alternatiu per rastrejar la senescència. Tanmateix, Pincus et al. va informar que els cucs que van morir posteriorment (en 24 h)Fluorescent a causa de la biosíntesi de la quinurenina; aquests investigadors van anomenar aquesta llum blava"mortFluorescència". Sembla que la mortFluorescència reFlemissió d'efectes per una forma glicosilada d'àcid antranílic produïda per la via de la quinurenina; l'automòbilFlEl material uorescent es detecta en grànuls intestinals semblants a lisosomes31. Aquesta llum blava podria ser el mateix marcador de mort que Coburn et al. observat enC. elegansdurant diverses hores abans i després de la mort, i això es va observar tant en cucs joves sotmesos a ferides letals com en cucs que morien naturalment de vellesa. De fet, vam observar que elamable-1El mutant, que no té activitat de quinureninasa, era menys autofluorescent que el de tipus salvatge. Tanmateix, els nostres resultats van indicar que una part del blauFlLa uorescència s'associa amb l'envelliment més que no pas amb la mort. En particular, com es mostra a la Fig.3b, els cucs envellits van mostrar un blau augmentatFluorescència fins i tot si s'exclouen les dades obtingudes dins dels 2 dies anteriors a la mort. A més, els cucs encaraFlva augmentar més amb l'envelliment, independentment de l'estat de lakynu-1gen. ReduïtFluorescència en elkynu-1Per tant, el mutant hauria de ser degut a la pèrduade l'acceleració de la síntesi d'AGE per les quinurenines en lloc de la manca de mortFluorescència32.


Alguns compostos AGE ho sónFlUorescents27. Hem deduït que el blauFlLa uorescència pot incloure l'emissió d'aquests AGE, independentment de la atribuïble a la mortFluorescència. Quan les proteïnes de cuc extretes es van incubar amb sucres in vitro, elFlla intensitat de la uorescència i els nivells d'AGEs van augmentar amb el temps. Cucs cultivats en un medi que conté ribosaFlEls animals uorescents més que els de control es cultiven en absència de ribosa suplementària, fins i tot quankynu-1estava mutat. En canvi, els cucs cultivats en presència de rifampicina, un conegut inhibidor de la producció d'AGEs, van mostrar nivells reduïts de blau.Fluorescència. De fet, la microscòpia de fluorescència va indicar que els 13-cucs d'un dia emetien més llum blava que els 3-adults joves d'un dia. La immunotinció amb anticossos anti-CML o anti-pentosidina no va mostrar la presència d'AGEs de propagació difusa en un patró de distribució semblant al del blau.Fluorescència. ElFluorescència podria originar-se d'altres abundantsFlAGEs uorescents com ara A vespertina, LM-1 i argpirimidina33,34.


Per proporcionar el rovell per als ooquists,C. elegansels hermafrodites consumeixen la seva pròpia biomassa intestinal, la qual cosa provoca atròfia intestinal i deposició de rovell ectòpic en la vida posterior. Les vitelogenines (proteïnes del rovell) estaven presents a nivells dues vegades més alts en els cucs vells (en comparació amb els animals més joves), tal com es va informar abans.35, i va exhibir sis vegades més granFluorescència després de la glicació in vitro. Aquestes dades suggereixen que les mateixes vitelogenines generarien 12- vegades més gransFluorescència en cucs més grans en comparació teòrica amb els adults joves. Western blotting va demostrar que les bandes principals que reaccionen amb l'anticossos anti-LMC eren les proteïnes del rovell. Aquesta troballa coincideix amb els informes anteriors de Nakamura et al., que van detectar una gran glicació de vitelogenina36, i Golegaonkar et al., que van detectar una disminució de la glicació en vitelogenina-2, vitelogenina-6 i factor d'allargament 1 alfa en nematodes tractats amb rifampicina30. Segons s'informa, les vitelogenines actuen com a antioxidants i contribueixen a la longevitat de les reines de les abelles.37. EnC. elegans, les vitelogenines tenen un paper crucial en la resistència a l'estrès 38. Com que els antioxidants es poden oxidar fàcilment, l'acumulació de vitelogenina glicada pot perjudicar la protecció del dany oxidatiu, donant lloc a una relació inversa entre l'esperança de vida i la intensitat del blau.Fluorescència observada en el present estudi. Tanmateix, Sornda et al. recentment es va informar que la vida útil no està relacionada amb la resistència a l'estrès oxidatiu mediada per YP115/YP88 (vitellogenina-6)39. Aquests investigadors van proposar que l'acumulació de vitelogenina YP170, derivada de les vitelogenines 1–5, provoca atròfia intestinal i disminució de la vida útil, mentre que l'acumulació de YP115/YP88 pot retardar l'atròfia intestinal i allargar la vida útil. Per tant, la glicació de la vitelogenina-6 i la disfunció resultant poden contribuir a la senescència. Encara que factors d'allargamentFlva augmentar tres vegades més intensament després de la glicació in vitro, les quantitats d'aquestes proteïnes eren similars entre cucs joves i vells. Per tant, la contribució d'aquest factor a l'autofluorescència millorada pot ser menor que la atribuïble a les vitelogenines.

