Dihidroflavones benzilades i alcaloides derivats de la isoquinolina de l'escorça de Diclinanona Calycina (Annonaceae) i les seves citotoxicitats

Per a més informació, contacteutina.xiang@wecistanche.com

Resum: Diclinanona calycina RE Les patates fregides conegudes popularment com "enviro", és una espècie de la família de les Annonàcies endèmica del Brasil. En la nostra recerca contínua de compostos bioactius de les plantes d'Amazones Annonaceae, l'escorça de D.calycina es va investigar mitjançant tècniques de cromatografia clàssiques que van produir tretze compostos (alcaloides i flavonoides) descrits per primera vegada a D. calycina així com al gènere Diclinanona. L'estructura d'aquests compostos aïllats es va establir mitjançant una anàlisi extensa mitjançant espectroscòpia 1D/2D-RMN en combinació amb MS. Els alcaloides aïllats es van identificar com a pertanyents a les subclasses: isoquinolina simple, thali en línia (1); aporfina, anonaïna (2);oxoaporfina, liriodenina (3); benziltetrahidroisoquinolines, (S)-( més )-reticulina(4); dehidro-oxonorreticulina (3,4-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi{-1-isoquinolinil)({3-hidroxi{-4-metoxifenil)-metanona)(5 );( més )-1Ng-òxid de S,2R-reticulina (6); i ( més )-1S,2S-reticulina N -òxid (7);tetrahidroprotoberberina, coreximina (8); i pavine, bisnorargemonina (9). Mentre queflavonoidespertanyen als benzilatsdihidroflavones, isorhamnetina (10), dicamanetina (11) i una barreja d'uvarinol (12) i isouvarinol (13). El compost 5 es descriu per primera vegada a la literatura com un producte natural. Es va avaluar l'activitat citotòxica dels principals compostos aïllats contra el càncer i les línies cel·lulars no canceroses. Entre els compostos provats, els resultats més prometedors es van trobar per a les dihidroflavones benzilades dicamanetina (10) i la barreja d'uvarinol (12) i isouvarinol (13), que presentaven una activitat citotòxica moderada contra les proves.cèl·lula cancerosalínies (<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). La dicamanetina (11) va mostrar activitat citotòxica contra HL-60 i HCT116 amb valors d'IC50 de 15,78 ug·mL-I (33,70 umol·LI) i 18,99 ug∶mL-（40,56 umol. L-）, respectivament, mentre que la barreja d'uvarinol (12) i isouvarinol (13) va demostrar activitat citotòxica contra HL-60, amb un valor IC5 de 9,74 ugs.mL{-1, i HCT116, amb un IC50 valor de 17,31 ug. mL-I. Aquestes activitats citotòxiques es poden atribuir a la presència d'un o més grups hidroxibenzil presents en aquestes molècules, així com a la posició en què aquests grups estan units. Les activitats citotòxiques de la reticulina, l'anonaïna i la liriodenina s'han establert prèviament, sent la liriodenina el compost més potent.

Paraules clau: Diclinanona calycina; alcaloides i dihidroflavones benzilades; activitat citotòxica

Feu clic per obtenir més informació sobre els productes

1. Introducció

Les annonàcies són una gran família d'arbres i arbustos tropicals i subtropicals, que inclou uns 112 gèneres i 2440 espècies [1]. Diverses espècies són conegudes pels seus fruits comestibles i propietats medicinals ]2]. La investigació fitoquímica prèvia amb algunes espècies d'Annonàcies va conduir a l'aïllament i caracterització de diferents classes de metabòlits secundaris, com ara monoterpens, diterpens, triterpens, lignans,flavonoides, fenilpropanoides derivats de l'asarona, acetogenines i, principalment, alcaloides típics derivats de la isoquinolina [3-7]. Alguns d'aquests metabòlits secundaris aïllats d'espècies d'Annonàcies van mostrar activitats biològiques importants, com ara propietats antiinflamatòries i inhibidores de la ureasa [8,9], tripanocides [10,11], leishmanicida [11,12], antipalúdic [4,13] , accions antimicrobianes [4,14,15], antioxidants i antireumàtiques [9,15] i, particularment, activitat citotòxica contra diferents línies de cèl·lules tumorals humanes [4,6,11,16-21].

Tot i que la família Annonaceae es considera una família primitiva i ben estudiada, s'han fet pocs estudis fitoquímics i/o farmacològics amb la seva espècie[3]. Els estudis fitoquímics i/o farmacològics s'han centrat principalment en espècies dels gèneres Annona, Asimina i Cananga, per la seva gran importància econòmica, i en algunes espècies dels gèneres Duguetia, Guatteria i Xylopia[5]. Malgrat el gran creixement dels darrers 20 anys en relació als estudis fitoquímics i farmacològics, el nombre d'espècies investigades és encara molt reduït en relació a un gran nombre d'espècies reconegudes. Actualment, segons les bases de dades científiques Web of Science, Scopus i SciFinder, només al voltant del 15 per cent de les espècies d'Annonàcies descrites tenen algun estudi fitoquímic i/o farmacològic corresponent.

Entre les espècies poc estudiades hi ha les pertanyents al gènere Diclinanona Diels. Aquest gènere pertany a la tribu Annoneae, de la subfamília Annonoideae, i només es troba a l'Amèrica del Sud tropical (principalment a la regió amazònica). És un gènere format per només tres espècies, Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas i Diclinanona tessmannii Diels, que es troben com a arbres [22-24].D.calycina (sinonímia Xulopia calycina Diels) és un 8 a Arbre de 30 m d'alçada, conegut popularment com "envireira" i "enviro", distribuït per la conca amazònica al Brasil, Perú i Veneçuela [23]. D.calycina és superficialment semblant a Xylopia per les seves flors amb pètals allargats i estrets, però és diferent pels seus monocarps llenyosos, indehiscents, globosos i de parets gruixudes [23,24].

