Bioassaig per controlar l'efecte anti-envelliment del tractament amb sang de cordó umbilical

Contacte:jerry.he@wecistanche.com

Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Departament de Biotecnologia, Facultat de Ciències de la Vida, Universitat CHA, Gyeonggi-do 13488, República de Corea

2. Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02114, EUA

3. Departament de Biologia de Sistemes, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, EUA *Aquests autors van contribuir a parts iguals.

Autor corresponent: Hakho Lee, PhD. Center for Systems Biology, Massachusetts General Hospital, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, EUA. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, PhD. Departament de Biotecnologia, Facultat de Ciències de la Vida, Universitat CHA, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, República de Corea. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Ivyspring International Publisher. Aquest és un article d'accés obert distribuït sota els termes de la llicència Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). Consulteu http://ivyspring.com/terms per obtenir els termes i condicions complets.

Rebut: 04.10.2018; Acceptat: 2018. 11. 18; Publicat: 01.01.2019

Cistanche té un efecte anti-envelliment

Resum

FonsEl tractament d'animals vells amb plasma d'una etapa de desenvolupament primerenca (per exemple, plasma del cordó umbilical) va mostrar un potencial impressionant per frenar la degradació associada a l'edat de les funcions neuronals i cognitives. Traduir aquestes troballes a realitats clíniques, però, requereix maneres efectives d'avaluar l'eficàcia del tractament; Els mètodes ideals han de ser mínimament invasius, aptes per a assaigs en sèrie, rendibles i quantitatius.

Mètodes: Hem desenvolupat un nou enfocament de biosensor per monitoritzaranti edatteràpia. Hem avançat dos components clau del sensor: i) es va identificar un metabòlit transmès per la sang com a marcador d'envelliment substitut; i ii) es va desenvolupar un sistema d'assaig compacte i rendible per a aplicacions in situ. Hem tractat ratolins envellits amb plasma de cordó umbilical humà o amb solució salina; El perfil de metabòlits imparcial al plasma del ratolí va revelar l'àcid araquidònic (AA) com a indicador potent associat amb elanti edatefecte. A continuació, vam implementar un sensor magnetoelectroquímic competitiu (cMES) optimitzat per a la detecció d'AA directament des del plasma. La plataforma desenvolupada podria detectar AA directament a partir de petits volums de plasma (0,5 µL) en 1,5 hores.

Resultats: els assajos de cMES van confirmar una forta correlació entre els nivells d'AA iefecte anti-envelliment: Els nivells d'AA, tot i que disminueixen amb l'envelliment, van augmentar en els ratolins envellits tractats amb plasma, que també van mostrar un millor rendiment de l'aprenentatge i la memòria.

Conclusions: La plataforma cMES potenciarà tant el pre-clínicanti edatla investigació permetent la vigilància longitudinal del tractament mínimament invasiva; aquestes capacitats acceleraran el desenvolupament deanti edatteràpies, millorant la qualitat de vida individual.

Paraules clau: Anti-envelliment, Àcid araquidònic, Perfil de metabòlits, Sensor magnetoelectroquímic, Biosensor

Introducció

L'envelliment és cada cop més reconegut com un factor de risc clínic per a la degeneració cognitiva (per exemple, neurodegeneració, demència) i altres malalties cròniques (per exemple, càncer, malalties cardiovasculars, degeneració muscular) [1]. Amb l'expansió de la vida humana i el creixement de la població d'edat avançada, s'estan duent a terme esforços significatius per dilucidar els mecanismes d'envelliment [1–3] i trobar estratègies terapèutiques per frenar o fins i tot revertir els processos d'envelliment [4]. De fet, s'han informat resultats prometedors d'estudis en animals; Els ratolins adults que van rebre una transfusió de plasma de ratolins joves van recuperar la funció cognitiva, la plasticitat sinàptica i l'activitat neuronal [5]. Desenvolupament ràpid enanti edatEs preveuen tractaments i la seva traducció en assaigs humans [6]. Les mètriques actuals per controlar els efectes del tractament, però, tenen una pràctica limitada, ja que els mètodes sovint són difícils d'aplicar amb humans (per exemple, imatges cerebrals invasives, observació controlada del comportament) i subjectius (per exemple, qüestionaris sobre experiències dels pacients). Un requisit clau per avançaranti edatper tant, les teràpies es troben en el desenvolupament d'assajos quantitatius i mínimament invasius per al seguiment del tractament.

Vam raonar que els metabòlits serien una font potentanti edatbiomarcadors. Els metabòlits són un fenotip essencial en un organisme i s'estan estudiant com a biomarcadors diagnòstics d'altres malalties [7]. En particular, l'envelliment s'associa normalment a canvis o disfuncions metabòliques, que afecta els perfils globals dels metabòlits dels organismes. Com a tal, és concebible que rastrejar la composició i/o els nivells de metabòlits informés de l'eficàcia deanti edattractament. A més, els assajos de metabòlits, especialment en forma d'anàlisis de sang, podrien ser quantitatius i mínimament invasius; aquests mèrits facilitarien conèixer diferents règims de tractament o grups de pacients, i controlar la dinàmica (anti-)envelliment mitjançant mostres en sèrie.