anti- senescence cistanche function


Cistanches'ha utilitzat generalment com a modelestudiarintervencions de senescència i antisenescència. Vam proposar l'ús del cuc com a model per investigar els efectes a favor de la longevitatde bacteris làctics8. Donada la demostració (en el present estudi) que blauFlLa uorescència en nematodes és un possible indicador de l'acumulació d'AGEs, ho proposemCistanche els hermafrodites poden servir de model per investigar la utilitat de les intervencions antisenescència que actuen mitjançant la supressió de la producció d'AGEs. En canvi, és poc probable que l'autofluorescència sigui un biomarcador de senescència per als cucs masculins perquè les vitelogenines han de ser escasses.

anti- senescence cistanche function

Fig. 5 Fluorescència blava dels mutants kynu-1, que no haurien d'emetre fluorescència mortal. aIntensitat de fluorescència (p. ex. 340/em 430) de 7-dia i 13-diakynu-1mutants (n = 37 cadascun); els cucs més vells encara emeten mésFluorescència que els cucs més joves, malgrat lakynu-1mutació. No obstant això, cap signeFifiEs va detectar una diferència en els valors d'autofluorescència pel Mann–WhitneyU prova.b Un 7-cuc d'un dia mantingut amb ribosa emetia més blauFluorescència malgrat laamable-1mutació. BlauFluorescència deC. eleganscultivat amb ribosa (n = 24) o sorbitol (n = 18) es va comparar amb la dels cucs control sense els sucres (n = 20). Els valors d'autofluorescència es van comparar mitjançant l'acer no paramètric–Mètode Dwass (**p < 0.01). c Corbes de supervivència deC. eleganscultivat amb ribosa (n = 62) o sorbitol (n = 84) es van comparar amb la dels cucs control sense els sucres (n = 64). Els cucs tenien 3 dies el dia 0. La supervivència dels nematodes va ser calculada pel Kaplan–Es va provar la importància del mètode Meier i de les diferències de supervivència mitjançant l'ús de la prova de rang de registre (**p < 0.01).


MÈTODES

NematodesCistanche La soca Bristol N2 i les seves soques mutants derivades van ser amablement proporcionades pel Caenorhabditis Genetics Center de la Universitat de Minnesota. Les mutacions utilitzades en aquest estudi van ser CB1370daf-2 (e1370)i CB1003kynu-1 (E1003). Els nematodes es van mantenir i es van propagar a NGM segons la tècnica estàndard 40. Els ous de cuc es van recuperar de cucs adults després de l'exposició a una solució d'hipoclorit de sodi/hidròxid de sodi tal com es va descriure anteriorment 41. Les suspensions d'ous es van incubar durant la nit a 25 graus per permetre l'eclosió i la suspensió. de cucs en fase L1-es va centrifugar a 156 ×g durant 1 min. Es va eliminar el sobrenedant i les larves restants es van transferir a plaques fresques de NGM modificat sense peptona (mNGM) cobertes ambE. colisoca OP50 (OP50). Les soques es van cultivar en plaques d'agar mNGM a 25 graus, exceptedaf-2soca, que es va cultivar a 20 graus fins a l'etapa L4. Tots els assajos es van començar amb cucs adults joves que van començar a posar ous a 25 graus. No es va requerir cap aprovació ètica per als nematodes.Soques bacterianesL'OP50 es va utilitzar com a aliment de nematodes establert internacionalment. L'agar de soja triptona (Nissui Pharmaceutical, Tòquio, Japó) es va utilitzar per cultivar OP50. Els bacteris (100 mg de pes humit) es van suspendre en 0,5 ml de tampó M9; A continuació, es va estendre una alíquota de 50-µL de la suspensió bacteriana al mNGM en plaques de 5,5-cm de diàmetre tret que s'indiqui el contrari.


