Carvedilol, un bloquejador adrenèrgic, suprimeix la síntesi de melanina mitjançant la inhibició de la via de senyalització CAMP/CREB en melanòcits humans i cultiu de pell humana ex vivo

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1,Youngsup Song 3,*,‡ i Sung Eun Chang 1

Resum:Les catecolamines funcionen mitjançant receptors acoblats a proteïnes G, provocant un augment dels nivells intracel·lulars de 30, 50-adenosina monofosfat cíclica (AMPc) a diverses cèl·lules. Existeixen la biosíntesi de catecolamines i el receptor adrenèrgicmelanòcits; per tant, les catecolamines poden tenir un paper crític en la pigmentació de la pell. No obstant això, encara no s'han investigat la seva acció i els mecanismes que medien la melanogènesi de la pell inhumana. Per tant, vam examinar l'efecte anti-melanogenètic potencial del carvedilol, un bloquejador no selectiu amb activitats de bloqueig 1-febles. Carvedilol va reduir el contingut de melanina i l'activitat de la tirosinasa cel·lular sense comprometre la viabilitat cel·lular en humans normalsmelanòcitsaixí com en melanòcits de ratolí immortalitzats per Mel-Ab. Factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF), tirosinasa, proteïna relacionada amb la tirosinasa (TRP)-1 i TRP-2 regulat per carvedilol. El tractament amb carvedilol va provocar la baixada de la proteïna d'unió a l'element de resposta fosfor-cAMP (CREB). A més, l'augment dels nivells d'AMPc després del tractament amb forskolina va revertir l'acció anti-melanogènica del carvedilol. A més, el carvedilol va reduir notablement l'índex de melanina en cultius de pell humana irradiats amb ultraviolats. En conjunt, els nostres resultats indiquen que el carvedilol suprimeix eficaçment la melanogènesi en humansmelanòcitsi la pell humana ex vivo mitjançant la inhibició de la senyalització cAMP/proteïna cinasa A/CREB. Els efectes anti-melanogènics del carvedilol tenen una importància potencial per a la pellblanqueigagents.

Paraules clau:carvedilol; bloquejador adrenèrgic;síntesi de melanina; Senyalització cAMP/CREB

Cistancheés capaç d'inhibir la síntesi de melanina

1. Introducció

Una àmplia gamma de trastorns pigmentaris de la pell té un impacte psicològic i social important en els pacients. S'han desenvolupat diverses modalitats de tractament, inclosos els agents sistèmics i tòpics, així com la teràpia amb làser [1–3]. Tanmateix, els resultats solen ser insatisfactoris i les reaccions adverses, com ara la hiperpigmentació postinflamatòria (PIH) i la hipopigmentació, del tractament són freqüents. A més, el tractament és car i requereix molt de temps [4–6].

Les catecolamines, que inclouen dopamina, epinefrina i norepinefrina, són molècules de senyalització que actuen com a neurotransmissors i hormones endocrines. A la pell, la biosíntesi i la degradació de les catecolamines es produeixen als queratinòcits humans, però la síntesi de catecolamines als melanòcits és una mica diferent [7–9]. Les catecolamines funcionen mitjançant receptors acoblats a proteïnes G (GPCR). La unió de catecolamines als GPCR desencadena l'activació de l'adenilateciclasa intracel·lular, que sintetitza 30, 50-adenosina monofosfat cíclica (AMPc) a partir d'ATP [10]. El segon missatger cAMP exerceix la seva activitat unint la subunitat R de la proteïna cinasa A (PKA), donant lloc a la fosforilació de la proteïna d'unió a l'element de resposta (CREB) de cAMP. Els GPCR estan activats per amines i pèptids, incloent glucagó, hormona paratiroïdal, secretina i calcitonina [10].

Els antagonistes del receptor adrenèrgic inclouen els antagonistes del receptor i del receptor. Els -receptorantagonistes es classifiquen en agents no selectius, 1-selectius i 2-selectius, mentre que els -receptors antagonistes es subclassifiquen com a no selectius, 1-selectius i 2-selectius. agents basats en les seves activitats de bloqueig selectiu. A diferència dels antagonistes dels receptors no selectius de primera generació, com el propranolol, el timolol i el nadolol, el carvedilol és un bloquejador no selectiu de tercera generació que mostra accions vasodilatadores bloquejant els 1-adrenoreceptors (1-AR) [11]. Per tant, el carvedilol és un bloquejador anunciatiu amb activitats de bloqueig 1-febles [12]. S'utilitza principalment com a medicament oral per controlar la pressió arterial alta i la malaltia cardíaca congestiva, similar a altres bloquejadors [12]. Tanmateix, els bloquejadors de tercera generació presenten activitats angiogèniques, antioxidants, antiproliferatives, antihipertròfiques i antiapoptòtiques que requereixen més dilucidació [11]. En el camp dermatològic, a causa de les seves accions antioxidants i antiinflamatòries, el carvedilol s'utilitza sovint en formulacions orals per tractar la rosàcia eritematotelangiectàsica [13,14]. A més, l'activitat antioxidant del carvedilol es tradueix en la prevenció de la carcinogènesi de la pell induïda pels ultraviolats (UV), el que la converteix en un agent atractiu per gestionar les malalties de la pell associades als UV [15–18]. Tanmateix, els efectes quimiopreventius del carvedilolare no van mediar directament a través de les AR. [19] Tot i que el mecanisme exacte és relativament desconegut, la via de senyalització cAMP/PKA i PKC-δ podria estar relacionada amb les propietats del carvedilol contra la metàstasi de la pell [20].