A continuació es descriu una nova estratègia de biosensor per al seguimentanti edattractament. Es van avançar dos elements clau: i) es va identificar un metabòlit transmès per la sang com a marcador d'envelliment substitut; i ii) es va desenvolupar un sistema d'assaig ràpid i rendible per a aplicacions en entorns clínics rutinaris. Concretament, vam tractar una cohort de ratolins d'edat (uns 2 anys) amb plasma de sang de cordó humana. Les anàlisis metabolòmiques exhaustives de la sang del ratolí van revelar que l'àcid araquidònic (AA), el nivell del qual va disminuir significativament amb l'envelliment, va augmentar a la inversa en el grup tractat. Aquesta observació ens va portar a idear un sensor magnetoelectroquímic per a dianes moleculars petites: vam optimitzar una reacció electroquímica competitiva en què l'AA es capturava en perles magnètiques i es concentrava per a una major sensibilitat. La plataforma desenvolupada podria detectar AA directament a partir de petits volums de plasma (0,5 µL) en 1,5 hores. Amb aquesta plataforma, podríem establir encara més una correlació positiva entre els nivells d'AA en sang i el millor rendiment dels animals en la tasca motora.

Resultats

Tractament de ratolins adults amb plasma de sang de cordó La figura 1a mostra l'esquema global de l'experiment.

Com a agent, hem utilitzat plasma derivat de mostres de sang de cordó umbilical humà. Estudis anteriors van demostrar que els ratolins vells que es van injectar amb plasma de ratolins joves van recuperar la funció de memòria espacial i l'administració sistèmica de plasma de sang de cordó humà va millorar la cognició dependent de l'hipocamp en ratolins vells [5, 8]. La injecció de plasma, que està desproveït de components cel·lulars, va minimitzar el risc de rebuig immunitari procedent del desajust d'espècies. Els ratolins envellits (edat inicial, 18 mesos) van ser aleatoritzats i van rebre plasma (un grup de tractament) o tampó salí (un grup simulat) mitjançant una injecció de cua-vain (130 µL; vegeu la figura S1 per a més detalls). Com a control positiu, es van utilitzar ratolins joves (3 mesos d'edat). El plasma derivat de la sang del cordó umbilical no es va agrupar i cada ratolí es va infusionar repetidament amb plasma del mateix donant (Fig. S1). Després d'una 4-setmana de tractament, els ratolins van ser sotmesos a una prova de comportament (és a dir, rotarod) i es va extreure sang per analitzar.

Figura 1. Disseny experimental. Es va administrar plasma de sang de cordó humà als grups joves (3-mes d'edat), grans (20- i 23-mes) i grups grans tractats amb plasma (20- i 23-mes d'edat). Els tres grups es van sotmetre a 2-proves de prova de Rotarod per mesurar la coordinació i l'aprenentatge motors. Es va realitzar un perfil de metabòlits no dirigit a la sang dels tres grups, i la majoriaanti edat-La via rellevant es va determinar mitjançant un enfocament bioinformàtic. El biosensor es va desenvolupar per detectar el metabòlit més important de la via.

Figura 2. Determinació de biomarcadors de metabòlits associats al tractament amb plasma de sang de cordó humà. (A) Perfil global de la pertorbació del metabòlit. Les files corresponen a característiques (una combinació única de valor m/z i temps de retenció) des de LC/MS i columnes fins a mostres. Les files estan agrupades jeràrquicament. (B) Gràfic de puntuació de PCA per a la reducció dimensional. Les mostres es van representar en funció del component principal (PC) 1 i 2. Els valors entre parèntesis de les llegendes dels eixos són proporcions de variància explicades per aquests components. El PC1 probablement explica els efectes anti-envelliment, atès que el grup tractat amb plasma estava molt més a prop del grup jove que del grup simulat. (C) Anàlisi d'enriquiment de la via. Els metabòlits es van identificar fent coincidir els valors de m/z mesurats amb la informació de la massa molecular. Cada cercle representa un camí específic trobat. Per a una via determinada, la ubicació o la mida x del cercle correspon a la centralitat relativa (una mesura de l'impacte de la via) dels metabòlits, i la ubicació o el color y (valors de p més baixos per al vermell i més alts per al blau) fins a la mesura de quins metabòlits estan sobrerepresentats. Les vies dominants tenen valors x i y més alts. En conseqüència, el metabolisme de l'àcid araquidònic (AA) es va identificar com la via més probable per explicar-hoefectes anti-envellimentdel plasma de sang de cordó.

Anàlisi metabòlica de mostres de sang de ratolí

Primer vam realitzar un perfil imparcial de metabòlits de molècules petites al plasma del ratolí. Les mostres de sang dels tres grups de ratolins es van sotmetre a anàlisis de cromatografia líquida i espectrometria de masses (LC/MS). Vam processar les dades m/z mitjançant MAIT (kit d'eines d'identificació automàtica de metabolits) i vam identificar característiques estadísticament significatives mitjançant ANOVA (8572 combinacions úniques de m/z i temps de retenció) (Fig. 2a). L'anàlisi de agrupació jeràrquica (HCA) dels metabòlits va revelar dos patrons clau: i) els perfils dels metabòlits eren clarament diferents entre els ratolins envellits (no tractats) i els joves; i ii) el perfil dels ratolins envellits tractats amb plasma era més proper al dels ratolins joves.