anti- senescence cistanche function

Anàlisi multivariant de l'autofluorescència

Es van recuperar poblacions de 100 adults cadascun als 3 i 17 dies d'edat,rentat tres vegades, concentrat en 3 µL de tampó M9 i emmagatzemat congelata les–80 graus fins al seu ús. Abans de l'extracció, 3 µL de tampó de lisi (constituït perTampó Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, dodecil sulfat de sodi al 0,1 per cent(SDS), 1 per cent de Tritó X-100, 1 mM de fenilmetilsulfonilFluorur (PMSF) i
Es van distribuir a cada tub un 2 per cent de 2-mercaptoetanol) i 4 µl de SDS del 15 per cent. Després es van sotmetre mostresFicinc cicles de congelació-descongelació per alliberar proteïnes. Els espectres fotoluminescents es van recollir amb aFluorescènciaespectrofotòmetre (Hitachi FL{{0}}) amb programari d'interpretació de dades (FL Solutions ver. 2.0). Les propietats de fluorescència de les suspensions de nematodes eren

analitzat mitjançant una matriu d'excitació-emissió (EEM)Flespectroscòpia d'uorescència. Anàlisi multivariant (excitació d'una sola longitud d'ona amb múltiplesemissió de longitud d'ona i exploració síncronafluorometria) va produir gràfics EEM consistents en excitació d'un sol escaneig, i síncronfluorescènciaes van dibuixar els espectres de cada sèrie.



Espectres de fluorescència dels cucs envellits

Cucs (3–13 dies d'edat) es van recuperar d'un medi de creixement que contenia 2'-desoxi-5-fluorouridina (Indústria Química de Tòquio, Tòquio, Japó). AixòEl compost bloqueja el desenvolupament embrionari de la descendència, evitant així la contaminació per la descendència. Es van recollir cucs envellits individualstubs, rentatscincvegades, concentrat en 3 µL de tampó M9 i emmagatzemat congelat a–80 graus fins al seu ús. Abans de l'extracció, 100 µl de tampó de lisi(constituït per tampó Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, ditiotreitol 10 mM (DTT), PMSF 1 mM i còctel inhibidor de proteasa 1 µL (Sigma, St. Louis, MO, EUA)) es van afegir a cada tub. Aleshores, les mostres es van triturar amb una mini rectificadora sense fil (Funakoshi, Tòquio, Japó) per alliberar-les
proteïna. El contingut de proteïnes es va mesurar quantitativament mitjançant el Pierce™ Reactiu d'assaig de proteïnes de 660 nm (Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, EUA) i un instrument NanoDrop OneC (Thermo Fisher Scientific). Elfluorescènciaes va determinar l'espectre per a cada mostra de 30-µL (que conté 1,5μg de proteïna total) utilitzant una reixeta multimode

lector de microplaques model SH-9000Lab amb programari de tractament de dades SF6(Corona Electric, Ibaraki, Japó). Cada mesura es va realitzar tres vegades.


image

Mesura de l'autofluorescència de cucs vius individuals (mètode d'embolcall)

Els cucs seleccionats aleatòriament es van rentar amb tampó M9 i despréses van col·locar cucs individuals en 1.0 µL de tampó M9 a l'adherència Saran WrapFilm (Asahi Kasei, Tòquio, Japó) s'estenia sobre un 384-plat negre(STEM, Tòquio, Japó). Es van formar petits buits a cada pou amb areplicador (Watson, Kobe, Japó). Aquesta modificació consistia a recuperar els cucs amb seguretat després de la mesura, de manera que es pogués rastrejar el canvi d'autofluorescència de cada cuc depenent de l'edat. L'aferramentFiEs va triar lm perquè s'auto-fluoresceva menys que altres disponibles comercialmentFilms.

Tanmateix, les dades en blanc (només el buffer M9) es van comprovar tres vegadescada pou, tenint en compte elfluctuacióde pou a pou. Els límits mínims de detecció i els límits quantificables es van determinar a partir de les dades en blanc de cada dia segonsμ (mitjana del blanc)més3.29σ (desviació estàndard) iμmés√2 × 10σ, respectivament. L'autofluorescència al cos de cada cuc

es va capturar amb un lector de microplaques de reixeta multimode. Desprésmesura, cada cuc es va mantenir individualment en un 4,0-cmplaca de diàmetre coberta amb OP50 (2 mg/10μL M9 tampó) a 25 graus. CadascúL'assaig es va dur a terme en un mínim de 20 cucs i es va repetir dues vegades.