Estudis anteriors amb D. calycina només informen estudis farmacològics. El primer estudi descriu la investigació de l'activitat antimicrobiana d'extractes metanòlics, cloroforms i aquosos contra els microorganismes Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus i Candida albicans mitjançant el mètode gel-diffusion. La segona informa de la investigació de l'activitat antimicrobiana d'extractes orgànics (diclorometà: metanol 1:1) i aquosos contra el microorganisme Enterococcus faecalis mitjançant l'assaig de brou de microdilució (MDBA) i l'assaig de difusió en disc (DDA)[26]. Així, en la nostra contínua recerca de nous productes naturals bioactius d'Annonàcies de la selva amazònica, aquest estudi pretenia investigar les propietats fitoquímiques i farmacològiques de l'escorça de D.calycina. En aquest informe, tretze compostos (nou alcaloides i quatre benzilatsdihidroflavones) es van aïllar i identificar per primera vegada a D.calycina, així com al gènere Diclinanona. A més, es va investigar la citotoxicitat dels principals compostos contra B16-F10, HepG2, K562 i HL{{ 4}} línies de cèl·lules tumorals mitjançant l'assaig blau Alamar.

2. Resultats i discussió

2.1.Elucidació estructural dels compostos

Després d'haver descobert la presència de compostos que contenen nitrogen a l'extracte metanòlic mitjançant el reactiu de Dragendorff, es va sotmetre a un tractament àcid-base segons la metodologia de Costa et al. [12] donant lloc a fraccions alcaloïdals i neutres. Es va observar una alta concentració de compostos que contenen nitrogen a la fracció alcaloïdal que es va sotmetre a anàlisi cromatogràfica. Les successives separacions cromatogràfiques, tal com es descriuen a la secció Extracció i aïllament, van conduir a l'aïllament i la identificació de tretze constituents químics (1-13, figura 1), nou alcaloides derivats de la isoquinolina 1-9 i quatre dihidroflavones benzilades. 10-13. Les estructures d'aquests compostos aïllats (figura 1) es van establir mitjançant una anàlisi extensa mitjançant espectroscòpia RMN 1D i 2D en combinació amb MS (dades suplementàries), així com la comparació amb dades de la literatura.

El compost 5 es va obtenir com a pols amorf marró i va resultar positiu per al reactiu de Dragendorff. Va mostrar una molècula protonada a m/z328 [M més H]' en el LR-ESI( més )MS compatible amb la fórmula molecular C18H1NO5. Els espectres de RMN H i 13C de 5 (taula 1) eren coherents amb els de la reticulina (4) [27, excepte per l'absència del grup metil enllaçat per nitrogen (CH3-N) i el senyal de el grup metina a la posició 1, que va ser substituït per un senyal a δc 165,1 en l'espectre típic de 13C-RMN del grup imina conjugat a un grup carbonil a 192,8 aC. A l'"espectre de RMN-H, tres hidrògens de camp inferior a δH 6,88（1H,d, J=8,4 Hz, H{-5'）,5H7,57（1H,d, J{{33} }.0Hz, H{-2'）i δH 7,6{0（1H, dd, J=8,4 i 2,0 Hz, H{-6'） , va revelar la presència d'un sistema d'acoblament ABX. Dos senyals singlet a 6H 6,90(1H,s, H-8) i 6,71 (1H, s, H{-5) van indicar la presència d'anell de fenil 1,2,4,5-tetrasubstituït. A més, l'espectre de RMN H de 5 també va mostrar senyals per a dos grups metoxi que ressonaven a bH 3,93 (3H, s) i 6H 3,95 (3H,s) i senyals per a dos grups metilè que ressonaven a δμ 2,79 (2H,t), J=7,8 Hz） i 6H 3,89(2H,t,/=7,8 Hz), atribuïts a H{-4 i H{-3, respectivament (taula 1) . Aquestes dades van indicar que l'alcaloide 5 té un esquelet de benziltetrahidroisoquinolina [28-30].

Aquests grups es van establir a partir del mapa de correlació 'H-13C de dos i tres enllaços de l'experiment HMBC-RMN (figura 2 i taula 1). Aquesta anàlisi va revelar que l'hidrogen a δH 3,89 （H-3）va mostrar una correlació de tres bandes 'H-13C amb els carbonis a 6c130.1 (4a) i δc165.{ {42}}（C-1）i lH-13C de dos enllaços correlació amb el carboni atδc 25,4(C{-4), confirmant la presència del grup imina a la molècula. D'altra banda, els senyals a δH 7,57 （H-2'） i δH 7,60（H-6'） van mostrar una correlació de tres enllaços lH-13C amb els carbonis a δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C{-4'） i δc192,8（C-7）, i 5c116,0（C{-2'）,6c 151,4 (C-4') i c 192,8 (C{-7'), respectivament, establint el grup carbonil a la molècula (figura 2 i taula 1). Per tant, a partir d'aquestes dades de RMN, el compost 5

es va establir com l'alcaloide benziltetrahidroisoquinolina 34-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinil)({3-hidroxi{-4-metoxifenil)-metanona, que va ser anomenada dehidro-oxonorreticulina. Aquest alcaloide es descriu per primera vegada a la literatura com un producte natural. El seu primer i únic registre va ser descrit per Dörnyei et al. el 1982 【31】com a producte d'origen sintètic. Només es descriuen les dades de RMN-H amb algunes multiplicitats indeterminades. Així, les assignacions completes per a tots els desplaçaments químics de RMN 1H i 13C es van establir mitjançant experiments de correlació H-13C-RMN d'un enllaç (HSOC) i de dos i tres enllaços (HMBC) i es van descriure a Taula 1.