L'anàlisi de components principals (PCA) va revelar estructures inherents a les dades de metabolòmica (Fig. 2b). Al voltant del 50 per cent de les variacions totals es van explicar pel primer (PC1) i el segon components principals (PC2). Les tres cohorts (és a dir, grups joves, tractats amb plasma i falsos) es van establir en posicions discretes, cosa que indica que es van identificar característiques biològicament rellevants per diferenciar les classes de grup. Curiosament, el grup d'edat tractat amb plasma es va allunyar de la farsa cap al grup jove. Per quantificar la separació de grups, vam calcular la agrupació jeràrquica dels dos components principals. En el dendrograma, els grups joves i tractats amb plasma es van agrupar a un nivell de dissimilaritat més baix (o un nivell de similitud més alt, 1120,9) que el grup no tractat (3162,5) (Fig. S2). Aquests resultats indiquen que les característiques seleccionades (variables o files a la figura 2a) es poden utilitzar per inferir el biomarcador del metabòlit rellevant per a l'envelliment ianti edat. Vam anotar les característiques amb metabòlits coneguts mitjançant una base de dades de domini públic [9].

També vam avaluar les funcions i la interconnectivitat dels metabòlits identificats, aplicant el mapeig KEGG (Enciclopèdia de Kyoto de gens i genomes) [10]. Per a una via determinada, vam mesurar i) la sobrerepresentació d'un metabòlit candidat i ii) la seva importància (és a dir, la centralitat de l'intermediació) [11] com a node intermedi clau entre parells d'altres metabòlits (vegeu Mètodes per a més detalls). Vam trobar que el metabolisme de l'àcid araquidònic (AA) era la via més sobrerepresentada (el valor y més alt a la figura 2c) i els metabòlits d'aquesta via tendien a localitzar-se als camins de comunicació (valors x més alts a la figura 2c) i governar el flux d'informació. Entre molts metabòlits en el metabolisme de l'AA, vam seleccionar el propi AA com a biomarcador; com a entrada inicial a la via, l'AA només pot ser un representant d'altres metabòlits pertorbats.

Sensor magnetoelectroquímic competitiu (cMES) per a la detecció d'AA en plasma

A continuació, ens vam proposar avançar en un sistema d'assaig ràpid i in situ per a la detecció d'AA. Vam optar per utilitzar la tecnologia de detecció magnetoelectroquímica [12–17]. Combina l'enriquiment i la detecció d'objectius en una única plataforma: les perles magnètiques (MB) s'utilitzen per capturar i etiquetar dianes moleculars, i les dianes lligades a les perles es detecten mitjançant la detecció electroquímica. Aquest enfocament té molts avantatges pràctics: i) les mostres natives (plasma o sang) es poden utilitzar directament sense necessitat de purificació de mostres; ii) l'assaig aconsegueix una alta sensibilitat de detecció mitjançant l'enriquiment magnètic i l'amplificació del senyal enzimàtic; iii) basant-se en l'esquema de detecció elèctrica, els sensors es poden miniaturizar fàcilment com a dispositiu portàtil (Fig. 3a).

La detecció d'AA mitjançant la detecció magnetoelectroquímica, però, va suposar un repte tècnic; com que l'AA és una molècula petita (~ 304, 5 Da), els immunoassaigs amb un parell d'anticossos AA van ser difícils d'aplicar. Així, vam explorar un format d'assaig competitiu (cMES; sensor magnetoelectroquímic competitiu) que només requeria un únic anticòs AA (Fig. 3b). Per a la captura d'objectius, hem recobert MB amb anticossos AA (MBAb). També vam preparar un agent competidor (AA-HRP) conjugant AA amb un enzim oxidant (peroxidasa de rave picant, HRP). Concretament, hem utilitzat una forma d'hapten; AA conjugat a l'albúmina sèrica bovina (BSA) i més HRP conjugat al portador BSA (Fig. S3). Per a l'assaig cMES, les mostres de sang es van barrejar amb MBAb i AA-HRP. La quantitat d'AA-HRP va ser suficient per saturar els llocs d'unió a AA a MBAb (Mètodes). Això comportaria una càrrega diferencial de HRP en MB, depenent de les quantitats endògenes d'AA a les mostres. L'addició seqüencial d'un mediador d'electrons cromogènics (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, TMB) va generar un corrent elèctric que va ser llegit per un elèctrode pla. El temps de reacció per a la captura d'AA i la incubació de TMB es va optimitzar per maximitzar el nivell de senyal (Fig. S4).

Figura 3. Sensor magnetoelectroquímic competitiu (cMES) per a l'assaig AA. (A) Esquema del dispositiu. El dispositiu cMES té una petita empremta i permet

operacions in situ. (B) Hem ideat un assaig electroquímic competitiu per a la detecció d'AA. Les perles magnètiques (MBAb) es van conjugar amb anticossos contra AA.

