La breu inhalació de sevoflurà pot reduir la formació de cicatrius glials després d'una lesió cerebral hipòxica-isquèmica en rates neonatals Part 1

Resum

Estudis anteriors han demostrat que el postcondicionament amb sevofluran pot proporcionar neuroprotecció després d'una lesió hipòxica-isquèmica i millorar la funció d'aprenentatge i memòria en el desenvolupament del cervell dels rosegadors.

La lesió hipòxico-isquèmica es refereix a un estat patològic causat per isquèmia cerebral, hipòxia, trastorn metabòlic i dany a les cèl·lules nervioses a causa de trastorns dels sistemes cardiovascular i cerebrovascular. Amb el progrés social i els canvis d'estil de vida, les lesions hipòxico-isquèmiques són cada cop més freqüents. Aquesta condició pot causar molts danys a la salut humana, inclòs afectar la intel·ligència i la memòria.

Tot i que la hipòxia i la isquèmia poden provocar una disminució de la funció cerebral, això no vol dir que la memòria es vegi afectada negativament. Al contrari, podem millorar la memòria i augmentar l'eficiència del cervell mitjançant els mètodes adequats. Aquí teniu algunes maneres d'ajudar a millorar la vostra memòria:

1. Alimentació saludable: L'impacte de la dieta en la memòria és molt important. Els aliments rics en proteïnes, vitamines i minerals poden ajudar a mantenir un sistema nerviós i una funció de pensament saludables.

2. Fes més exercici: l'exercici físic pot afavorir la circulació sanguínia, augmentar el flux d'oxigen, millorar la immunitat corporal i reduir el risc de patir malalties. Mitjançant l'exercici, podeu millorar la vostra capacitat de memòria.

3. Enfortir l'autoconfiança: la confiança és un factor important en la memòria d'una persona. Si creieu que podeu completar una tasca determinada, aconseguireu fàcilment els resultats que voleu i també podreu millorar de manera efectiva la vostra memòria.

Es pot veure que la lesió hipòxico-isquèmica no és una condició que perjudiqui inevitablement la memòria humana. Mentre dominem els mètodes correctes i cuidem bé el nostre cervell, podem abraçar un futur saludable amb una actitud positiva. Es pot veure que hem de millorar la memòria, i Cistanche deserticola pot millorar significativament la memòria perquè Cistanche deserticola és un material medicinal tradicional xinès que té molts efectes únics, un dels quals és millorar la memòria. L'eficàcia de Cistanche deserticola prové dels múltiples ingredients actius que conté, com l'àcid tànic, polisacàrids, glicòsids flavonoides, etc. Aquests ingredients poden promoure la salut del cervell a través de diverses vies.

Feu clic a Coneix 10 maneres de millorar la memòria

El model clàssic Rice-Vannucci es va utilitzar per induir una lesió hipòxica-isquèmica i es van tractar rates nounats (dia postnatal 7) amb sevofluran al 2, 4% durant 30 minuts després de la lesió hipòxica-isquèmica.

Els nostres resultats van mostrar que el postcondicionament amb sevoflurà va millorar significativament la funció d'aprenentatge i memòria de les rates, va disminuir l'astrogliosi i la formació de cicatrius glials, va augmentar el nombre d'espines dendrítiques i va protegir la histomorfologia de l'hipocamp. Mecànicament, el postcondicionament amb sevofluran va disminuir l'expressió de von Hippel-Lindau del factor induïble per la hipòxia-1 i va augmentar l'expressió de DJ-1.

La injecció d'1,52 ug de l'inhibidor del factor -1 induïble per la hipòxia YC-1 (Lificiguat) al ventricle lateral esquerre 30 minuts abans de la lesió hipòxica-isquèmica va revertir la neuroprotecció induïda pel sevoflurà. Aquesta troballa suggereix que el sevoflurane pot alleujar eficaçment l'astrogliosi a l'hipocamp i reduir els problemes d'aprenentatge i memòria causats per la formació de cicatrius glials després d'una lesió hipòxica-isquèmica.

El mecanisme subjacent pot estar relacionat amb l'expressió DJ-1 regulada a l'alça, la ubiqüitinació reduïda del factor induït per la hipòxia-1 i l'expressió estabilitzada del factor induïble per la hipòxia-1. Aquest estudi va ser aprovat pel Comitè de Cura d'Animals de Laboratori de la Universitat Mèdica de la Xina, Xina (núm. d'aprovació 2016PS337K) el 9 de novembre de 2016.