En les primeres etapes d'investigació de la pigmentació, humanamelanòcitses va trobar que expressaven la -1-senyalització AR després de la inducció extracel·lular amb norepinefrina. Tanmateix, no es van trobar -AR després de l'estimulació amb senyalització adrenèrgicamelanòcits[8]. Per contra, Cillbro et al. posteriorment va demostrar que existeix un senyal 2-AR funcional específic als melanòcits humans i que l'estimulació 2-AR condueix a la pigmentació a través de la via 2-AR/cAMP [7]. Per tant, es va suggerir el paper de les catecolamines en el control de la pigmentació, i l'AMPc es considera l'eix principal per al control de les catecolamines de la melanogènesi.

La melanogènesi és un procés complex que implica nombroses vies. La tirosinasa, la proteïna 1 relacionada amb la tirosinasa (TRP-1) i la TRP-2, també anomenada dopacrom tautomerasa (DCT), són els tres enzims principals específics dels melanòcits implicats ensíntesi de melanina[21]. La melanogènesi és induïda o inhibida per nombrosos factors, com ara hormones, citocines, neurotransmissors, factors de creixement i micromolècules [21–23].

El regulador positiu més important és el receptor de melanocortina-1 i els seus lligands, melanocortins i hormona adrenocorticotròpica [23]. Tanmateix, diversos factors implicats en la melanogènesi són -endorfines, estrògens, andrògens, vitamina D3 i catecolamines [23]. L'evidència acumulada suggereix que la L-tirosina i la L-DOPA, que són substrats i intermedis de la melanogènesi, actuen com a inductors i reguladors positius de la via melanogènica, a més dels reguladors d'altres funcions cel·lulars [24]. A més, Jeff Howe et al. va suggerir que la inducció i regulació de la melanogènesi per L-tirosina està mediada per l'activació directa dels receptors adrenèrgics per L-tirosina, en lloc de causada pels seus productes metabòlics com les catecolamines [25]. En els seus estudis, la norepinefrina i l'epinefrina van estimular l'activitat de la tirosinasa, però el seu efecte inductiu ensíntesi de melaninaera comparativament inferior a la L-tirosina [25].

Les catecolamines poden tenir un paper important en el sistema de pigmentació de la pell; tanmateix, encara no s'han explorat els seus efectes sobre la melanogènesi pel que fa a l'acció dels bloquejadors no selectius de tercera generació. Per tant, en el present estudi, vam voler investigar si el carvedilol afecta la melanogènesi i vam explorar els seus mecanismes d'acció en humans.melanòcitsi la pell humana ex vivo i el seu ús potencial com ablanqueigproducte.

inhibir la formació de melanina ambcistanches d'herba

2. Resultats

2.1. Carvedilol suprimeix la melanogènesi

La citotoxicitat del carvedilol contra humans normalsmelanòcits(NHMs) i les cèl·lules Mel-ab es van avaluar mitjançant un assaig de proliferació de cèl·lules WST. Una concentració de carvedilol de 10 µM va començar a mostrar citotoxicitat tant contra cèl·lules NHM com Mel-ab (figura 1A, B). Per tant, en avaluacions posteriors, vam utilitzar 8 µM de carvedilol, que no és citotòxic per als NHM.

El tractament amb carvedilol va disminuir el contingut de melanina de manera dependent de la dosi sense afectar la viabilitat dels NHM (figura 1C). El contingut de melanina es va reduir en un 28, 36 per cent després del tractament amb carvedilol de 96 hof 8 µM (figura 1C). L'addició de 100 mg/ml d'arbutina va reduir el contingut de melanina en menor grau que el carvedilol (figura 1C). Després de 4 dies de tractament amb carvedilol, el contingut de melanina va disminuir de manera dependent del temps (figura 1D). No obstant això, el tractament amb forskolina (FSK) durant 4 dies després del pretractament amb carvedilol va induir un augment del contingut de melanina (figura 1E). FSK augmenta la transcripció de MITF al màxim grau a les 2 h en els NHM i es creu que funciona mitjançant el cAMP. Via /PKA/CREB (Figura 1F).

2.2. Carvedilol inhibeix l'expressió de MITF i els seus gens objectiu i disminueix els nivells de fosfo-CREB en NHM

Com que el carvedilol va disminuir l'acumulació de melanina, vam investigar l'activitat de la tirosinasa cel·lular. El tractament amb carvedilol va disminuir l'activitat de la tirosinasa cel·lular de manera dependent de la dosi en els NHM (figura 2A). L'activitat de la tirosinasa va disminuir un 28,48 per cent després de 96 h de tractament amb carvedilol de 8 µM (figura 2A). A continuació, vam determinar si el carvedilol afecta l'expressió de MITF, que té un paper crucial en la regulació de la tirosinasa i els gens melanogènics aigües avall. El tractament amb FSK va augmentar els nivells d'AMPc intracel·lular i va revertir les accions anti-melanogèniques del carvedilol. Carvedilol va reduir significativament els nivells de proteïnes de MITF, un factor de transcripció central de la melanogènesi, a les 72 h (figura 2B). A més, l'expressió dels seus gens objectiu, com la tirosinasa i la TRP-1, es va reduir després del tractament amb carvedilol (figura 2B). Aquests resultats indiquen que el carvedilol inhibeix la melanogènesi regulant la senyalització MITF.