Els compostos 6 i 7 es van identificar com els alcaloides de benziltetrahidroisoquinolina (més) -1S,2R-reticulina-N-òxid i (més)-1S,2S-reticulina-N-òxid, respectivament. Les dades de RMN H d'aquests alcaloides es van comparar amb les dades descrites per Lee et al. [28] utilitzant el mateix dissolvent deuterat (CD3OD) i es van observar algunes inconsistències (taula 1), principalment en relació amb H-1, H-8 i H, C-NO. No hi ha dades de 13C-RMN descrites per a aquests alcaloides a la literatura. A partir de les dades limitades d'1H i 13C-RMN, així com de les ambigüitats observades per a aquestes molècules, es van realitzar experiments de RMN 1D i 2D H i 13C per determinar les seves assignacions i multiplicitats correctes.

La posició correcta de l'hidrogen H{{0}} i H{-1 dels dos isòmers 6 i 7 es va establir a partir del mapa de correlació de tres enllaços 'H{-13C de l'HMBC -Experiment de RMN （Figura 2）. Per a l'isòmer 6, l'anàlisi va revelar que l'hidrogen a δH 5,78（H-8）va mostrar una correlació de tres enllaços 'H-13C amb els carbonis a 6c 79,8（C-1), δc120 .6（4a） i δc 149,4 （C-6）, mentre que l'hidrogen a δH 4,13 （H-1）va mostrar una correlació de tres enllaços 'H-13C amb els carbonis a c 60,7（C-3）,6c 115,7 （C-8）,δc 120,6（C-4a） i 131,2 （C-1'）, establint així el posicions correctes dels hidrògens H-8 i H{-1 per a l'isòmer 6. Aquesta atribució es pot confirmar encara més mitjançant l'anàlisi de l'hidrogen a δH 6,76（H-5） que va mostrar tres enllaços Correlació H-13C amb els carbonis atδc 27,0（C{-4）, δc 127,1（C{-8a） i δc 145,7 （C{-7）（Figura 2）. Per a l'isòmer7, l'anàlisi va revelar que l'hidrogen a δH 6,30 （H-8) mostrava una correlació 'H{-13C de tres enllaços amb els carbonis a δc 79,4（C-1）,δc 122,8（ 4a） i δc 148,9 （C-6）, mentre que l'hidrogen a δH 4,46 （H-1）va mostrar correlacions de tres enllaços H-13C amb els carbonis a δc 62,9 （C{ {82}}）,5c 115,5（C{-8）, bc 122,8（C{-4a） i 131,4（C{-1'）, establint així les posicions correctes dels hidrògens H -8 i H{-1 per a l'isòmer 7. Aquesta atribució també es va confirmar per l'anàlisi de l'hidrogen a δH 6,71 （H-5）que mostrava tres enllaços lH-13C correlacions amb els carbonis a δc26,3（C{-4）, δc 126,9（C{-8a） i 6c 146,1（C{-7） (figura 2). L'experiment NOESY també es va dur a terme per establir l'estereoquímica correcta dels isòmers6 i 7. En aquest experiment, la forta correlació NOE de H-1(δH 4,13) i H, CN({5 3.15) va indicar el -orientació de l'oxigen a l'isòmer 6. D'altra banda, no es va poder trobar cap correlació NOE evident entre H-1(6H 4,46) i HAC-N(5H 3,20) a l'experiment 2D-NOESY per a 7, indicant l'orientació de l'oxigen a l'isòmer 7 (Figura 2). Aquestes petites diferències en els desplaçaments químics d'aquests isòmers s'observen clarament a causa de l'estereoquímica del nitrogen afectat per les posicions i de l'oxigen. Les comparacions de les dades de RMN H i 13C obtingudes per als compostos 6 i 7 amb dades de molècules amb estructures properes com l'hexapetalina A i l'hexapetalina B [30] donen suport a les dades descrites a la taula 1 sense ambigüitat.

Els compostos 1-4 i 8-13 es van identificar com a talifolina (1) [32], anonaïna (2) [33]liriodenina (3)[10,34], (S)-( més )-reticulina ( 4)[27], coreximina (8) [34,35], bisnorargemonina (9)[36], isocamanetina (10) [37], dicamanetina (11) [37] i una barreja d'uvarinol (12) i isouvarinol (13) [37] basant-se en els seus perfils espectroscòpics i comparació amb valors de la literatura. Els espectres lH i 13C 1D i 2D-RMN, així com els espectres de masses de tots els compostos aïllats, estan disponibles com a materials suplementaris.

Des del punt de vista de la quimiofenètica (un nou terme per a la quimiosistemàtica de les plantes/quimiotaxonomia de les plantes), és important assenyalar que la presència de flavanones C-benzilades i dihidrochalcones C-benzilades són un tipus especial de flavonoides derivats de la coneguda flavanona pinocembrina. i s'han descrit particularment en espècies del gènere Uoaria pertanyents a la família Annonaceae [3,38-42]. La presència d'aquests compostos a D. calycina suggereix estretes relacions quimiofenètiques amb Uoaria. D'altra banda, s'haurien de fer més investigacions amb altres parts de la planta, així com amb altres espècies de Diclinanona per confirmar aquesta relació quimiofenètica. Les flavanones i les chalcones estan molt esteses a les plantes superiors, però l'addició de grups benzil és força rara i sembla limitada a les Annonaceae al gènere Uoaria [3,39-42]i ara al gènere Diclinanona. Presumiblement, els grups bencil sorgeixen d'una ruta C6-C1, però la funcionalitat o-hidroxi és inusual. L'absència de substituents a l'anell B en tots aquests flavonoides d'Uoaria i Diclinanona es pot relacionar amb l'observació anterior sobre els flavonoides de Popowia cauliflora [38].