Les mostres de control contenien només AA-HRP i es van barrejar amb perles magnètiques. Les mostres de prova es van barrejar amb perles magnètiques i AA-HRP. (C) Corrents elèctrics

mesurat pel lector portàtil cMES. En l'assaig cMES, la magnitud actual disminueix amb l'augment de la concentració d'AA [AA]. El senyal del control

la mostra estableix la línia de base per a [AA]=0 ng/mL. La diferència actual (∆I) entre el control i les mostres de plasma objectiu es va utilitzar com a mètrica analítica. (D)

Les quantitats conegudes d'AA es van afegir al sèrum i es van mesurar amb el cMES. El límit de detecció va ser de ~ 126 ng/mL. (E) Es van comparar cMES i ELISA

concordança. Els resultats d'ambdues modalitats van mostrar un bon acord (R2=0,959). Les dades es mostren com a mitjana ± SEM a partir de mesures per triplicat.

Figura 4. Mesures d'AA en mostres de plasma. (A) Anàlisi temporal del nivell d'AA del ratolí després de la injecció de plasma. Vam injectar 13 {{10}} μL de plasma (concentració d'AA=7,2 µg/mL) a ratolins (n ​​{= 6) i vam recollir sang de ratolins després del 3, 7 i 14 dies. A continuació, es van controlar els nivells d'AA de sang de ratolins. Els nivells d'AA van augmentar significativament el dia 3 i van tornar al nivell normal després de 7 dies. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (b)="" es="" van="" analitzar="" mostres="" de="" plasma="" de="" ratolí.="" al="" grup="" control="" (n="5)," els="" ratolins="" joves="" (edats,="" 5="" i="" 8="" mesos)="" tenien="" nivells="" d'aa="" més="" alts="" que="" els="" ratolins="" vells="" tractats="" amb="" simulació="" (edats,="" 20="" i="" 23="" mesos;="" n="8)." per="" al="" grup="" tractat="" amb="" plasma="" (n="5)," es="" va="" observar="" un="" augment="" sostingut="" de="" l'aa.="" *p=""><0,05; **p=""><0,01; ***p=""><0,001. (c)="" les="" mostres="" de="" plasma="" de="" les="" mateixes="" cohorts="" que="" a="" (b)="" es="" van="" analitzar="" mitjançant="" espectrometria="" de="" masses.="" els="" nivells="" d'aa="" van="" mostrar="" una="" tendència="" similar="" a="" la="" mesurada="" per="" cmes.="" *p=""><0,05; **p=""><0,01; ***p=""><0,001. les="" dades="" es="" mostren="" com="" a="" mitjana="" ±="">

Com a resultat de l'assaig competitiu, la magnitud del corrent elèctric va disminuir amb concentracions més altes d'AA en plasma ([AA]). Per tant, vam preparar una mostra de control incubant MBAb només amb AA-HRP. La mostra de control es va utilitzar per establir la línia de base superior (és a dir, [AA]=0 ng/mL) per calcular les diferències de senyal; Es van mesurar els corrents elèctrics del control i la mostra de plasma, i la diferència neta |∆I |=|Icontrol - Iplasma|es va obtenir (Fig. 3c). Tal

les mesures diferencials també van compensar el senyal de fons comú.

L'experiment de valoració (Fig. 3d) amb mostres augmentades amb quantitats variables d'AA va revelar el límit de detecció (LOD) de ~ 125, 9 ng/mL. El LOD de l'assaig va ser ~ 300- vegades inferior a la concentració típica d'AA de (38 µg/ml) en plasma de ratolins joves (5 mesos, n=2). A partir d'aquests resultats, vam diluir les mostres de plasma inicials (100-plegament) afegint una solució tampó (vegeu Mètodes). El senyal de la unió inespecífica estava a prop d'un nivell de fons intrínsec (~ 43 nA), beneficiant-se potencialment de l'alt factor de dilució. També vam confirmar que els resultats de l'assaig coincidien amb els de l'ELISA convencional (R2=0.961, figura 3e). L'assaig cMES, però, va ser més ràpid (1 hora) que ELISA (4 hores), sobretot a causa de la cinètica d'unió ràpida; al cMES, els MB capturen AA en tot el volum de mostra (3-difusió dimensional), mentre que la captura d'AA es basa en la difusió 1-dimensional a l'ELISA basat en plaques.

Monitorització d'AA en ratolins tractats amb plasma

Hem aplicat cMES per analitzar els nivells d'AA en ratolins després d'un sol tractament amb plasma. Com que l'AA està present de manera natural a la sang del cordó humana, la injecció de plasma augmentaria additivament els nivells d'AA del ratolí. La concentració mitjana d'AA de sis plasma de sang de cordó humà diferents va ser de 7,2 ± 0,5 µg/mL (mitjana ± SEM). Vam injectar 13 0 µL de plasma de sang de cordó humà als ratolins (n ​​= 6) i vam controlar els seus nivells d'AA (figura 4a). La injecció de plasma va augmentar immediatament els nivells d'AA en sang (dia 3; p <0, 01,="" en="" comparació="" amb="" tots="" els="" altres="" punts="" de="" temps),="" però="" l'efecte="" va="" ser="" temporal;="" els="" nivells="" d'aa="" van="" tornar="" a="" la="" normalitat="" 7="" dies="" després="" del="" tractament="" (p="0,34," en="" comparació="" amb="" el="" punt="" de="" temps="" abans="" de="" la="" injecció="" de="">