A continuació, es van investigar les vies de senyalització intracel·lular de la melanogènesi, que regulen la transcripció de MITF, mesurant els nivells d'expressió de fosfo-CREB i fosfo-ERK. Els nivells de fosfo-ERK no van canviar amb el temps després del tractament amb carvedilol; tanmateix, els nivells de fosfo-CREB van disminuir (figura 2B). D'acord amb les observacions anteriors, els nostres resultats van revelar que la carvedilolin inhibeix la melanogènesi mitjançant la inhibició de la via de senyalització cAMP/PKA/CREB. A més, el tractament amb FSK va revertir l'acció anti-melanogènica del carvedilol augmentant els nivells d'AMPc.

2.3. Índex de melanina i tinció immunohistoquímica en cultiu de pell humana ex vivo

La densitat de melanòcits epidèrmics i l'índex de melanina en seccions de teixits de cultiu de pell humana ex vivo es van detectar mitjançant la tinció de Melan-A i Fontana-Masson, respectivament. Carvedilol no va afectar el nombre de Melan-A (plus)melanòcitsa la mostra tractada amb carvedilol més radiació UV (UVR) en comparació amb la mostra tractada només amb UVR (figura 3A). Els melanòcits HMB45 (plus) poden indicar que l'activitat melanocítica va augmentar amb el tractament amb UVR i es va regular de manera inversa després del tractament amb carvedilol (figura 3B). Tanmateix, el contingut de melanina es va reduir significativament en els exemplars tractats amb carvedilol més UVR en comparació amb el dels exemplars tractats només amb UVR (figura 3C). Per calcular l'índex de melanina, es va calcular i comparar la fracció de l'àrea tacada de Fontana-Masson sobre l'àrea total entre un exemplar exposat a UVR i el carvedilol més UVR (figura 3D). Els lisats cel·lulars de cada exemplar es van analitzar mitjançant Western blotassay, que va revelar que la tirosinasa, la TRP1 i la DCT es van incrementar amb la UVR i el tractament amb carvedilol regulat a la baixa (figura 3E). Com a resultat, el carvedilol va reduir notablement l'índex de melanina i les proteïnes relacionades amb la melanogènesi, mostrant el seu efecte anti-melanogènic sobre la pell humana tractada amb UVR.

3. Discussió

La melanina és el pigment responsable del color de la pell i el cabell i es sintetitza en melanosomes permelanòcits. Tot i que la melanina epidèrmica té un paper protector important contra la radiació ultraviolada, la sobreproducció i l'acumulació de melanina a la pell causen trastorns hiperpigmentaris de la pell molestos, com ara PIH, dispigmentació associada al fotoenvelliment, melasma i lentigins solars [18,26]. Per tant, la inhibició de la melanogènesi ha estat el focus dels tractaments medicinals i cosmètics per a la bellesa i la salut de la pell. S'han fet esforços considerables per identificar nous i efectius agents anti-pigmentació. Tanmateix, els mecanismes anti-melanogènesi dels agents específics són actualment incerts i generalment s'han avaluat en cèl·lules de ratolí, que donen resultats que no sempre són coherents amb els dels assaigs de pell humana [27,28]. A més, com que la melanogènesi dels melanòcits està estretament regulada pels queratinòcits i altres cèl·lules veïnes, les cèl·lules humanes cocultivades o la pell humana ex vivo són entorns experimentals més fiables per a l'exploració deblanqueigagents [29]. La majoria dels agents blanquejants de la pell, ja siguin d'origen natural o químic, poden causar toxicitat o irritació de la pell, que es poden predir fins a cert punt mitjançant assajos de viabilitat cel·lular in vitro amb melanòcits. En el nostre estudi, el carvedilol no va mostrar citotoxicitat quan s'utilitza en dosis moderades.

cistanche bienfaits

Les cremes tòpics d'hidroquinona poden provocar trastorns d'hipopigmentació no desitjats i toxicitat cutània [30-32]. A més, algunsblanqueigEls cosmètics tenen conseqüències desastroses en induir la hipopigmentació mitjançant la degradació de les proteïnes de la tirosinasa [33–35]. Els agents blanquejants es poden utilitzar a dosis més altes depenent de l'usuari per maximitzar el blanqueig de lesions hiperpigmentàries. Per tant, s'estan explorant contínuament els esforços per descobrir agents per blanquejar la pell segurs i saludables.

Per tant, el present estudi es va dissenyar per dur a terme en cèl·lules humanes normals i pell humana ex vivo. A més, basant-nos en el mecanisme d'acció establert per la senyalització G de les catecolamines, que augmenta el nivell d'AMPc cel·lular, creiem que un bloquejador adrenèrgic podria disminuir els nivells d'AMPc i inhibir la via de senyalització UVR/cAMP/CREB, que és el principal mecanisme per a la hiperpigmentació de la pell induïda pels UV. [36,37]. Per tant, vam plantejar la hipòtesi que els bloquejadors adrenèrgics que disminueixen els nivells d'AMPc es redueixensíntesi de melanina.