Paraules clau: dany cerebral; cervell; sistema nerviós central; en viu; ferida; model; plasticitat; rata; recuperació; regeneració; reparar Classificació de la biblioteca xinesa núm. R453; R741; R614.2+1.

Introducció

L'encefalopatia hipòxico-isquèmica neonatal (HIE) és una complicació comuna en el període neonatal causada per molts factors, com ara l'asfíxia neonatal, el malestar intrauterí i la malaltia de la membrana hialine (Douglas-Escobar i Weiss, 2015; Barkhuizen et al., 2017).

L'HIE és la principal causa de mortalitat infantil i la font principal de seqüeles neurològiques (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015). El noranta per cent dels supervivents d'HIE tenen disfunció neurològica a llarg termini, com ara disfuncions d'aprenentatge, cognitives i motores, i epilèpsia (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). El tractament actual de l'HIE se centra principalment en el tractament simptomàtic, inclosa la ventilació mecànica, la correcció de la hipotensió, la suplementació de glucosa i la limitació de la ingesta de líquids, segons correspongui.

Tanmateix, es requereix un tractament eficaç capaç de revertir o reduir el dany cerebral a llarg termini (Stankowski i Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Com a part fonamental de l'aprenentatge i el reconeixement, l'hipocamp, inclòs el gir dentat (DG) , CA1 i CA3, participen en la transformació i integració de la informació perifèrica als centres nerviosos (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

L'hipocamp és hipersensible al dany hipòxic-isquèmic (HI), que pot provocar l'apoptosi de les neurones hipocampals, estimular una gliosi reactiva excessiva i conduir a la formació de cicatrius glials (Hopkins i Haaland, 2004; Wang et al., 2012). La proliferació d'astròcits és crucial per segellar el lloc de l'infart, remodelar l'estructura de l'hipocamp i controlar temporalment les respostes immunes locals durant la fase aguda (Rolls et al., 2009).

Tanmateix, la hipertròfia i la formació de cicatrius glials contribueixen a la neurogènesi aberrant, obstrueixen el creixement de la columna dendrítica i dificulten la forma de la sinapsi, perjudicant encara més les funcions d'aprenentatge i reconeixement (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda i Sofroniew, 2014; Pekny et al. , 2014; Shi et al., 2017).

La proteïna àcida fibril·lar glial (GFAP) i els proteoglicans de sulfat de condroitina, com el neurocan, són marcadors patològics d'astrogliosi i cicatrius glials, l'expressió dels quals pot ser regulada per astròcits altament activats (Pekny i Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Així, la inhibició de l'astrogliosi i la cicatrització glial pot ser un objectiu terapèutic per a l'HIE i les seves seqüeles neurològiques a llarg termini.

S'ha demostrat l'aplicació de sevofluran per mitigar la lesió per HI en rosegadors. Els estudis que investiguen la importància del postcondicionament de sevoflurà (SPC) per alleujar el dany de l'HI mitjançant la regulació positiva del factor induïble per la hipòxia -1 (HIF{-1) en rosegadors adults i rates neonatals han identificat diversos mecanismes potencials (Wang et al., 2019b; Yanget). al., 2019; Du et al., 2020; Liu i Gong, 2020).

Com a sensor fisiològic clau de la hipòxia, HIF-1 és un factor de transcripció amb centenars de molècules aigües avall implicades en mecanismes de tolerància inisquèmica, com el factor de creixement endotelial vascular i l'eritropoietina (Na et al., 2015). S'ha verificat que el postcondicionament hipòxic redueix l'activació d'astròcits i microglials després de l'HI en cervells de rates neonatals (Teo et al., 2015).

Per tant, vam plantejar la hipòtesi que l'HIF-1 pot contribuir a atenuar la formació de cicatrius glials i l'astrogliosi. L'HIF-1 pot existir de manera constitutiva a les neurones, de manera que augmenta ràpidament l'expressió i s'acumula en condicions hipòxiques. Tanmateix, quan l'oxigen torna a la normalitat, l'expressió de HIF1 no es pot mantenir a un nivell prou alt com per exercir contínuament un efecte neuroprotector a causa de la degradació depenent de l'oxigen per les proteïnes prolil-hidroxilasa i la posterior ubiquitilació per les proteïnes de von Hippel-Lindau (VHL) (Berra et al., 2003; Zhang et al., 2018).