A continuació, monitoritzem els nivells plasmàtics d'AA després del programa de tractament complet (Fig. S1). Es van utilitzar tres cohorts de ratolins diferents: un grup d'edat tractat amb plasma (n=8) i un grup d'edat simulat (n=8) (20-23 mesos) i un grup control jove (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

El tractament amb plasma condueix a la millora cognitiva i del comportament en ratolins envellits

També vam avaluar els fenotips de comportament de les cohorts animals, especialment avaluant les seves funcions d'aprenentatge motor i memòria. Hem realitzat {{0}}tests de rotació de prova a 1 i 4 mesos després del tractament amb plasma o simulat (Fig. 5a); es va utilitzar la latència (temps de funcionament) d'un ratolí abans de caure sobre una vareta giratòria per avaluar el rendiment motor de l'animal. Un mes després del tractament (20-mes d'edat), la latència tant del grup simulat com del grup tractat amb plasma era significativament menor (p < 0,0001)="" que="" la="" dels="" joves="" (5-mes="" d'edat).="" )="" grup="" (fig.="" 5b).="" el="" grup="" tractat="" amb="" plasma,="" però,="" va="" mostrar="" una="" millora="" gradual="" en="" l'aprenentatge="" motor="" i="" la="" memòria,="" mentre="" que="" la="" mateixa="" facultat="" va="" disminuir="" en="" el="" grup="" simulat.="" els="" canvis="" en="" els="" nivells="" d'aa="" van="" produir="" canvis="" de="" comportament,="" que="" podrien="" servir="" com="" a="" indicador="">anti edatefecte del tractament (Fig. 5c).

Les anàlisis del teixit cerebral (Figs. 5d, 5e) van mostrar que els ratolins vells (el grup simulat) tenien una àrea més petita de cèl·lules positives per DCX a la zona subventricular que els ratolins joves. Per contra, l'àrea de cèl·lules positives per DCX va augmentar a l'animal tractat amb plasma i es va mantenir sense canvis (p=0.04), cosa que indica que el plasma de sang de cordó injectat va estimular la neurogènesi del cervell vell. Els resultats suggereixen el benefici potencial del tractament amb plasma sobre la neurogènesi sostinguda que va donar lloc a una millora de la funció motora en el grup tractat.

Discussió

Els avenços en les teràpies de rejoveniment augmenten simultàniament la necessitat d'una mesura objectiva i quantitativa per llegir l'eficàcia del tractament. Així, vam dissenyar el nostre estudi per identificar biomarcadors moleculars que puguin explicar millor les característiques fenotípiques de l'envelliment ianti edattractament. Els nostres experiments amb animals van conduir a les observacions següents: i) els perfils de metabòlits de les cohorts de ratolins joves i adults són evidentment diferents; i ii) injectar plasma de cordó humà a ratolins vells canvia els seus patrons de metabòlits més propers als dels ratolins joves. Curiosament, hem trobat l'àcid araquidònic (AA) com el biomarcador substitut més eficaçanti edattractament; El metabolisme de l'AA no estava molt regulat tant en ratolins joves com tractats amb plasma, i es va trobar que jugava un paper clau en la interacció amb altres vies metabòliques com el metabolisme de l'àcid linoleic [10, 18].

Vam desenvolupar encara més un sistema de sensors portàtil i ràpid (cMES) per facilitar la detecció d'AA en la investigació rutinària i els entorns clínics. Hem integrat específicament un esquema d'assaig competitiu amb enriquiment immunomagnètic per tal de detectar dianes moleculars petites (és a dir, metabòlits) directament a partir de mostres de plasma. Aquesta combinació aporta els següents avantatges. (i) L'assaig es beneficia d'una cinètica d'unió ràpida, ja que les perles magnètiques capturen AA en tot el volum de la mostra (3-difusió dimensional). (ii) Els processos d'assaig (per exemple, els passos de rentat) es simplifiquen amb imants externs utilitzats per a la recollida de perles. (iii) En concentrar magnèticament les perles lligades a AA a prop de l'elèctrode de detecció, es pot millorar el senyal analític global (~ 72 per cent) [12]. De fet, vam demostrar que l'assaig cMES utilitza<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Figura 5. Assajos moleculars i de comportament. (A) Les proves de prova de 2-Rotarod es van dur a terme 1 i 4 mesos després de la injecció de plasma. (B) El grup tractat amb plasma

va mostrar una millora progressiva de la coordinació motora; el rendiment va ser proper al del grup jove al final (la segona prova als 3 mesos). El temps d'execució del grup simulat va disminuir amb l'envelliment. *p <0.05; **p=""><0.01. (c)="" per="" al="" grup="" tractat="" amb="" plasma,="" l'augment="" dels="" nivells="" d'aa="" va="" precedir="" la="" millora="" de="" la="" funció="" motora.="" *p=""><0,05; **p=""><0,01; ***p=""><0,001. (d)="" les="" cèl·lules="" cerebrals="" de="" la="" zona="" subventricular="" es="" van="" immunocolorir="" per="" a="" un="" marcador="" de="" neurogènesi,="" la="" doblecortina="">