A més, per desenvolupar-se segurblanqueigagents, mecanismes fiables i reproductibles d'anti-melanogènesi s'han de perseguir en paral·lel. L'estímul més significatiu fisiològicament és la UV, i entre la senyalització UVR a l'epidermismelanòcits, l'eix CREB és la via més establerta per a la regulació de la melanogènesi a l'epidermis humana [29]. L'exposició a UV activa successivament la producció d'AMP, PKA i el factor de transcripció CREB, que, al seu torn, indueix l'expressió de MITF i gens melanogènics diana aigües avall [38,39]. A més de la fosforilació CREB per PKA, estudis recents han demostrat que el reclutament del coactivador de transcripció regulat per CREB (CRTC) 3 al complex de transcripció CREB també és necessari per a MITF estimulat per cAMP. MITF realitza el paper més essencial en la regulació desíntesi de melaninai la transcripció resultant d'enzims melanogènics [26,40,41]. Durant aquest procés de senyalització intracel·lular, la melanogènesi està regulada per un enzim clau, la tirosinasa i proteïnes enzimàtiques addicionals, com ara TRP-1 i DCT [1–4]. En el present estudi, el carvedilol va reduir eficaçment la fosforilació de CREB, que indica que va reduir les proteïnes MITF i tirosinasa inhibint la transcripció de MITF (figura 4). Tenint en compte que la regulació del gen de l'ARNm del MITF està controlada i rescatada de manera complexa per altres molècules de senyalització intracel·lulars i coactivadors, la regulació del nivell transcripcional del MITF és una estratègia prometedora per explorar ingredients saludables per blanquejar la pell perquè la funció de supervivència del MITF es conserva i es rescata [1,38,40]. De fet, quan vam investigar la transcripció de MITF induïda per FSK, es va trobar que l'ARNm de MITF tenia la seva pròpia corba de resposta màxima per a la melanogènesi i la supervivència cel·lular per a l'homeòstasi cel·lular. Les funcions biològiques demelanòcitssemblava estar regulada intrínsecament per altres senyals de retroalimentació en melanòcits humans. A més, el carvedilol té un menor risc d'esdeveniments adversos d'hipopigmentació, ja que atenua l'activitat de la tirosinasa cel·lular amb el pas del temps, en lloc de de manera brusca.

Les catecolamines inclouen dopamina, epinefrina i norepinefrina i es sintetitzen a partir de la tirosina dietètica per l'acció dels enzims [42]. La biosíntesi i la degradació de les catecolamines es produeixen en una àmplia gamma de cèl·lules, incloses les neurones dels nervis simpàtics i del cervell, les cèl·lules adrenomedul·lars, les cèl·lules endotelials, els neutròfils i les cèl·lules mononuclears [43–45]. A la pell humana, la síntesi de catecolamines es produeix als queratinòcits. Per contra, els melanòcits també expressen ARNm i enzims per a la síntesi autocrina de norepinefrina però no d'epinefrina [7,42]. En humàmelanòcits, -1-AR pot ser important en la reacció a la norepinefrina, peròsíntesi de melaninatambé està influenciada per la 2-ARsignaling funcional [7,8]. Curiosament, els pacients amb vitiligen han augmentat la 2-densitat d'AR als queratinòcits [46]. Es troben un augment dels nivells de norepinefrina a l'orina i al plasma de pacients amb vitiligen no segmental, la qual cosa implica que el metabolisme de les catecolamines pot estar associat amb el desenvolupament i la progressió del vitiligen. [47]. A més, a més dels neurotransmissors d'estrès clàssics, els melanòcits produeixen neuropèptids i hormones, com el factor alliberador de corticotropina i la proopiomelanocortina. Aquesta producció és estimulada per la UVR i altres agents que actuen dins del sistema neuroendocrí de la pell [48]. Per tant, l'acció de les catecolamines i la funció melanocítica estan estretament relacionades en una varietat de vies complexes. A més, el carvedilol podria interferir amb les reaccions químiques de la via melanogènica i aquesta possibilitat s'hauria d'estudiar més. El carvedilol pot tenir avantatges, ja que té efectes antiinflamatoris simultanis, ja que la majoria dels trastorns hiperpigmentaris són PIH clínica o subclínica en pacients de pell fosca. Com que s'ha estudiat la penetració de carvedilol a través de la pell tant in vitro com ex vivo, el carvedilol es pot desenvolupar com a tòpic.blanqueigagent en el futur [49–51].

L'administració sistèmica de carvedilol pot causar bradicàrdia, marejos, hipotensió, mals de cap i mareig. L'aplicació tòpica de carvedilol no acostuma a provocar símptomes sistèmics; tanmateix, hem de prestar molta atenció a aquests símptomes quan s'aplica a pacients amb barreres cutànies defectuoses, com ara dermatitis atòpica. A més, es reporten èczemes, pruïja i erupció liquenoide en casos rars quan es pren carvedilol. Aquests efectes secundaris dermatològics, així com la dermatitis de contacte, també s'han de tenir en compte a l'hora d'aplicar carvedilol com a tòpic.blanqueigagent.