Mesura de l'esperança de vida

Els cucs es van mantenir en plaques mNGM cobertes amb OP50 a 25 graus fins als 13 dies. Després de l'avaluació per partfluorescènciaassaig, eren 30 cucs cadascunes va traslladar a noves plaques mNGM separades cobertes amb OP50. Les plaques es van incubar a 25 graus i es van anotar cucs vius i morts cada 24 h. Un cuc es considerava mort quan no responia a un toc suau amb un selector de cucs.

anti- senescence cistanche function


AGEs després de la glicació in vitro

L'extracció de proteïnes es va realitzar tal com es va descriure anteriorment. Es van utilitzar cucs de tres dies per a la glicació artificial. Les mostres de proteïnes (2 mg/ml)es van incubar amb 500 mM de glucosa, 100 mM de ribosa o 500 mM de fructosa(Ficoncentració final). Totes les mostres es van incubar a 37 graus durant 0–4 setmanes. Aliquotes (50μL) es van dispensar als pous d'una placa de poliestirè
(Baquelita Sumitomo, Tòquio, Japó) i incubat durant 2 h a 37 graus. Despréseliminació de la solució de mostra, la placa es va rentar amb PBS-T(solució salina tamponada amb fosfat (PBS), 0,05 per cent Tween 20); 250μL de llet desnatada al 3 per centes va afegir a cada pou i la placa es va incubar durant 2 h a 37 graus. Cadascúdesprés es va rentar amb PBS-T i 100μL d'un anti-AGE (anti-CML)
Anticòs monoclonal (clon núm. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japó; 75 ng/mL) es va dispensar a cada pou; la placa es va incubar a l'habitaciótemperatura durant 1 h. Després de rentar amb PBS-T, 100μL d'una peroxidasa conjugadaEs va dispensar anticòs IgG anti-ratolí de cabra (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, EUA; 1:150,000) a cada pou i
la placa es va incubar a temperatura ambient durant 1 h. Després de rentar amb PBS-T, 100μL d'una solució de treball (solució de tinció de tetrametilbenzidina (TMB): solució de peròxid).= 1:1; Kit TMB de substrat ELISA POD, popular,Nacalai Tesque, Kyoto, Japó) es va dispensar a cada pou, i la placa es va mantenir a temperatura ambient a la foscor fins que es va apagar per

suma de 100μL d'1 mol/L d'àcid sulfúric per pou. L'absorbància de cadascunbé a 450 nm (sub: 650 nm) després es va mesurar immediatament amb un lector de microplaques. ELISA es va realitzar tres vegades per a cadascuna de les condicions de prova.


Western blotting per a cucs envellits

Les mostres es van tractar amb 4 × Bolt™ LDS Mostra Tampó (Thermo Fisher ScientiFific) i 10× Bolt™ Agent reductor de mostra (Thermo Fisher ScientiFific), i cada mostra que conté 1,5μg de proteïna total es van executar en un Bolt™ 4–Gel Bis-Tris Plus al 12% (Thermo Fisher ScientiFific). A continuació, les proteïnes es van transferir del gel a un polivinilidèFlmembrana d'or (ATTO, Tòquio, Japó) i bloquejada amb un 5% de llet desnatada en PBS- 0,1% Tween 20 durant 1 h. La membrana es va incubar durant la nit a 4 graus amb un anticòs monoclonal anti-AGE (anti-CML) (clon núm. 6D12 a 1:1000), es va rentar amb PBS-T i després es va incubar a temperatura ambient durant 1 h amb un anticòs IgG anti-ratolí de cabra conjugat amb peroxidasa (1:25,000). Després de rentar-se amb PBS-T, la membrana es va incubar amb el reactiu de detecció de tacació occidental ECL prime (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Anglaterra) i es va escanejar amb un sistema d'imatge tàctil ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) o ImageQuant. LAS 500 (GE Healthcare UK). A continuació, es van rentar les membranes amb PBS-T, es van incubar amb Western BLoT Stripping Buffer (Takara, Shiga, Japó) durant 30 minuts a temperatura ambient i es van rentar de nou amb PBS-T. La membrana es va tornar a sondar mitjançant anticossos anti-vitellogenina YP115 i YP170 (cadascun 1:10.000) a 4 graus durant la nit42, rentat amb PBS-T i incubat amb anticòs IgG anti-rata de cabra conjugat amb peroxidasa (1:2000) (Proteintech, Rosemont, IL, EUA) a temperatura ambient durant 2 h. Per als controls de càrrega, les membranes es van tornar a sondar amb un anticòs anti-actina (Clon No. C4; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya) i un anticòs anti-ratolí conjugat amb peroxidasa (GE Healthcare UK). Les densitats de les bandes de vitelogenina (YP170 i YP115) i CML a cada carril es van normalitzar amb les de les bandes d'actina del carril respectiu. Les densitats de bandes es van analitzar mitjançant el programari ImageQuant TL (GE Healthcare). Cada assaig es va realitzar dues vegades.