DJ-1 (codificada per Park7) és una proteïna neuroprotectora, especialment en condicions oxidatives (Aleyasin et al., 2007, 2010). La proteïna VHL interacciona físicament amb DJ-1, tal com determina una pantalla d'espectrometria de masses imparcial i confirmat en un model de malaltia de Parkinson (MP). A més, Parsanejad et al. (2014) van demostrar que DJ-1 inhibeix la ubiquitilació depenent de VHL i estabilitza l'expressió HIF-1.

Així, vam plantejar la hipòtesi que el sevoflurane estabilitza la proteïna HIF-1 a l'hipocamp regulant DJ{-1 per inhibir la ubiquitilació de HIF-1, millorant així l'aprenentatge a llarg termini i la funció de memòria.

Per investigar el paper de HIF-1 en la relació entre el sevoflurà i l'astrogliosi, hem utilitzat YC-1 (Lificiguat), antagonista selectiu de HIF-1, per inhibir completament l'expressió de HIF-1 a el nivell post-transcripcional. En aquest estudi, hem investigat el paper de HIF-1a en la neuroprotecció de rates neonatals HIE tractades amb SPC.

Materials i mètodes

Els animals
La investigació en animals es va realitzar en l'etapa sinàptica del desenvolupament de la rata, que comença el dia postnatal 7 (P7), corresponent al període de creixement dels nadons humans des de l'embaràs fins als 3 anys després del naixement (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Es van seleccionar rates Sprague-Dawley de set dies amb un pes de 12 a 16 g d'entre 20 rates embarassades (compradas al Laboratori de l'Hospital Shengjing, Universitat Mèdica de la Xina, Xina; proporció mascle/dona, 1:1).

Totes les rates van poder accedir a l'aigua i al menjar lliurement i es van mantenir a la humitat i la temperatura estàndard al laboratori, amb cicles de 12-hores de llum/foscor (8 a.m./20:00 p.m.). Tots els experiments amb animals es van realitzar d'acord amb les directrius per a la cura i l'ús d'animals de laboratori dels Instituts Nacionals de Salut (Bethesda, MD, EUA).

El Comitè de Cura dels Animals de Laboratori de la Universitat Mèdica de la Xina va aprovar formalment els experiments descrits (Shenyang, Xina; aprovació núm. 2016PS337K) el 9 de novembre de 2016.

De 25 rates embarassades, es van triar 249 rates P7 i es van dividir aleatòriament en grups basant-se en una taula de nombres aleatoris (Wang et al., 2019a). La nostra anàlisi final va incloure un total de 201 rates nounats; la taxa de mortalitat després del tractament amb HI va ser del 19%.

Aquestes 201 rates acabades de néixer es van dividir aleatòriament en quatre grups: sham (n=54), HI (n=54), HI + sevoflurane (HIS) (n=54) i HIS+ YC{{ 6}} (n=39) grups. En cada grup, es van utilitzar 24 rates per a l'assaig de Western blot, 5 es van utilitzar per a la immunohistoquímica i la tinció de Golgi i 10 es van utilitzar per a proves de comportament. Les 45 rates restants en grups simulats, HI i HIS es van utilitzar per a la reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa (RT- PCR).

Disseny experimental i exposició a l'anestèsic

El model HIE emprat es va descriure prèviament (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). A partir de la distància entre l'anus i els òrgans reproductors, es va completar la identificació sexual de rates postnatals. Per establir el model HIE, el cap de cada rata P7 es va posar en una canonada de plàstic transparent, que es va segellar amb cotó abans que s'alliberés el sevoflurane (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

L'artèria caròtida comuna esquerra de cada rata estava lligada permanentment, i entre les dues lligacions, l'artèria es va tallar; cada cirurgia es va acabar en 5 minuts. Posteriorment, les rates es van despertar sense ser afectades per l'anestèsia i es van tornar a posar a les gàbies de la seva mare durant 2 hores. un conducte ajudava a la ventilació, mentre que l'altre transportava la mostra de gas fora de la cambra al monitor.

La cambra es va ventilar amb un 30% d'O2 i un 70% de N2 durant 2 hores per al grup simulat, mentre que es van administrar un 8% d'O2 i un 92% de N2 durant 2 hores al grup HI. SPC es va establir immediatament després de l'HI: 2, 4% de sevoflurane (1 concentració alveolar mínima) va ser inhalat per rates a la cambra amb una atmosfera del 30% O2 i 70% N2 i un flux d'aire de 2 L/min durant 30 minuts. La piscina de calefacció va estabilitzar la temperatura dins de la cambra a 37 graus.