En conclusió, vam demostrar que el carvedilol va reduir eficaçment la melanogènesi en humansmelanòcitsi la pell humana ex vivo mitjançant la inhibició de la via cAMP/CREB/MITF, cosa que suggereix el seu ús potencial com a agent blanquejador eficaç. S'hauria de seguir una investigació addicional de la implicació funcional del receptor adrenèrgic per part del carvedilol en els melanòcits humans.

4. Materials i Mètodes

4.1. Materials

Carvedilol, 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA), toxina del còlera (CT) i 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) es van comprar a Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA). El medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) i la solució salina tamponada amb fosfat de Dulbecco es van comprar a WelGENE (Daegu, Corea). El sèrum boví fetal (FBS), antibiòtic-antimicòtic i tripsina-EDTA es van comprar a Gibco (Grand Island, NY, EUA). Mitjà 254 (CascadeBiologics, Portland, OR, EUA) i FSK ([3R-(3 ,4a ,5 ,6 ,6a ,10 ,10a ,10b )]-5-(Acetiloxy)-3-etenildodecahidro{ {24}},10,10b-trihidroxi-3,4a,7,7,10a-pentametil-1H-nafto[2,1-b]piran-1-un ) es van comprar a Tocris Bioscience (Bristol, Regne Unit).

4.2. Línies cel·lulars i cultiu cel·lular

Els NHM primaris obtinguts d'Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) es van mantenir al medi 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA) complementat amb un suplement de creixement de melanòcits humans (Thermo Fisher). Les cèl·lules Mel-ab, una línia cel·lular de melanòcits immortalitzada espontàniament derivada del ratolí, es van obtenir del Korean Cell Line Bank (KCLB, Seül, Corea) i es van mantenir en DMEM suplementat amb un 10 per cent de FBS, penicil·lina-estreptomicina, 100 nM de TPA i 1 nM. CT. Totes les cèl·lules es van mantenir rutinàriament a 37 ◦ C en un ambient humidificat d'un 5 per cent de CO2.

4.3. Anticossos i Western Blots

Les cèl·lules es van rentar una vegada amb PBS fred i es van lisar en tampó de lisi de proteïnes (1 per cent de SDS en 10 mMTris i 5 mM EDTA, pH 7, 4), seguit d'incubació a 98 ◦ C durant 10 min. Les mostres de proteïnes es van separar mitjançant electroforesi en gel SDS-poliacrilamida del 8 per cent, es van passar sobre membranes de nitrocel·lulosa (GE Healthcare Life Sciences, Chicago, IL, EUA) i després es van bloquejar amb solució salina tamponada amb Tris que contenia 0,5 per cent de Tween 20 i 5 per cent de BSA, i sotmesos a immunoblot. Els anticossos de tirosinasa i TRP-1 es van comprar a Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA) i el MITF es va comprar a Abcam (Cambridge, Regne Unit). -tubulina (Gentex, Holland, MI, EUA) es va utilitzar com a control de càrrega interna.

4.4. Contingut de melanina

L'efecte citotòxic del carvedilol es va avaluar mitjançant el kit d'assaig de viabilitat cel·lular Ez-Cytox (Dogen-Bio Co., Ltd., Seül, Corea) d'acord amb les instruccions del fabricant. Les cèl·lules Mel-Ab i els NHM es van sembrar en plaques de sis pous. a una densitat de 6 × 105 i 3 × 105 cèl·lules/pou, respectivament. Les cèl·lules es van tractar amb carvedilol, tal com es mostra a les figures, durant 3 o 5 dies (d). Abans de mesurar el contingut de melanina, les cèl·lules es van observar amb un microscopi de contrast de fase i es van fotografiar (Olympus, Tòquio, Japó). Les cèl·lules es van dissoldre en 550 µL de NaOH 1 N a 100 ◦ C durant 30 min i es van centrifugar a 13, 000 rpm durant 5 min. L'absorbància dels sobrenedants es va mesurar a 405 nm mitjançant un lector de microplaques. El contingut de melanina intracel·lular es va presentar com a percentatge relatiu al control no tractat de les cèl·lules. Es va utilitzar arbutina (100 mg/ml) com a control positiu.

4.5. Activitat de la tirosinasa cel·lular

L'activitat de la tirosinasa es va avaluar mesurant la taxa de formació de dopacrom de L-DOPA. Després de la incubació amb carvedilol, les cèl·lules es van rentar en PBS fred amb gel i es van lisar en tampó de lisi de tirosinasa (tampó fosfat, pH 6,8, que contenia 1 per cent de Triton X{ {5}}) amb cicles de congelació/descongelació repetits. Els lisats es van aclarir per centrifugació a 15,000 rpm a 4 ◦C durant 10 min. Després de quantificar els nivells de proteïnes del lisat i ajustar les concentracions de proteïnes amb tampó de lisi, 90 µl de sobrenedant barrejats amb 10 µl de L-DOPA 10 mM en tampó de lisi de tirosinasa es van incubar a 37 ◦ C. L'activitat de la tirosinasa cel·lular es va mesurar llegint l'absorbància. 475 nm utilitzant un microplatreader cada 10 min durant almenys 1 h. Es va utilitzar arbutina (100 mg/ml) com a agent de control positiu.

cistanches d'herba

4.6. Anàlisi immunohistoquímica

Els teixits de la pell humana incrustats en parafina es van tallar en seccions de 6-µm de gruix i es van tenyir amb Melan-A (Novocastra, Newcastle, Regne Unit), kits Fontana-Masson (ID labs, Londres, ON, Canadà) i HMB45 (Santa Clara). , CA, EUA), segons les instruccions dels fabricants. L'índex de melanina es va determinar mesurant el percentatge d'àrea tacada a l'àrea total del teixit mitjançant el programari ImageJ 1.52a (Instituts Nacionals de Salut, Bethesda, MD, EUA).