Efectes de la ribosa i la rifampicina sobre els AGE in vivo

Es van cultivar cucs de tres dies en mNGM que contenia 400 mM de ribosao sorbitol 400 mM per igualar l'osmolaritat de la ribosa alta; El menjar de cuc es va proporcionar com a calor (100 graus, 10 min) matat amb OP50 per evitar que els bacteris fermentissin el sucre. Per evitar la contaminació per la descendència, els cucs es van transferir a plaques fresques diàriament durant 4 dies fins que s'havien completat.

acabatposta d'ous (als 7 dies). Per avaluar la influència de la ribosa, vam realitzar assajos de supervivència i vam mesurar l'autofluorescència. Un cuc eraconsiderat mort quan no va respondre a un toc suau amb un selector de cucs. Els cucs que morien com a conseqüència de l'adhesió a la paret de la placa no es van incloure en l'anàlisi i van ser censurats. En un experiment separat,MGM que conté 50 µM (finalconcentració) rifampicina (dissolta enDMSO) es va utilitzar. Cada assaig es va repetir dues vegades.


anti- senescence cistanche function

Fig. 6 Autofluorescència de vitel·logenina (Vit) i factor d'allargament (EF). aEspectrofotometria (ex 325/em 350–600) de vitelogenina ifactor d'allargament abans i després de la glicació in vitro per ribosa durant 14 dies: gly-Vit i gly-EF són vitelogenina glicada i elongació de glicatfactor, respectivament. RiboFLFLavin (Rib) es mostra com a representantLFLcompost uorescent. Es mostra un extracte de 17-cucs d'un dia (N2 de tipus salvatge) per a comparació (C. elegans). b La glicació in vitro de la vitelogenina i el factor d'allargament per ribosa van produir augments de l'autofluorescència
al llarg del temps.c Anàlisi de Western blotting d'AGE i vitelogenines en mostres extretes de poblacions de cucs (N2 de tipus salvatge) de diferents edats. Les taques es van derivar del mateix gel i es van processar amb cada anticòs en ordre.d Quantificacióde vitelogenines i AGEs occidentalsborrar mitjançant densitometria. Els experiments es van repetir dues vegades i es mostren les dades d'un experiment representatiu. Tant la línia com la línia de punts de color vermell mostren els canvis de plec de les AGE, mentre que les de color negre indiquen quantitats de vitelogenines. Els cercles tancats i les creus són per a les dades de les bandes que coincideixen amb YP170 i YP115, respectivament


Identificació de proteïnes antigues específiques de cuc

Anàlisi d'espectrometria de masses d'extractes de nematodes d'un dia 3- i 17-es va realitzar en un espectròmetre de masses AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF (Newark, NJ, EUA) amb Protein Pilot versió 4.0. Les dues matrius ho erendigerit per tripsina i barrejat amb una solució de matriu (7 mg/L de - Àcid ciano-4-hidroxicinàmic en 0,1 per cent (v/v) àcid trifluoroacètic (TFA), 70 per cent
(v/v) acetonitril (ACN)). Elcompanyla velocitat utilitzada per a la separació va ser de 300 ml/min,i la separació es va aconseguir mitjançant un gradient lineal de dues fases mòbils ({{0}}, 1 per cent (v/v) de TFA en 2 per cent d'ACN (solvent A) i 0, 1 per cent (v/v) de TFA en 80 per cent ACN(dissolvent B)) en les proporcions següents: A/B= 100/0–50/50 (60 min), A/B= 50/50–0/100 (20 min), A/B= 0/100 (10 min). Es va utilitzar un sistema de masses MALDI-TOF per obtenir una massa pèptidempremta digital. Coincidència de pèptids ies van realitzar cerques de proteïnes amb la base de dades Swiss-Prot versió 57.0.