La barra d'escala és de 50 µm. Tingueu en compte que el grup simulat tenia una àrea significativa més petita de cèl·lules positives per DCX a la zona subventricular que els ratolins joves, mentre que l'àrea va augmentar a l'animal tractat amb plasma i es va mantenir sense canvis. (E) Es va mesurar l'àrea de cèl·lules positives DCX a la imatge (D). *p <0,05; ***p=""><>

S'ha demostrat que l'AA promou el creixement muscular i el desenvolupament del cervell [19, 20]. Altres informes també van destacar els possibles beneficis de l'AAanti edat[21, 22]. L'estudi actual està en línia amb aquestes troballes, però el seu abast es limitava a establir una relació correlativa entre els nivells d'AA ianti edatfenotips. Tanmateix, el seguiment en sèrie d'AA va indicar que els augments d'AA en ratolins tractats amb plasma probablement provenien de fonts endògenes, no de plasma transfós. A més, sostingutanti edates van observar efectes en ratolins receptors fins i tot 4 mesos després del final del tractament amb plasma. L'aprenentatge motor i les funcions de memòria van millorar; i el nombre de cèl·lules precursores neuronals va augmentar al cervell. Aquestes observacions suggereixen fortament canvis fisiològics en ratolins tractats amb plasma; el mecanisme exacte encara no s'ha dilucidat.

Altres limitacions d'aquest estudi s'han de tractar en futures investigacions. En primer lloc, l'assaig cMES s'ha de perfeccionar per obtenir una major precisió. En particular, amb la manca de mostres negatives veritables (és a dir, mostres de sang sense cap AA endògena), era difícil tenir en compte els senyals de la unió no específica. És possible que l'efecte de les matrius sanguínies sigui insignificant, ja que hem diluït les mostres per 100- vegades. Aquesta hipòtesi, però, s'ha de validar mitjançant l'ús de mostres de plasma suprimides amb AA que es podrien preparar a partir d'un model de ratolí amb deficiència d'AA [23] o mitjançant la immunodepleció d'AA. En segon lloc, ens vam centrar a detectar un únic metabòlit en el metabolisme de l'AA per simplicitat, però aquest enfocament pot ignorar el context biològic com ara les interaccions entre metabòlits en una via determinada. Incloure un panell de metabòlits capturaria millor les pertorbacions metabòliques i també augmentaria la precisió del diagnòstic. cMES es pot escalar fàcilment per detectar diversos marcadors mentre es consumeixen petites quantitats de mostra. En tercer lloc, interpolar les troballes actuals als humans seria un repte. Tot i que els ratolins i els humans comparteixen vies metabòliques similars, els ratolins tenen una taxa metabòlica 7- vegades més alta que els humans [24]. Els assaigs humans són necessaris per determinar les dosis plasmàtiques òptimes per a la infusió i establir línies de base per als biomarcadors; informats per estudis en animals, estem planejant aquests estudis humans. Aquests esforços acceleraran el desenvolupament deanti edatteràpies, millorant la qualitat de vida individual i reduint les càrregues socials.

Mètodes

Disseny experimental

El plasma es va separar de la sang del cordó umbilical humana recollida durant el part. El plasma de sang de cordó es va administrar per infusió intravenosa a ratolins vells (18-mes d'edat) i control simulat (18-mes) i ratolins joves (3-mes com a positius). control) es va injectar amb solució salina. A 1 i 4 mesos després del trasplantament, es van fer proves de 2-rotarod per avaluar la coordinació motora i la memòria a llarg termini (Fig. S1). El perfil de metabòlits no dirigit es va realitzar a la sang dels tres grups i l'anàlisi bioinformàtica va determinaranti edatvia rellevant (metabolisme de l'àcid araquidònic). El biosensor es va desenvolupar per detectar l'àcid araquidònic que circula de manera fàcil i eficient.

Preparació de mostres de sang de cordó

La sang del cordó humà es va recollir sota la Junta de Revisió Institucional de l'Hospital General CHA (Seül, Corea, Núm. CHAMC de l'IRB-2015- 08-130-009). Es va donar sang de cordó humà de 4 donants i es va tractar amb anticoagulant citrat-fasfat-dextrosa amb adenina (CPDA-1). El plasma de sang de cordó humà es va aïllar mitjançant centrifugació a 2,000 g durant 15 min a temperatura ambient. Les mostres de plasma aïllades es van emmagatzemar a -80 graus i es van utilitzar amb un sol cicle de congelació-descongelació a temperatura ambient.