Administració de fàrmacs

Exactament 30 minuts abans de l'HI, es van injectar 1,52 ug d'inhibidor de HIF-1 (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) al ventricle lateral esquerre (Paxinos i Franklin, 2013) mitjançant una xeringa 5-μLHamilton (Yingweida Technology, Beijing, Xina). Tal com es va descriure anteriorment, YC-1 es va dissoldre en líquid cefaloraquidi artificial a una concentració de 0,304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Anàlisi Western blot

Les rates P7 van ser anestesiades amb sevofluran al 2% i es van extreure teixits de l'hipocamp dels cadells a les 12, 24 i 48 hores i 28 dies després de la cirurgia. Després de l'extracció, els teixits es van col·locar immediatament sobre gel.

Les proteïnes sobrenedants totals es van aïllar afegint un agent d'assaig de radioimmunoprecipitació (Beyotime, Haimen, Xina). Les concentracions de proteïnes es van determinar amb un kit One BCA (Beyotime).

A continuació, es van separar els exemplars en gels de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida al 12, 5% i es van transferir a membranes de nitrocel·lulosa. Després de bloquejar-se amb un 5% d'albúmina sèrica bovina (Sigma-Aldrich) a 4 graus, la membrana es va incubar amb els anticossos primaris adequats, inclòs anti-gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH; 1:2000; Cat # 5174S; CellSignal Technology); , Danvers, MA, EUA), anti-DJ-1 (1:1000;Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, Regne Unit), anti-VHL (1:5000;policlonal; Cat# ab77262; Abcam), anti -HIF-1 (1:900;policlonal; Cat# ab2185; Abcam), anti-neurocan (1:200;monoclonal; Cat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) , proteïna de densitat anti-postsinàptica 95 (PSD95; 1:1000; monoclonal; Cat. No 3409S; Cell Signaling Technology), proteïna 43 associada a anticreixement (GAP43; 1:2000; policlonal; Cat# 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology , Chicago, IL, EUA) i anti-GFAP (1:5000, policlonal, Cat# ab53554;Abcam).

Després, es van incubar taques amb IgG anti-conill (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Beijing, Xina) o IgG anti-ratolí (1:5000; Cat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) durant 2 hores a temperatura ambient.

Es van visualitzar taques de proteïnes amb reactius de detecció de quimioluminescència millorats (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, EUA). Les bandes de proteïnes es van quantificar amb el programari ImageJ (Instituts Nacionals de Salut). Per a l'anàlisi de les taques occidentals, les dades es van normalitzar a GAPDH.

Immunohistoquímica

Vint-i-vuit dies després de la cirurgia, les rates es van administrar anestèsiques mitjançant el mètode descrit anteriorment, perfusades amb formalina al 4%, i els seus cervells es van eliminar per a la tinció d'immunofluorescència.

Els cervells es van submergir en paraformaldehid al 4% a 4 graus durant 48 hores, posteriorment es van deshidratar en una sèrie d'etanol graduat i finalment es van incrustar en parafina. A continuació, es van tallar teixits incrustats en parafina en seccions de 2.5-μm de gruix amb un vibratom i les seccions resultants es van emmagatzemar a temperatura ambient.

Cada cervell es va seccionar contínuament i es van seleccionar tres insections discontinues per a la tinció de NeuN (marcador neuronal), GFAP (marcador d'astròcits) i neurocan (marcador de cicatriu glial). GFAP (1:250; policlonal; Cat# ab53554; Abcam), antígens de conill (1:100; Cat# 12943; Cell Signaling Technology) i/o ratolí anti-neurocan (1:200; monoclonal; Cat# sc{{ 10}}; Santa Cruz Biotechnology) a 4 graus durant la nit en una cambra humidificada.

Posteriorment, es van rentar les seccions amb solució salina tamponada amb 0,1 Mfosfat i es van incubar durant 2 hores a temperatura ambient amb els anticossos secundaris adequats, inclosa la IgG anti-conill conjugada amb Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies, Grand Island, NY, EUA), IgG anti-ratolí conjugada a Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies) i IgG anti-cabra conjugada a isotiocianat de fluoresceïna (1:200; Life Technologies).

La contratinció dels nuclis cel·lulars es va implementar amb 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Beyotime) durant 5 minuts.

Es va utilitzar un microscopi Olympus BX51 (OlympusCorporation, Tòquio, Japó) per a l'observació de seccions tacades. Es van seleccionar aleatòriament tres camps de visió de l'hipocamp esquerre de cada porció per a la fotografia. Es va utilitzar el programari ImageJ per estimar la colocalització quantitativa i, per tant, calcular el coeficient de superposició de Manders.

For more information:1950477648nn@gmail.com