Les proteïnes extretes es van dissoldre en bicarbonat d'amoni 50 mM(AmBic) per produir concentracions de proteïnes entre 0,1 i 1 µg/µL. Per tal de maximitzar la solubilitat de les proteïnes, un volum calculat d'AigüesEs va afegir Rapigest (Waters Corporation, Milford, MA, EUA) per al rendimentFiconcentracions nals de 0.1–0,2 per cent de Rapigest en mostres de pre-digestió. Les mostres
es van escalfar a 40 graus amb agitació durant 10 minuts; els continguts llavors erenes va centrifugar i el pellet resultant es va suspendre en AmBic que contenia 10 mM de DTT. Les mostres es van escalfar a 80 graus durant 15 min i es van sedimentar a temperatura ambient. Una alíquota de 200 mM de iodoacetamida (IAM) en 50 mMEs va afegir AmBic a cada mostra per produir afinalconcentració IAM de

20 mM (en presència d'un excés molar 2 × de DTT); la barreja llavors eraincubat a la foscor a temperatura ambient durant 30 minuts per permetre que la reacció d'alquilació continuï. Es va barrejar tripsina en AmBic 50 mM amb cada solució a 1:50 (tripsina: concentració de proteïnes). Les mostres es van digerir durant almenys 4 hores o durant la nit a 37 graus amb agitació. Seguintcentrifugació, TFA i ACN es van afegir per obtenir el rendimentfinalconcentracions de 0.5–1.0 per cent de TFA i 2 per cent d'ACN en volum. Les mostres es van agitar durant 2 h a 60 graus. Després de la centrifugació a 22.200 ×g durant 5 min, el sobrenedant va serpipetat en un vial de mostreig automàtic. Les proteïnes es van digerir prèviament amb tripsinaanàlisi per cromatografia líquida en fase inversa mitjançant un sistema Ultimate3000RSnanoLC (Thermo Fisher Scientific) acoblat a un sistema ESI-Q-TOF (Impact II Bruker Daltonics). L'alcohol deshidrogenasa del llevatLa proteïna (ADH1_LEVAT) es va augmentar a les mostres com a estàndard intern;es va realitzar un repunt per proporcionar una quantitat d'aproximadament 50 fmol deestàndard a la columna.


Autofluorescència després de la glicació in vitro

La vitellogenina en solució de PBS ({{0}},053 µM) es va comprar a Biosense Laboratories AS (Bergen, NORUEGA). La solució de factor d'allargament (1, 17 µM) es va comprar a Abnova Corporation (ciutat de Taipei, Taiwan). Aquestes solucions es van glicosar amb ribosa 0,1 mM durant 23 dies a 37 graus. RiboFLFLL'avin es va comprar a Sigma (Tòquio, Japó) i es va dissoldre en PBS a 0,1 mM. Cada solució es va mesurar per espectrofotometria de fluorescència en les mateixes condicions.

Immunofluorescènciaper cucs joves i vellsEl CB1003 alimentat amb OP50 sincronitzat amb l'edat es va incubar a 25 graus. Els adults de tres dies i 13-dia es van permeabilitzar amb Bouin'Protocol de fixació del tub43.


anti- senescence cistanche function

Fig. 7 Imatges de fluorescència de mutants de 3-dia i 13-dia d'antiguitat kynu-1. ACCucs de tres dies id–f 13-cucs d'un dia, amb imatges en brut a la columna 1. Per excloure els possibles efectes de la mortFluorescència que comença des de 2 dies abans dels cucs' la mort, el mutantkynu-1fou utilitzat. L'autofluorescència es veu a les imatges de les columnes 2 i 3. Les fotos de la columna 3 s'han ampliat des de les àrees indicades (per rectangles) de les imatges de la columna 2. Cucs vells (13-d'un dia) automàticfluorescentsigniFifimolt més alt que els cucs joves (3-d'un dia). Cada barra d'escala indica 50μm. g Quantificacióde blaufluorescènciautilitzant el programari ImageJ i ImageQuant TL. Cada barra representa els valors mitjans deFlintensitat de la uorescència per 1 mm2 de nou cucs. ** indica estadísticament un signeFifino hi ha diferència entre cucs de 3-dia i 13-dies a l'ap valor < 0,01. Les barres d'error representen el SE.

Les mostres erenfixata Bouin's fixadoramb metanol/ -mercaptoetanola temperatura ambient durant 30 min. Per trencar la cutícula, es van col·locar cucsisopropanol i emmagatzemat a–80 graus durant 10 minuts, després incubar a temperatura ambient durant 30 minuts més. Elfixadores va eliminar la solució isubstituït per solució de BTB (tampó de borat de 25 mM, 0,5 per cent de Triton X-100, 2 per cent
-mercaptoetanol) a temperatura ambient durant 1 h; la incubació en BTB va serrepetit un total de tres vegades. Aleshores, els cucs es van transferir de BTB a BT (tampó de borat de 25 mM, 0,5 per cent de Tritó X-100), incubat en solució tampó d'anticossos (1 × PBS, 0,5 per cent). Tritó X-100, 0,1 mM EDTA, {{10}},1 per cent d'albúmina sèrica bovina (BSA), 0,05 per cent d'azida de sodi, pH 7,2) a temperatura ambient durant