4.7. Anàlisi estadística

Les dades es presenten com a mitjanes ± error estàndard de la mitjana (SEM) i la significació estadística es va determinar mitjançant una prova t de Student no aparellada mitjançant el programari GraphPad Prism5 (San Diego, CA, EUA). En aquest estudi, p <{2}}.05, p=""><0,01 i="" p=""><0,001 es="" van="" considerar="" estadísticament="" significatius="" i="" es="" representen="" per="" *,="" **="" i="" ***,="">

Referències

1. Gillbro, JM; Olsson, MJ La melanogènesi i els mecanismes dels agents per aclarir la pell: enfocaments existents i nous. Int. J. Cosmet. Ciència. 2011, 33, 210–221. [CrossRef] [PubMed]

2. Lee, YJ; Shin, HJ; No, TK; Choi, KH; Chang, SE Tractament del melasma i la hiperpigmentació postinflamatòria mitjançant un làser d'alexandrita de picosegon 755-nm en pacients asiàtics. Ann. Dermatol. 2017, 29.779–781. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, YJ; Park, JH; Lee, DY; Lee, JH. Dispigmentació bilateral adquirida a la cara i el coll: enfocaments clínicament adequats. J. Korean Med. Ciència. 2016, 31, 2042–2050. [CrossRef] [PubMed]

4. Kang, HJ; Na, JI; Lee, JH; Roh, MR; Ko, JY; Chang, SE Hiperpigmentació postinflamatòria associada amb el tractament de lentigins solars mitjançant un Q-Switched 532-nm Nd: làser YAG: una enquesta multicèntrica.J. Dermatòleg. Tracta. 2017, 28, 447–451. [CrossRef] [PubMed]

5. Kato, H.; Araki, J.; Eto, H.; Doi, K.; Hirai, R.; Kuno, S.; Higashino, T.; Yoshimura, K. Un estudi controlat aleatoritzat prospectiu de l'àcid tranexàmic oral per prevenir la hiperpigmentació postinflamatòria després del làser robí Q-switched. Dermatol. Surg. 2011, 37, 605–610. [CrossRef] [PubMed]

6. Taylor, CR; Anderson, RR Tractament ineficaç del melasma refractari i la hiperpigmentació postinflamatòria mitjançant làser robí Q-switched. J. Dermatol. Surg. Oncol. 1994, 20, 592–597. [Ref creuat]

7. Gillbro, JM; Marles, LK; Hibberts, NA; Schallreuter, KU La biosíntesi de catecolamines autocrines i el senyal de beta-adrenoceptor promouen la pigmentació en els melanòcits epidèrmics humans. J. Investig. Dermatol.2004, 123, 346–353. [Ref creuat]

8. Schallreuter, KU; Korner, C.; Pittelkow, MR; Swanson, NN; Gardner, ML La inducció del sistema de transducció del senyal de l'alfa-1-adrenoceptor en melanòcits humans. Exp. Dermatol. 1996, 5, 20–23.[CrossRef]

9. Sivamani, RK; Shi, B.; Griffiths, E.; Vu, SM; Lev-Tov, HA; Dahle, S.; Chigbrow, M.; La, TD; Mashburn, C.;Peavy, TR; et al. La ferida aguda altera la senyalització beta2-adrenèrgica i les vies sintètiques de catecolamines als queratinòcits. J. Investig. Dermatol. 2014, 134, 2258–2266. [Ref creuat]

10. Emery, AC Receptors de catecolamines: Prototips per al descobriment de fàrmacs basats en GPCR. Adv. Pharmacol. 2013, 68.335–356.

11. Do Vale, GT; Ceron, CS; Gonzaga, NA; Simplicio, JA; Padovan, JC Tres generacions de bloquejadors beta: història, diferències de classe i aplicabilitat clínica. Curr. Hipertensos. Rev. 2019, 15, 22–31. [PubMed]

12. McTavish, D.; Campoli-Richards, D.; Sorkin, EM Carvedilol: una revisió de les seves propietats farmacodinàmiques i farmacocinètiques i l'eficàcia terapèutica. Drogues 1993, 45, 232–258. [CrossRef] [PubMed]

13. Hsu, CC; Lee, JY Enrogiment facial pronunciat i eritema persistent de rosàcia tractats eficaçment amb carvedilol, un bloquejador beta-adrenèrgic no selectiu. Melmelada. Acad. Dermatol. 2012, 67, 491–493. [CrossRef][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. Gestió a llarg termini del rubor facial diferent i eritema ofrosàcia persistent mitjançant el tractament amb carvedilol. J. Dermatòleg. Tracta. 2018, 29, 310–313. [CrossRef] [PubMed]

15. Chang, A.; Yeung, S.; Thakkar, A.; Huang, KM; Liu, MM; Kanassatega, RS; Parsa, C.; Orlando, R.;Jackson, EK; Andresen, BT; et al. Prevenció de la carcinogènesi de la pell mitjançant el beta-bloquejant carvedilol. CàncerPrev. Res. 2015, 8, 27–36. [CrossRef] [PubMed]