Els alcaloides derivats de la isoquinolina aïllats i descrits en aquest treball ja s'han registrat en diverses espècies d'Annonàcies de diferents gèneres. Alguns d'aquests, com la liriodenina i l'anonaïna, es consideren marcadors quimiofenètics, i la presència d'aquests alcaloides a D.calycina reforça encara més la relació d'aquests marcadors quimiofenètics a la família Annonaceae [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Val la pena esmentar que, segons Zidorn [44], els estudis quimiofenètics es defineixen com els estudis dirigits a descriure el conjunt de metabòlits secundaris especialitzats en un tàxon determinat, tal com ja s'ha observat en diversos treballs publicats [5-7,15,20. ,27,33-35,43-46]. Així, els estudis quimiofenètics contribueixen a la descripció fenètica dels tàxons, de manera similar als enfocaments anatòmics, morfològics i cariològics, que ja s'han reconegut com de gran importància per a l'establiment de sistemes "naturals", i que continuen sent d'extrema importància per a la descripció d'organismes classificats amb l'ajuda de mètodes moleculars moderns [44].

2.2. Assaig citotòxic

L'activitat citotòxica in vitro dels compostos aïllats (taula 2), excepte els compostos 2, 3,5 i 8 (a causa del seu baix rendiment), es va avaluar contracèl·lula cancerosalínies HL-60 (leucèmia promielocítica humana), MCF-7 (adenocarcinoma de mama humà), HepG2 (carcinoma hepatocel·lular humà), HCT116 (carcinoma de còlon humà) i línia cel·lular no cancerosa MRC{{5} } (fibroblast de pulmó humà) mitjançant l'assaig blau Alamar després de 72 h d'incubació.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). La dicamanetina (11) va mostrar activitat citotòxica contra HL-60 i HCT116 amb valors IC50 de 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L{-1) i 18,99 ug·mL-1（40,56 umol.L{-1）, respectivament. La barreja d'uvarinol (12) i isouvarinol (13) va demostrar activitat citotòxica contra HL-60, amb un valor ICs0 de 9,74ug∶mL{-1, i HCT116, amb un valor ICs0 de 17,31 ug∶mL{{ {30}}. Entre les dihidroflavones benzilades, només l'isorhamnetina (10) va mostrar activitat citotòxica contra HepG2 amb un valor IC50 de 19,79 ugs:mL-1(54,65 umol.L-1). Segons la literatura, les dihidroflavones benzilades es descriuen amb propietats citotòxiques [39-42]. Entre els descrits en aquest treball, l'isorhamnetina (10), la dicamanetina (11) i l'uvarinol (12) es descriuen dins de propietats citotòxiques in vitro contra línies de cèl·lules tumorals humanes de carcinoma de la nasofaringe (KB) i leucèmia limfocítica P-388. (PS) amb valors IC50 de 5,3 i 4,1, 4,8 i 1,8, i 5,9 i 9,7, ug.mL-1, respectivament [39,40]. Aquestes diferents activitats es poden atribuir a la presència d'un o més grups hidroxibenzil presents a les molècules, així com a la posició en què aquests grups estan units. Tanmateix, cal investigar més per confirmar aquesta observació.

L'activitat citotòxica in vitro dels alcaloides derivats de la isoquinolina anonaïna (2), liri-adenina (3) i (S)-( més )-reticulina (4) ha estat descrita recentment per Menezes et al.[2{{16]. }}], Souza et al. [6] i Costa et al. [43] amb èmfasi en la liriodenina, que va demostrar una potent activitat citotòxica contra les línies cel·lulars cancerígenes B{{10}}F10(melanoma de ratolí), HepG2 (carcinoma hepatocel·lular humà), HL{{13 }} (leucèmia promielocítica humana) i K562 (leucèmia mielocítica crònica humana) amb valors d'IC5s0 inferiors a 10,0 μmol.L-1【43】. L'anonaïna va mostrar una activitat moderada contra B16-F10, HepG2, HL60 , i K562 amb valors d'IC50 inferiors a 19,0 umol.L-1[20]. (S)-( més )-reticulina va mostrar una activitat moderada només contra HepG2 amb valors d'IC50 de 15,35 μmol L-1【 6,20】.