1 h, i bloquejat amb una solució tampó d'anticossos que conté un 10 per cent de sèrum de cabra(Cosmo Bio, Tòquio, Japó) a 4 graus durant la nit. Els anticossos primaris consistien en un anticòs monoclonal anti-AGE (anti-CML) de ratolí (clon núm. 6D12; 1:125) i un anticòs anti-pentosidina (clon núm. PEN-12, Trans Genic; 1:5). 0). L'anticòs secundari consistia en anticossos antiratolí de cabra conjugat Alexa Fluor 555- (Abcam, Cambridge, Anglaterra; 1:100). Totes les dilucions d'anticossos es van realitzar mitjançant un tampó d'anticossos que contenia un 0,5 per cent de BSA. Les mostres es van muntar sobre diapositives de vidre utilitzant el medi de muntatge antifade VECTASHIELD (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA).



Microscòpia de fluorescència

Les imatges de fluorescència de cucs adults de 3- o 13-un dia d'edat, muntades sobre portaobjectes de vidre com es descriu anteriorment, es van enregistrar mitjançant unFluorescènciamicroscopi (BZ-X700; Keyence) amb una lent objectiu 10× (CFI Plan Fluor DL10×/0,30). AutomàticFLFLuorescència de cucs un vermellfluorescènciad'AlexaFluor 555 es va veure amb BZ-X DAPI (longitud d'ona d'excitació (Ex), 360 ± 20 nm; longitud d'ona d'emissió (Em), 460 ± 25 nm) i TRITC (Ex, 545 ± 25 nm)12,5 nm; Em, 605 ± 35 nm)filtres, respectivament. Les imatges de la secció erencapturat pel mode de secció amb tipus d'escletxa unidimensional amb aamplada 32, i pas de la pila Z 0.7μm per a 40-μmostres de m de gruix. Per quantificar el blaufluorescència, elfluorescènciaintensitats mesurades per la imatge
El programari Quant TL (GE Healthcare) es va normalitzar als valors de densitat per 1 mm2 d'un cuc's zona de projecció. La mida corporal es va determinar amb Adobe Photoshop Elements i el programari ImageJ desenvolupat pels National Institutes of Health. En aquest sistema, l'àrea d'un cuc's projeccióes va estimar automàticament i es va utilitzar com a índex de la mida corporal.



Anàlisi estadística

La correlació de l'esperança de vida es va calcular mitjançant Spearman'coeficient de correlació de rang s. Els nivells d'autofluorescència després de la glicació in vitro es van comparar mitjançant ANOVA factorial de dos factors i Scheffe's F prova. ElEls valors d'ELISA després de la glicació in vitro es van comparar mitjançant ANOVA d'un sol factor i la prova de Dunnett per a comparacions múltiples. Supervivència dels nematodesva ser calculat pel Kaplan–Es va provar la importància del mètode Meier i de les diferències de supervivència mitjançant l'ús de la prova de rang de registre. Els valors d'autofluorescència després del tractament amb rifampicina i l'envelliment de ladaf-2ikynu-1es van comparar mutants per a cadascun utilitzant Student's t prova, ANOVA de dos factors de mesura repetida i Mann–WhitneyU prova. Els valors d'autofluorescència després dels tractaments amb ribosa per a N2 o elkynu-1Els mutants es van comparar mitjançant l'acer no paramètric–Mètode Dwass. Les densitats de la microscòpia d'autofluorescència es van comparar mitjançant Student's prova t. On s'observava importància, les dades eren classiFifieditat com a *p < 0.05 and **p < 0.01. All Les anàlisis estadístiques es van realitzar amb Microsoft Excel complementat ambel programari addicionalmésStatcel 3 (OMS, Tòquio, Japó) i JSTAT per a Windows(Nankodo, Tòquio, Japó).


Resum de l'informe

Hi ha més informació sobre el disseny de la investigació disponible a Nature ResearchResum d'informes enllaçat a aquest article.


DISPONIBILITAT DE DADES

Els conjunts de dades generats durant l'estudi actual estan disponibles al corresponentautor a petició raonable.