Experiments amb animals

Els protocols d'animals van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat CHA (IACUC). Hem utilitzat ratolins femelles C57BL/6 de 18-mes d'edat per avaluar pertorbacions metabòliques i fenotips de comportament que es correlacionen amb l'envelliment ianti edat. Els controls positius eren ratolins femelles C57BL/6 de 3-mes d'edat. Tots els ratolins es van criar a temperatura ambient en un cicle de llum-foscor estàndard de 12 hores. Per als ratolins adults, el plasma de sang de cordó o solució salina (130 µL) es va injectar per via intravenosa 12 vegades durant 4 setmanes. El plasma de sang de cordó humà aïllat no es va agrupar i un determinat animal va rebre plasma de sang de cordó del mateix donant. El nombre d'animals utilitzats en cada experiment es descriu a les seccions corresponents del mètode. El plasma es va recollir mitjançant centrifugació (3,000 g, 15 min a temperatura ambient).

Adquisició de metabòlits i anàlisi de dades

Per perfilar els metabòlits transmesos per la sang, es va recollir sang dels ratolins mitjançant punció cardíaca en els punts de temps designats: el grup jove (3-mes d'edat, n=10), el grup simulat ({{ 4}}mes, n=10; 23-mes, n=12), el grup tractat amb plasma ({20-mes, n {{13) }}; 23-mes d'edat, n=5). Les mostres de sang es van analitzar mitjançant un sistema de cromatografia líquida-espectrometria de masses (LC-MS) (Agilent). Vam convertir fitxers LC/MS en un format mzXML estàndard (ProteoWizard) [25] i després els vam processar mitjançant MAIT (kit d'eines d'identificació automàtica de metabolits) [26] per a la detecció de característiques, l'anàlisi estadística i la identificació de metabòlits. Es van identificar característiques estadísticament significatives (és a dir, metabòlits ionitzats i/o fragmentats) mitjançant l'anàlisi de la variància (ANOVA). Aquestes característiques es van relacionar amb tots els possibles metabòlits putatius de la base de dades de metabolomes [9] en funció de la relació massa/càrrega de l'ió espectral de masses (tolerància m/z de 0.005). Es van caracteritzar les alteracions globals dels metabòlits mitjançant l'anàlisi de agrupació jeràrquica i les estructures inherents de les dades de metabolòmica mitjançant l'anàlisi de components principals (PCA). Es van incloure dues o tres rèpliques tècniques (assegurant que la variació tècnica és molt més petita que la variació biològica) per ratolí a l'aprenentatge no supervisat, com ara PCA i agrupació jeràrquica. La agrupació jeràrquica en components principals (HCPC) va ser realitzada per FactoMineR, un paquet R [27]. Per a una anàlisi funcional, es van determinar les vies metabòliques més probables pertorbades per l'envelliment i el tractament amb plasma mitjançant l'anàlisi de la via KEGG (MetaboAnalyst 3.0) [28]. La distribució hipergeomètrica es va utilitzar per mesurar la sobrerepresentació dels metabòlits coincidents en vies específiques de KEGG.

Preparació de perles immunomagnètiques

Les perles magnètiques (5 mg) recobertes amb grups epoxi (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen) es van suspendre en 100 µL de solució de fosfat sòdic 0,1 M. Es van afegir cent micrograms d'anticossos contra l'àcid araquidònic (Biomatik) i es van barrejar a fons. Es van afegir cent microlitres de solució de sulfat d'amoni 3 M i la barreja es va incubar a temperatura ambient durant 2 hores i després es va incubar més a 4 graus durant la nit amb una rotació lenta d'inclinació. La reacció de conjugació es va dur a terme a pH=7.4. Aquests processos indueixen la formació d'unions covalents entre grups epoxi (perla) i amina (anticossos), que prèviament vam confirmar sotmetent els conjugats d'anticossos-perla a desafiaments de pH [29]. De mitjana, es van immobilitzar 2,4 × 104 anticossos per compte. Les perles magnètiques conjugades amb anticossos es van separar amb un imant permanent, es van rentar dues vegades amb solució de PBS i es van tornar a suspendre en 200 µL de PBS amb un 1% de BSA. Les perles es van emmagatzemar a 4 graus fins a un mes.

Conjugació HRP amb àcid araquidònic

L'HRP es va conjugar a BSA mitjançant la química d'aminació reductiva. Concretament, 100 µg d'AA conjugat amb BSA (RPU51089, Biomatik) es va dissoldre en 0,5 ml de tampó carbonat-biocarbonat 0,2 M (pH 9,4), afegit a un mil·ligram d'enllaç EZ liofilitzat. Més peroxidasa activada (Thermo Scientific) i incubada durant 1 hora a temperatura ambient. A continuació, es van afegir 10 µL de cianoborohidrur de sodi (Thermo Scientific) i la barreja es va incubar durant 15 min a temperatura ambient. Finalment, es van afegir 20 µL de tampó d'extinció (Thermo Scientific), seguit d'una incubació de 15 min a temperatura ambient. L'electroforesi en gel i l'anàlisi de la banda de proteïnes van confirmar la conjugació HPR amb BSA-AA (Fig. S3a). Els AA conjugats amb HRP es van recollir i concentrar amb un filtre centrífug Amicon Ultra 100K (Millipore). La peroxidasa i la BSA-AA restants es van rentar amb PBS quatre vegades.