3. Materials i Mètodes

3.1. Procediments Experimentals Generals

Les rotacions òptiques en metanol (MeOH) es van registrar amb un polarímetre P{{0}} (Jasco, Tòquio, Japó) a 589 nm. Els experiments de RMN 1D i 2D es van adquirir en CDCl. (cloroform-d) o CDCl més gota de CD, OD (metanol-du i CD, COCD3 (acetona-d6) a 298 K en un espectròmetre AVANCE I HD RMN (Bruker, Billerica, MA, EUA) que funciona a 11,75 T (Mà 13C a 500 i 125 MHz, respectivament) i en un espectròmetre RMN Bruker AVANCE I 6{00 que funciona a 14,1 T('H i 13Cat 60{ {63}} i 150 MHz respectivament). Tots els desplaçaments químics de lH- i 13C-RMN （δ） es presenten en ppm en relació amb el senyal de tetrametilsilà a 0.00 ppm com a referència interna, i les constants d'acoblament (D) es donen en Hz. L'espectròmetre de RMN estava equipat amb una sonda de detecció inversa multinuclear de 5-mm (experiments de RMN 1D i 2D) amb un gradient z. Un enllaç (HSQC) i dos i Els experiments de correlació de tres enllaços (HMBC) 1H-13C-RMN es van optimitzar per a la constant d'acoblament mitjana' JcH i LRJ (cH de 140 i 8 Hz, respectivament. Per a l'anàlisi d'espectrometria de masses de baixa resolució (LC-MS), el les mostres dels compostos aïllats es van tornar a suspendre en metanol (grau HPLC), creant l'estoc k solucions (1 mg·mL-1). Les alíquotes (5 uL) de les solucions d'estoc es van diluir encara més a 5 ug·mL i es van analitzar mitjançant infusió directa en un espectròmetre de masses triple quadrupol, model TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, CA, EUA), equipat amb ionització per electrospray. (ESI) o fonts d'ionització química a pressió atmosfèrica (APCI). Condicions ESI-MS: tensió de polvorització, 5kV; gas de la funda, 10 unitats arbitràries (arb); gas auxiliar, 5arb; gas d'escombrat, 0arb; temperatura capil·lar, 250 graus; tensió capil·lar, 40 V; lent del tub, 70 V; rang de massa, m/z 100 a 1000. Condicions APCI-MS: corrent de descàrrega, 5 μA; temperatura del vaporitzador, 350 graus; pressió de gas de la funda, 25 unitats arbitràries (arb); pressió de gas d'escombrat d'ions, 0,0 arb; pressió de gas auxiliar, 10 arb; temperatura capil·lar, 250 graus C; desplaçament de la lent del tub, 70 V; skimmer offset, 0 V; rang de masses, m/z 100 a 1000. L'argó es va utilitzar com a gas de col·lisió i els espectres MS/MS es van obtenir utilitzant energies de col·lisió que oscil·laven entre 25 i 30 eV. Es va utilitzar gel de sílice 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, EUA, malla 70-230) per a la cromatografia en columna (CC), mentre que gel de sílice 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Alemanya, 0,25 mm, alumini) es va utilitzar per a l'anàlisi i la preparació amb cromatografia de lava fina (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, vidre). Els compostos es van visualitzar mitjançant l'exposició a llum UV254/365, ruixant amb reactiu p-anisaldehid seguit d'escalfament en una placa calenta i polvoritzant el reactiu de Dragendorff.

3.2.Material Vegetal

En la present investigació, el material botànic (escorça) de D.calycina es va recollir el 27 de maig de 2017 a la Reserva Adolpho Ducke (coordenades geogràfiques: 02 graus 53'36.1S i 59 graus 58'28.9"W), Manaus, Estat d'Amazones , Brasil, i identificat pel Prof. Dr. Antonio Carlos Webber, taxònom vegetal del Departament de Biologia de la Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM) Un exemplar de val número 10.810 es va dipositar a l'Herbari de DB/UFAM. l'accés (exemplar) es va registrar al Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) amb el registre A70EDCD.

3.3. Extracció i aïllament

L'escorça de D.calycina es va assecar inicialment a temperatura ambient durant 24 h i després es va assecar en un forn de circulació d'aire durant 48 h a una temperatura de 40 graus, i posteriorment es va polveritzar en un molí de quatre ganivets (Marconi, Piracicaba, SP). , Brasil) per obtenir el material en pols (1340 g). A continuació, es va realitzar una maceració exhaustiva amb hexà (8×4 L) seguida de MeOH (8×4 L). Les solucions extractives obtingudes es van concentrar en un evaporador rotatiu a pressió reduïda (40-50 graus) per donar els extractes d'hexà (24,85 g) i MeOH (199,43 g), respectivament.

L'anàlisi TLC revelada amb el reactiu de Dragendorff va indicar una gran presència d'alca-loides a l'extracte MeOH. Per tant, una alíquota d'extracte de MeOH (188,30 g) es va sotmetre inicialment a una extracció àcid-base per donar fraccions alcaloïdals (5,46 g) i neutres (4,47 g). Posteriorment, part de la fracció alcaloïdal (5,0g) es va sotmetre a una columna cromatogràfica de gel de sílice (CC) tractada prèviament amb una solució de NaHCO3 al 10 per cent [12], eluïda amb hexà (100 per cent), hexà-CHCl, (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 i 10:90,v/o), CH2Cl2 (100 per cent), CH2Cl 2-EtOAc (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 i 10:90,0/u), EtOAc (100 per cent), EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80, i 10:90, v/o), i finalment MeOH donant 250 fraccions (30 ml cadascuna). Després de l'avaluació TLC utilitzant una barreja de CH2Cl2-MeOH en les proporcions de 95:05, 90:10, 85:15 i 80:20 com a sistema eluent (v/o), les mostres similars es van agrupar per donar 16 fraccions (F1 a F16).

La fracció F5 (181,2 mg) del CC inicial eluït amb hexà-CH, Cl2 (50:50 a 10:90, v/o) es va sotmetre a un nou gel de sílice CCUsant la mateixa metodologia anterior eluïda amb hexà (100 per cent), hexà -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 i 10:90,v/o), CH,Cl ,(100 per cent), CHCl2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 i 10:90 ,o/), EtOAc (100 per cent), EtOAc-MeOH (85:15,70:30,50:50, 30:70 i 15:85, /o) i MeOH (100 per cent) que ofereixen 118 fraccions ( 15 ml cadascun) que es van agrupar en 12 subfraccions (F5.1 a F5.12), segons l'avaluació de l'anàlisi TLC utilitzant una barreja de CH2Cl2-MeOH en les proporcions de 95:05 i 90:10. Subfracció F5 .1 (28,9 mg) eluït amb hexà (100 per cent) es va sotmetre a un TLCeluted preparatiu amb CH, Cl-MeOH (95:05, v/v, dues elucions) donant 2 (1,4 mg) i 3 (1,7 mg), respectivament. Subfraccions F5.4 (21,5 mg) eluït amb hexà-CH,C (80:20,vo), F5.5 (16,7 mg) eluït amb hexà-CH,Cl (80:20,70:30,60;40 i 50:50) ,v/) i F5.6 (15,4 mg) eluïts amb hexà-CHCl2 (50:50,40:60 i 30:70, v/o) es van agrupar (53,6 mg) i també es van sotmetre a una TLC preparativa eluïda amb CH,Cl-MeOH (95:05, v/u, dues elucions) donant 3 (8,9 mg).