REFERÈNCIES

1. Brenner, S. La genètica deCaenorhabditis elegans. Genètica 77, 71–94 (1974).
2. Riddle, DL, Blumenthal, T., Meyer, BJ, Priess, JR (eds.).C. elegans II. (RefredatPrimavera Port Laboratori Premsa, Fred Primavera Port, 1997).
3. Herndon, LA et al. Els factors estocàstics i genètics influeixen en la disminució específica del teixit en l'envellimentC. elegans. Natura 419, 808–814 (2002).
4. Klass, MR Envelliment al nematodeCaenorhabditis elegans: principals factors biològics i ambientals que influeixen en la vida.Mech. Envelliment Dev. 6, 413–429 (1977).
5. Son, HG, Altintas, O., Kim, EJE, Kwon, S. i Lee, SV Canvis que depenen de l'edat i biomarcadors de l'envelliment enCaenorhabditis elegans. Envelliment de la cèl·lula 18, e12853 (2019).
6. Yoshino, J., Mills, KF, Yoon, MJ i Imai, S. Mononucleòtid de nicotinamida, un NAD clau (més) intermedi, tracta la fisiopatologia de la diabetis induïda per la dieta i l'edat en ratolins.Metab cel·lular. 14, 528–536 (2011).
7. Denzel, MS, Lapierre, LR & Mack, HID Temes emergents aC. elegansinvestigació de l'envelliment: regulació transcripcional, resposta a l'estrès i epigenètica.Mech. Envelliment Dev. 177, 4–21 (2019).
8. Ikeda, T., Yasui, C., Hoshino, K., Arikawa, K. i Nishikawa, Y. Inflflinfluència dels bacteris làctics en la longevitat deCaenorhabditis elegansi defensa de l'amfitrió contra la Salmonellaentericserovar Enteritidis.Appl. Entorn. Microbiol. 73, 6404–6409 (2007).
9. Komura, T., Ikeda, T., Yasui, C., Saeki, S. i Nishikawa, Y. Mecanisme subjacent a la prolongevitat induïda per bifidobacteris aCaenorhabditis elegans. Biogerontologia 14, 73–87 (2013).
10. Clark, LC i Hodgkin, J. Commensals, probiòtics i patògens en elCae Caenorhabditis elegansmodel.Microbiol cel·lular. 16, 27–38 (2013).
11. Cabreiro, F. i Gems, D. Els cucs també necessiten microbis: microbiota, salut i envelliment aCaenorhabditis elegans. EMBO Mol. Med. 5, 1300–1310 (2013).
12. Kim, Y. & Mylonakis, E.Caenorhabditis elegansCondicionament immunitari amb el bacteri probiòticLactobacillus acidophilusLa soca NCFM millora les respostes immunitàries Gram positives.Infectar. Immun. 80, 2500–2508 (2012).
13. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N. i Driscoll, M. Espectrofluorimetria in vivorevela biomarcadors endògens que informen sobre la salut i la restricció dietèticaCaenorhabditis elegans. Envelliment de la cèl·lula 4, 127–137 (2005).
14. Coburn, C. et al. Antranilatfluorescènciamarca una ona necròtica propagada pel calci que promou la mort de l'organismeC. elegans. PLoS Biol. 11, e1001613 (2013).
15. Pincus, Z., Mazer, TC & Slack, FJ AutoFLFLuorescència com a mesura de la senescència enC. elegans: mira al vermell, no al blau o al verd.Envelliment (Albany NY) 8, 889–898 (2016).
16. Sebekova, K. & Sebekova, KB Proteïnes glicats en nutrició: amic o enemic?Exp. Gerontol. 117, 76–90 (2019).
17. Giacco, F. & Brownlee, M. Estrès oxidatiu i complicacions de la diabetis.Circulació Res. 107, 1058–1070 (2010).
18. Srikanth, V. et al. Productes finals de glicació avançada i el seu receptor RAGE en Alzheimer'malaltia s.Neurobiol. Envelliment 32, 763–777 (2011).
19. Zhuo, Q., Yang, W., Chen, JY i Wang, Y. La síndrome metabòlica es troba amb la tritis osteoar.Nat. Rev. Reumatol. 8, 729–737 (2012).
20. Gkogkolou, P. i Bohm, M. Productes finals de glicació avançada: actors clau en l'envelliment de la pell?Dermatoendocrinol 4, 259–270 (2012).
21. Liu, J. et al. El receptor de productes finals de glicació avançada afavoreix el prematursenescència de cèl·lules epitelials tubulars proximals mitjançant l'activació de l'endoplasmasenyalització p21 depenent de l'estrès del reticle.Senyal cel·lular 26, 110–121 (2014).

22. Mendler, M., Schlotterer, A., Morcos, M. i Nawroth, PP Comprendre la polineuropatia diabètica i la longevitat: què podem aprendre del nematodeCae norhabditis elegans? Exp. Clin. Endocrinol. Diabetis 120, 182–183 (2012).


Demana més:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp més 86 15292862950


























Potser també t'agrada