Detecció electroquímica d'AA en mostres de plasma

Per a la detecció electroquímica d'AA, es va recollir sang dels joves (n {{0}}), dels grups simulats (n=8) i dels grups tractats amb plasma (n=5 durant 1 mes i n=5 durant 3 mesos). Les mostres de plasma de ratolí (0,5 µL) es van diluir en 50 µL d'1 per cent de BSA en PBS (×100- vegades de dilució) i es van barrejar amb una solució de perles immunomagnètiques (50 µL) i una solució AA conjugada amb HRP (50 µl). La quantitat d'AA-HRP era prou gran com per saturar els llocs d'unió en perles magnètiques. Hem utilitzat unes 8,4 × 107 perles per prova, que van fer disponibles 2,0 × 1012 llocs d'unió AA. La quantitat d'AA-HRP va ser ~ 1,7 × 1013; la proporció entre AA-HRP i llocs d'unió va ser de ~ 8: 1. La mescla es va incubar a temperatura ambient durant 1 hora amb una lent rotació d'inclinació. La perla de control es va preparar barrejant l'1 per cent de BSA en PBS (50 µL) amb una solució de perles immunomagnètiques (50 µL) i una solució AA conjugada amb HRP (50 µL). Totes les perles reaccionades es van separar amb un imant permanent i es van rentar dues vegades amb 80 µL de PBS (1 per cent de BSA). Finalment, les perles es van tornar a suspendre en 7 µL de PBS. La solució de perles preparada i 20 µL de solució de TMB (Biomatik) es van carregar a la part superior de l'elèctrode. Després de 6 minuts, es va iniciar la mesura de la cronoamperometria. Hem utilitzat un sensor electroquímic miniaturitzat (un sistema prototip desenvolupat per AcurreHealth Inc.). Es va fer una mitjana dels nivells actuals en l'interval de 40-45 s. Hem utilitzat el factor de conversió (×100) per informar de les concentracions d'AA originals estimades al plasma.

Assaig immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA)

Els experiments ELISA es van realitzar mitjançant el kit ELISA d'àcid araquidònic (AA) de ratolí (Biomatik) segons les directrius de fabricació. Es va afegir AA diluït en sèrie a cada pou i es va incubar amb AA conjugat amb HRP a 37 graus durant 40 min. Després de rentar-se amb tampó de rentat durant quatre vegades, es va afegir una solució de TMB i es va incubar durant 20 min. El desenvolupament del color es va aturar afegint una solució de parada. L'absorbància es va llegir a 450 nm mitjançant un lector de microplaques (Tecan).

Prova de Rotarod

Hem modificat la prova de Rotarod de Kong et al. [30] per avaluar la coordinació locomotora. La vareta giratòria amb una vareta de 3-cm de diàmetre va començar a 4 rpm i va accelerar 4 rpm cada 30 segons durant 5 min. Els ratolins es van col·locar a la vareta i es va mesurar el temps que trigaven els ratolins a caure de la vareta. A cada ratolí se li van fer 3 proves al dia i els temps de funcionament de cada dia es van calcular com a mitjana dels temps d'entrenament. La primera prova de rotació es va dur a terme 1-mes després del tractament amb plasma: el grup jove (n=29), el grup simulat (n=17), el grup tractat amb plasma (n {{{ 11}}). Es va iniciar una sessió de reciclatge 4-mesos després del tractament amb plasma. Per evitar el sobreentrenament, es va realitzar un reciclatge durant 2 dies. L'altre procediment va ser el mateix que la primera sessió.

Imatge del teixit cerebral

Un mes (n=4) i 4 mesos (n=3) després de la injecció de plasma de sang de cordó humà o injecció de solució salina, els animals van ser sacrificats i després es van perfondre amb un 4% de paraformaldehid (PFA) i PBS a través del ventricle esquerre. Els grups joves (n=5) i els grups simulats (n=4) es van utilitzar com a controls. Els seus cervells ho eren

extret i crioprotegit. Cada cervell es va seccionar en un criòtom amb un gruix de 30 μm. A

realitzar la immunohistoquímica, la unió inespecífica es va bloquejar amb un sèrum de cabra normal al 5 per cent en 0,3 per cent de Tritó X-100 durant 40 min. L'anticòs primari contra Doublecortin (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) es va aplicar durant la nit a 4 graus, i després es va utilitzar PBS per al rentat [31]. Es va utilitzar l'anticòs secundari Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) per a la detecció de DCX. Les imatges es van prendre amb un microscopi de fluorescència (Nikon Eclipse 80i) i es van analitzar mitjançant la imatge J [32].

Anàlisi estadística

L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant les funcions bàsiques R i lme4, un paquet R per a Linear

Models d'efectes mixts o model lineal generalitzat

(GLM) seguit d'una prova post-hoc de LSD [33]. Les dades es presenten com a mitjanes ± error estàndard i el valor p de <{2}},05 es="" va="" considerar="">

Material complementari

Figures complementàries.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Agraïments

Donem les gràcies a AccureHealth Inc. per proporcionar el sensor electroquímic miniaturitzat. Aquest estudi va comptar amb el suport en part de la subvenció de l'Institut de Promoció de Tecnologies de la Informació i les Comunicacions (IITP) finançada pel Govern de Corea (MSIT) (2017M3A9B4025699).

Interessos competitius

Els autors han declarat que no existeix cap interès competitiu.