Fracció F6(2099,1 mg) del CC inicial eluït amb hexà-CHCl(10:9{0,v/)), CH2Cl, (100 per cent) i CH,Cl2-EtOAc (90:10 a 10:90, o/o) es va sotmetre a un nou gel de sílice CC utilitzant la mateixa metodologia anterior eluït amb els mateixos sistemes de dissolvents que proporcionaven 140 fraccions (30 ml cadascun). Després de l'avaluació TLC utilitzant una barreja de CH2Cl2-MeOH en les proporcions de 95:05, 90:10 i 85:15 com a sistema eluent (o/o), les mostres similars es van agrupar per donar 13 subfraccions (F6). .1 a F6.13). La subfracció F6.6 (1541,3 mg) es va sotmetre a un nou CC de gel de sílice utilitzant la mateixa metodologia anterior eluïda amb els mateixos sistemes de dissolvents proporcionant 120 fraccions (30 ml cadascuna) que es van analitzar per TLC (utilitzant la mateixa metodologia anterior) proporcionant 12 noves fraccions. subfraccions (F6.6.1 a F6.6.12). La subfracció F6.6.2 (17,0 mg) eluïda amb hexà-CH, Cl, (60:40 i 50:50, v/v) es va sotmetre a una TLC preparativa diluida amb CH2Cl2-MeOH (90:10, v/o, una elució) resultant en 3 (1,4 mg). Subfracció F6.6.3 (643,3 mg) eluït amb hexà-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 i 10:90, o/v), CH2Cl2 (100 per cent) i CH2Cl2-EtOAc (90:10 i 80:20, o/o) es van sotmetre a una TLCelució preparativa amb CH2Cl{2-MeOH (90 :10, vfo, una elució) donant una nova subfracció F6.6.3.1 (161,8 mg) que es va sotmetre a una nova TLC preparativa eluïda amb EtOAc-MeOH (90:10, v/o, una elució) donant 4 (148,2). mg). La subfracció F6.6.4 (90,2 mg) eluïda amb CH2Cl2-EtOAc (70:30 i 60:40, o/o) es va sotmetre a un TLCelució preparativa amb CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, una elució) donant 1 (1,4 mg) i 4 (50,1 mg), respectivament. La subfracció F6.6.5 (83,4 mg) eluïda amb CH,Cl-EtOAc (60:40 i 50:50, o/o) també es va sotmetre a un TLCelució preparativa amb CH,Cl2-MeOH (90:10, ovni, una elució) que ofereix de nou 1 (1,5 mg) i 4 (45,5 mg), respectivament. La subfracció F6.6.6 (101,4 mg) eluïda amb CH,Cl2-EtOAc (50:50 i 40:60, v/)) es va sotmetre a una TLC preparativa eluïda amb CH,Cl-MeOH (90: 10, vfo, una elució) donant 8 (3,4 mg) i una altra subfracció F6.6.6.1 (48,8 mg). Aquesta subfracció (F6.6.6.1) es va sotmetre a una TLC preparativa eluïda inicialment amb EtOAc-MeOH (85 : 15, vo, una elució) i posteriorment CHCl-MeOH (90:10, v/v, una elució) resultant de nou en 4 (37,4 mg). Per a aquest procediment, la placa cromatogràfica es va eluir inicialment amb la fase mòbil EtOAc-MeOH (85:15, v/o, una elució). Després d'aquesta elució, la placa cromatogràfica es va assecar per retirar el dissolvent i es va sotmetre posteriorment a una nova elució amb la fase mòbil CH,Cl,-MeOH (90:10,vf,una elució) donant 4.Subfracció F6.6.7 ( 109,0 mg) eluït amb CH,Cl2-EtOAc (40:60,30:70,20:80 i 10:90,vfo) es van sotmetre a una TLC preparativa eluïda amb CH,Cl2-MeOH (90:10,vo, una elució) donant una altra subfracció F6.6.7.1 (24,8 mg) que es va sotmetre a un nou TLC preparatiu eluït inicialment amb EtOAc-MeOH (85:15, v/o, una elució) i posteriorment CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, una elució) resultant en 9 (11,1 mg). El procediment d'aïllament utilitzat per a 9 va ser el mateix que s'ha descrit anteriorment per a 4. La subfracció F6.6.10 (92,0 mg) eluïda amb EtOAc-MeOH (60:40 i 50:50, v/o) es va sotmetre a una TLCelució preparativa amb CH, Cl,-MeOH (90:10, v/o, una elució) donant 5 (1,7 mg) i 6 (7,8 mg), respectivament. La subfracció F6.6.11 (326,0 mg) eluïda amb EtOAc-MeOH (50:50,40:60,30:70,20:80 i 10:90,v/o) es va sotmetre a una TLC preparativa diluida amb CHCl- MeOH (90:10, v/o, una elució) amb 1 (2,4 mg) i 7 (12,5 mg), respectivament.