16. Chen, M.; Liang, S.; Shahid, A.; Andresen, BT; Huang, Y. El beta-bloquejant Carvedilol va prevenir el dany mediat per ultraviolats de les cèl·lules epidèrmiques murines i la pell humana reconstruïda en 3D. Int. J.Mol. Ciència. 2020, 21, 798. [CrossRef] [PubMed]

17. Huang, KM; Liang, S.; Yeung, S.; Oiyemhonlan, E.; Cleveland, KH; Parsa, C.; Orlando, R.; Meyskens, FL, Jr.;Andresen, BT; Huang, Y. Carvedilol aplicat tòpicament atenua la carcinogènesi de la pell induïda per la radiació ultraviolada solar. Càncer Prev. Res. 2017, 10, 598–606. [Ref creuat]

18. Brenner, M.; Audició, VJ El paper protector de la melanina contra els danys UV a la pell humana. Photochem.Photobiol. 2008, 84, 539–549.

19. Cleveland, KH; Liang, S.; Chang, A.; Huang, KM; Chen, S.; Guo, L.; Huang, Y.; Andresen, BT Carvedilolininhibeix la formació de colònies JB6 P mediada per EGF mitjançant un mecanisme independent dels adrenoceptors.PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [Ref creuat]

20. Dzong, G.; Zhongbing, M.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Carvedilol suprimeix la migració i la invasió de cèl·lules mamàries malignes mitjançant la inactivació de Src que implica cAMP/PKA i la via de senyalització PKCdelta. J. Càncer Res. Ther.2014, 10, 998–1003.

21. Rzepka, Z.; Bussman, E.; Beberok, A.; Wrzesniok, D. De la tirosina a la melanina: vies de senyalització i factors que regulen la melanogènesi. Postpy Hig. Med. Dosw. En línia 2016, 70, 695–708. [Ref creuat]

22. Kim, Y.; Cho, JY; Oh, SW; Kang, M.; Lee, SE; Jung, E.; Park, YS; Lee, J. L'adiponectina globular actua com a senyal melanogènic en melanòcits epidèrmics humans. Br. J. Dermatol. 2018, 179, 689–701. [CrossRef][PubMed]

23. Slominski, A.; Tobin, DJ; Shibahara, S.; Wortsman, J. Pigmentació de melanina a la pell dels mamífers i la seva regulació hormonal. Physiol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [PubMed]

24. Slominski, A.; Zmijewski, MA; Pawelek, J. L-tirosina i L-dihidroxifenilalanina com a reguladors semblants a les hormones de les funcions dels melanòcits. Melanoma de cèl·lules pigmentàries Res. 2012, 25, 14–27. [CrossRef] [PubMed]

25. Howe, J.; Costantino, R.; Slominski, A. Sobre el mecanisme putatiu d'inducció i regulació de la melanogènesi per L-tirosina. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150–152.

26. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Vies de senyalització en la melanogènesi. Int. J.Mol. Ciència. 2016, 17, 1144. [CrossRef]

27. Jung, JA; Kim, BJ; Kim, MS; Tu, HJ; Yoon, ES; Dhong, ES; Park, SH; Kim, DW Efecte protector de la toxina botulínica contra la pigmentació de la pell induïda per l'ultraviolat. Plast. Reconstr. Surg. 2019, 144, 347–356.[CrossRef]

28. Jeong, YM; Oh, WK; Tran, TL; Kim, WK; Sung, SH; Bae, K.; Lee, S.; Sung, JH Aglicona de Rh4inhibeix la síntesi de melanina en cèl·lules de melanoma B16: possible implicació de la via de la proteïna cinasa A. Biosci. Biotecnologia. Bioquímica. 2013, 77, 119–125. [Ref creuat]

29. Kim, YH; Kim, D.; Hong, AR; Kim, JH; Jo, H.; Kim, J.; Kim, I.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. Potencial terapèutic de Rottlerin per als trastorns hiperpigmentaris de la pell mitjançant la inhibició de l'activitat transcripcional dels coactivadors de transcripció regulats per CREB. J. Investig. Dermatol. 2019, 139, 2359–2367.e2.[CrossRef]

30. Das, A.; Ghosh, A.; Kumar, P. Leucodermia química a causa de la hidroquinona: un fenomen inusual. Indian J.Dermatol. Venereol. Leprol. 2019, 85, 567. [CrossRef]

31. Jow, T.; Hantash, BM Despigmentació induïda per hidroquinona: informe de cas i revisió de la literatura. Dermatitis 2014, 25, e1–e5. [Ref creuat]

32. Kersey, P.; Stevenson, CJ Vitiligen i exposició laboral a la hidroquinona a partir de màquines d'autofotografia. Contacta amb Dermat. 1981, 7, 285–287. [CrossRef] [PubMed]

33. Sasaki, M.; Kondo, M.; Sato, K.; Umeda, M.; Kawabata, K.; Takahashi, Y.; Suzuki, T.; Matsunaga, K.; Inoue, S. Rhododendron, un compost fenòlic que indueix la despigmentació, exerceix la citotoxicitat dels melanòcits mitjançant un mecanisme depenent de la tirosinasa. Melanoma de cèl·lules pigmentàries Res. 2014, 27, 754–763. [CrossRef] [PubMed]