La fracció F7 (692,4 mg) de la CCelució inicial amb EtOAc (100 per cent) i CHCl2-EtOAc (95:05,90:10,85:15 i 75:25,ofo) es va sotmetre a un nou gel de sílice CCUsant la mateixa metodologia que es descriu per a CC inicial amb els mateixos sistemes de dissolvents que proporcionen 110 fraccions (30 ml cadascuna). Després de l'avaluació TLC utilitzant una barreja de CH2Cl2-MeOH en les proporcions de 95:05, 90:10 i 85 :15 com a sistema eluent (o/o), les mostres similars es van agrupar per donar 12 subfraccions (F7.1 a F7.12). F7.8 (147,4 mg) eluït amb CH,Cl2- EtOAc (50:50, 40:60 i 30:70, v/o per cent) es va sotmetre a una TLC preparativa eluïda amb CHCl-MeOH (95:05, vfo, una elució) donant 10 (5,4 mg) i 11 ( 120,6 mg), respectivament. F7.9 (144,2 mg) eluït amb CHCl2-EtOAc (30:70, 20:80 i 10:90, v/o per cent) també es va sotmetre a una TLCelució preparativa amb CH,Cl,-MeOH( 95:05,vo, una elució) que ofereix 11 (91,2 mg) i una barreja de 12 i 13 (39,4 mg), respectivament.

Thalifoline (1): pols amorf marró;' H-NMR i 13C-NMR d'acord amb la literatura [32]; LR-ESI( més )-MS [M més H]* més m/z 208.

Anonaïna (2): pols amorf marró; 1H-NMR i 13C-NMR d'acord amb la literatura [33]; LR-ESI( més )-MS [M més H] més m/z 266.

Liriodenina (3): cristalls grocs (CH, Cl-MeOH 3:1); 1H-NMR i 13C-NMR d'acord amb la literatura [10,34]; LR-ESI( més )-MS [M més H] més m/z 276.

(S)-( més )-Reticulina(4): pols amorf marró; [ ]p25 més 71,60(c 0,05 g/100 ml, MeOH); 1H-NMR i 13C-NMR d'acord amb la literatura [27;LR-ESI( més )-MS [M més H] més m/z 30.

3,4-Dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinil)({3-hidroxi{-4-metoxifenil)-metanona (Dehidro-oxonorreticulina)(5 ): pols amorf marró; Dades H i 13C-RMN, vegeu la taula 1; LR-ESI( més )-MS [M més H] més m/z 328.

( més ){{0}}N -òxid de S,2R-reticulina(6): pols amorf marró; [ lp25 més 136,4 (c0,146 g/100 ml, MeOH); 1 Dades de RMN 13C a mà, vegeu la taula 1; LR-APCI( més )-MS [M més H] més m/2346

( més ){{0}}S,2S-Reticulina N.-òxid (7): pols amorf marró; [ ]p25 més 394,5 (c 0,03 g/100 ml, MeOH); dades de 'H i 13C-RMN, vegeu la taula 1; LR-APCI( més )-MS [M més H] més m/z346.

Coreximina (8): pols amorf groc clar;[ ]p25 més 201,1(c 0,08g/100mL, MeOH)'H-NMR i 13C-NMR d'acord amb la literatura[34,35];LR- ESI( més )-MS [M més H] més m/z 328.

Bisnorargemonina (9): pols amorf marró; 1H-NMR i 13C-NMR d'acord amb la literatura [36]; LR-APCI( més )-MS [M més H] més m/z 328.

Isocamanetina (10): pols amorf groc clar; [p25-12.4(c 0,5 g/100 ml, MeOH)'H-RMN i 13C-RMN d'acord amb la literatura[37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dicamanetina (11): pols amorf groc;[ ]D25-10.7(c 0.5g/100 mL, MeOH);1H-NMR i 13C-NMR d'acord amb la literatura [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Una barreja d'uvarinol(12)i isouvarinol(13): pols amorf groc; H-NMR i 13C-NMR d'acord amb la literatura [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z 573.

3.4.Assaig citotòxic in vitro

3.4.1.Cèl·lules

HL-60 (leucèmia promielocítica humana), MCF-7 (adenocarcinoma de mama humà), HepG2 (carcinoma hepatocel·lular humà), HCT116 (carcinoma de còlon humà) i MRC-5 (fibroblast de pulmó humà) Les línies cel·lulars es van obtenir de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) i es van cultivar tal com recomana la guia de cultiu de cèl·lules animals ATCC. Totes les línies cel·lulars es van provar per micoplasma mitjançant un kit de tinció de micoplasma (Sigma-Aldrich) per validar l'ús de cèl·lules lliures de contaminació.

3.4.2. Assaig de citotoxicitat

Per a l'assaig de citotoxicitat, la viabilitat cel·lular es va quantificar mitjançant el mètode blau Alamar, tal com es va descriure anteriorment [{{0}}]. Per a tots els experiments, les cèl·lules es van sembrar en plaques de 96-pous. Els components químics es van dissoldre en sulfòxid de dimetil (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brasil) i es van afegir a cada pou i es van incubar durant 72 h. La doxorubicina (clorhidrat de doxorubicina, puresa superior o igual al 95 per cent, Laboratori IMA SAIC, Buenos Aires, Argentina) es va utilitzar com a control positiu. Al final del tractament, 20 μL d'una solució madre (0,312 mg/mL) de resazurina Es va afegir (Sigma-Aldrich Co.) a cada pou. Les absorbances a 570 nm i 600 nm es van mesurar mitjançant un lector de microplaques SpectraMax190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) La concentració mitja inhibidora (IC50) es va obtenir per regressió no lineal amb intervals de confiança del 95 per cent (CI95 per cent) utilitzant el programari GraphPad Prism (Intuitive Software for Science; San Diego, CA, EUA).

4. Conclusions

La investigació fitoquímica de l'escorça de D.calycina va conduir a l'aïllament i la identificació de tretze compostos (1-13); nou alcaloides derivats de la isoquinolina (1-9) i quatreflavonoides(10-13). Els alcaloides pertanyen a les subclasses següents: isoquinolina simple, thali online(1);aporfina, anonaïna (2); oxoaporfina, liriodenina (3); benzil-tetrahidroisoquinolines, ( més )-reticulina (4), de hidro-oxonorreticulina (3,4-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-isoquinolinil)({{13} }hidroxi-4-metoxifenil)-metanona)(5), 1S,2R-reticulina Ng-òxid (6) i 1S,2S-reticulina N.-òxid (7); tetrahidroprotoberberina, coreximina (8); i pavine, bisnorargemonina(9). Mentre que els flavonoides pertanyen a les dihidroflavones benzilades, l'isorhamnetina (10), la dicamanetina (11) i una barreja d'uvarinol (12) i isouvarinol (13). Els compostos aïllats es descriuen per primera vegada a D.calycina així com al gènere Diclinanona.

L'activitat citotòxica dels compostos aïllats (excepte l'anonaïna, la liriodenina, la 1,2-dihidro-oxonorreticulina i la coreximina) es va avaluar contra el càncer (HL-60, MCF{-7, HepG2 i HCT116) i línies cel·lulars no canceroses (MRC-5). Entre ells, es van observar els resultats més prometedors per a les dihidroflavones benzilades dicamanetina (10) i

la barreja d'uvarinol (12) i isouvarinol (13) que va mostrar una activitat citotòxica moderada contra les línies cel·lulars cancerígenes provades （<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). La dicamanetina (11) va mostrar activitat citotòxica contra HL-60 i HCT116 amb valors d'IC50 de 15,78 ug·mL-1 （33,70 μmol-L{-1) i 18,99 ug·mL-I（40,56 μmol. .L-1), respectivament, mentre que la barreja d'uvarinol （12） i isouvarinol (13) va demostrar activitat citotòxica contra HL-60, amb un valor IC50 de 9,74 ug∶mL-I, i HCT116, amb IC50 valor de 17,31 ug·mL-1. Aquests resultats sobre les línies de cèl·lules tumorals també es descriuen per primera vegada per a les dihidroflavones bencilades. Les activitats citotòxiques de la reticulina, l'anonaïna i la liriodenina es van establir prèviament, en les quals la liriodenina és el compost més potent.

Els resultats obtinguts en aquest treball indiquen que les espècies de la família Annonaceae són una font prometedora de compostos biològicament actius amb propietats citotòxiques, i suggereixen la continuació de la seva investigació en altres models d'assaigs biològics.

Referències

1. Couvreur, TLP; Pirie, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Història evolutiva primerenca de la família de plantes amb flors Annonaceae: diversificació constant i geodispersió boreotropical. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [Ref creuat]

2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Rio de Janeiro, Brasil, 1984.

3. Leboeuf, M.; Cova, A.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. The phytochemistry of the Annonaceae. Fitoquímica 1982, 21, 2783–2813. [Ref creuat]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Acetogenines annonàcies: una revisió. J. Nat. Prod. 1990, 53, 237–278. [Ref creuat]

5. Lúcio, ASSC; Almeida, JRGDS; Da-Cunha, EVL; Tavares, JF; Filho, JMB Alcaloids of the Annonaceae: Ocurrència i una recopilació de les seves activitats biològiques. A Els alcaloides; Knolker, H.-J., Ed.; Elsevier: Amsterdam, Països Baixos, 2015; Capítol 5; Volum 74, pàgs. 233–409. [Ref creuat]

6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Paz, WHP; Pinheiro, MLB; Rodrigues, ACBC; Bomfifim, LM; Soares, MBP; Bezerra, DP; Chaar, JS; Koolen, HHF; et al. Fenilpropanoides derivats de l'asarona i alcaloides derivats de la isoquinolina de l'escorça de Duguetia pycnastera (Annonaceae) i les seves citotoxicitats. Quim. Nova 2020, 43, 1397–1403. [Ref creuat]

7. Araújo, MS; Silva, FMA; Koolen, HHF; Costa, EV Alcaloides derivats de la isoquinolina de l'escorça de Guatteria olivacea (Annonaceae). Bioquímica. Syst. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Happi, GM; Mbiantcha, M.; Tatuedom, d'acord; Ali, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Productes naturals de la planta medicinal Duguetia staudtii (Annonaceae). Bioquímica. Syst. Ecol. 2019, 83, 22–25. [Ref creuat]

9. Santos, RC; Souza, AV; Andrade-Silva, M.; Cruz, KCV; Kassuya, CAL; Cardoso, CAL; Vieira, MC; Formaggio, ASN Investigació antioxidant, antireumàtica i antiinflamatòria d'extracte i dicentrinona de Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Ganxo. f. J. Etnofarmacol. 2018, 211, 9–16. [Ref creuat]

10. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Valdez, RH; Ueda-Nakamura, T.; Dias Filho, BP; Nakamura, CV Activitat tripanocida d'alcaloides d'oxoaporfina i pirimidina- -carbolina de les branques d'Annona foetida Mart. (Annonaceae). Molècules 2011, 16, 9714–9720. [Ref creuat]

11. Silva, DB; Tulli, ECO; Milita, GCG; Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; Moraes, MO; Albuquerque, S.; Siqueira, JM Les activitats antitumorals, tripanocides i antileishmanials de l'extracte i alcaloides aïllats de Duguetia furacea. Phytomedicine 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Xavier, CM; Silva, JRA; Amaral, ACF; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Ferreira, AG; Machado, GMC; et al. Una pirimidina- -carbolina i altres alcaloides de Annona foetida amb activitat antileishmanial. J. Nat. Prod. 2006, 69, 292–294. [Ref creuat]