34. Yoshikawa, M.; Sumikawa, Y.; Hida, T.; Kamiya, T.; Kase, K.; Ishii-Osai, Y.; Kato, J.; Kan, Y.; Kamiya, S.;Sato, Y.; et al. Anàlisi clínica i epidemiològica en 149 casos de leucodermia induïda per rododendros.J. Dermatol. 2017, 44, 582–587. [CrossRef] [PubMed]

35. Harris, JE Vitiligen induït per productes químics. Dermatol. Clin. 2017, 35, 151–161. [CrossRef] [PubMed]

36. Li-Sha, G.; Yi-He, C.; Na-Dan, Z.; Teng, Z.; Yue-Chun, L. Efectes del tractament amb carvedilol sobre l'expressió i la fosforilació de proteïnes d'unió a l'element de resposta cAMP cardíaca en miocarditis induïda per coxsackievirus B3-. BMC Cardiovasc. Desordre. 2013, 13, 100. [CrossRef] [PubMed]

37. Zhang, F.; Els polimorfismes Steinberg, SF S49G i R389G del receptor beta(1)-adrenèrgic influeixen en la senyalització mitjançant les vies cAMP-PKA i ERK. Physiol. Genoma. 2013, 45, 1186–1192. [Ref creuat]

38. Lee, AY; Noh, M. La regulació de la melanogènesi epidèrmica mitjançant vies de senyalització cAMP i/o PKC: coneixements per al desenvolupament d'agents hipopigmentats. Arc. Farmàcia. Res. 2013, 36, 792–801. [Ref creuat]

39. Garcia-Borron, JC; Abdel-Malek, Z.; Jiménez-Cervantes, C. MC1R, la via del cAMP i la resposta a la UV solar: estenent l'horitzó més enllà de la pigmentació. Melanoma de cèl·lules pigmentàries Res. 2014, 27, 699–720.[CrossRef]

40. Lin, CB; Babiarz, L.; Liebel, F.; Roydon Price, E.; Kizoulis, M.; Gendimenico, GJ; Fisher, DE; Seiberg, M. La modulació de l'expressió gènica del factor de transcripció associada a la microftàlmia altera la pigmentació de la pell.J. Investig. Dermatol. 2002, 119, 1330–1340. [Ref creuat]

41. Kim, JH; Hong, AR; Kim, YH; Jo, H.; Kang, SW; Chang, SE; Song, Y. JNK suprimeix la melanogènesi interferint amb l'expressió MITF depenent del coactivador de transcripció regulada per CREB 3-. Theranostics2020, 10, 4017–4029. [CrossRef] [PubMed]

42. Rios, M.; Habecker, B.; Sasaoka, T.; Eisenhofer, G.; Tian, ​​H.; Landis, S.; Chikaraishi, D.; Roffler-Tarlov, S. La síntesi de catecolamines està mediada per tirosinasa en absència de tirosina hidroxilasa. J. Neurosci. 1999,19, 3519–3526. [CrossRef] [PubMed]

43. Cosentino, M.; Marí, F.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Síntesi endògena de catecolamines, metabolisme, emmagatzematge i captació en neutròfils humans. Ciència de la vida. 1999, 64, 975–981. [Ref creuat]

44. Marino, F.; Cosentino, M.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lecchini, S.; Frigo, G. Síntesi de catecolamines endògenes, emmagatzematge del metabolisme i captació en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica humana. Exp. Hematol.1999, 27, 489–495. [Ref creuat]

45. Sorrento, D.; Santulli, G.; Del Giudice, C.; Anastasio, A.; Trimarco, B.; Iaccarino, G. Cèl·lules endotelials capaços de sintetitzar i alliberar catecolamines tant in vitro com in vivo. Hipertensió 2012, 60, 129–136.[CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; Frattini, P.; Santagostino, G.; Preda, S.; Orecchia, G. Les catecolamines augmenten en l'orina del vitiligen no segmental especialment durant la seva fase activa. Pigment Cell Res. 2003, 16, 111–116. [CrossRef][PubMed]

47. Salzer, BA; Schallreuter, KU Investigació de l'estructura de la personalitat en pacients amb vitiligen i possible associació amb alteració del metabolisme de les catecolamines. Dermatologia 1995, 190, 109–115. [CrossRef][PubMed]

48. Slominski, A. Activitat neuroendocrina del melanòcit. Exp. Dermatol. 2009, 18, 760–763. [Ref creuat]

49. Gannu, R.; Vishnu, YV; Kishan, V.; Rao, YM Permeació in vitro de carvedilol a través de la pell porcina: efecte dels vehicles i potenciadors de la penetració. PDA J. Pharm. Ciència. Tecnol. 2008, 62, 256–263.

50. Kshirsagar, SJ; Bhalekar, MR; Mohapatra, SK Desenvolupament i avaluació del sistema de lliurament de fàrmacs transdèrmics carregat de carvedilol: estudi de caracterització in vitro i in vivo. Desenvolupador de drogues. Farmàcia Ind. 2012,38, 1530–1537. [Ref creuat]

51. Tanwar, YS; Chauhan, CS; Sharma, A. Desenvolupament i avaluació de pegats transdèrmics de carvedilol. Acta Pharm. 2007, 57, 151–159. [CrossRef] [PubMed]