Poblacions de cèl·lules T CD8 i CD4 en ronyons humans

edmund.chen@wecistanche.com

Resum:Antecedents: als llocs fronterers i als òrgans interns, les cèl·lules T de memòria residents en teixits (TRM) contribueixen a la barrera immune contra patògens com virus, bacteris, fongs i càncer. Tanmateix, la informació sobre la presència i funció d'aquestes cèl·lules al ronyó humà és escassa. Per tal d'entendre millor la defensa immunològica mediada per les cèl·lules T en aquest òrgan, hem volgut determinar els aspectes fenotípics i funcionals de les cèl·lules T CD8 i CD4 presents en sanes i al·loempelts.ronyó teixit. Mètodes: mitjançant citometria multicanal, vam avaluar el fenotip i la funció de les cèl·lules T en mostres de teixit renal saludable (n=5) ironyóteixit d'al·lograft (n=7) i va comparar aquests aspectes amb les cèl·lules T de la sang perifèrica de controls sans (n ​​= 13). Resultats:Ronyóles mostres de teixit contenien quantitats substancials de cèl·lules T CD8 i CD4. A diferència de les cèl·lules circulants,ronyóLes cèl·lules T expressaven amb freqüència CD69 i CD103 i amb més freqüència feien un cicle actiu. A més, gairebé totsronyóLes cèl·lules T expressaven CXCR3 i sovint expressaven CXCR6 en comparació amb les cèl·lules T a la circulació. Notablement,ronyóLes cèl·lules T produïen majors quantitats d'IFN que les cèl·lules circulants i sovint eren polifuncionals. Conclusió: les cèl·lules T funcionals amb els trets característics del TRM resideixen en humansronyóteixits. Aquestes cèl·lules fan un cicle més actiu i sovint expressen CXCR3 i CXCR6.

Paraules clau:limfòcits residents en teixits; cèl·lules T; CD8; CD4; CD69; CD103; ronyó; al·lograft

CISTANCHE MILLORARÀ LA MALALTIA RENAL/RENAL

1. IntroduccióLes cèl·lules T de memòria resident (TRM) persisteixen als teixits per proporcionar una defensa localitzada a llarg termini contra els patògens. A diferència de les cèl·lules T en recirculació, les poblacions de TRM no es poden detectar a la sang perifèrica i difereixen significativament de les poblacions de cèl·lules T en recirculació pel que fa al seu fenotip, funció i metabolisme [1]. De fet, això no és d'estranyar tenint en compte el fet que diferents sistemes d'òrgans, com els pulmons, estan exposats a càrregues més altes de diferents patògens que en el cas de la circulació, que generalment està aïllada del món exterior [2].La retenció de teixits de TkM persisteix durant anys i està mediada per mecanismes que impliquen l'eix de l'esfingosina-1-receptor de fosfat1 (S1PR1)-esfingosina 1-fosfat (SP1). S1PR1 és un receptor expressat per cèl·lules T que media l'egressió d'òrgans limfoides secundaris en unir-se a la molècula de senyalització bioactiva SP1, que és un important mediador del tràfic de cèl·lules T. Aquest eix pot ser interromput per CD69, una lectina de tipus c unida a la membrana que antagonitza l'expressió S1PR1, mediant així la retenció. A més, en els ratolins, l'expressió S1PR1 és induïda pel factor de transcripció Krüppel-like Factor 2 (KLF2), que es va trobar que estava regulat a la baixa en TRM, inhibint així l'emissió de limfòcits [3]. Al seu torn, es va demostrar que la baixada de KLF2 estava mediada per l'homòleg del factor de transcripció de Blimpl a les cèl·lules T (Hobit), que s'expressa d'una manera específica de TpM a les cèl·lules T murines [4]. A més, alguns TRM també expressen CD103 (integrina E), per la qual cosa es pot identificar TRM mitjançant l'expressió CD69 i CD103 [1].

Si bé el coneixement sobre el fenotip i la funció de TRM està augmentant per a diversos teixits humans, se sap poc sobre aquests aspectes en elronyó. Aquí, les cèl·lules T estan exposades a un conjunt diferent de patògens, com ara bacteris que ascendeixen del tracte urinari inferior i virus renotròpics com el poliomavirus BK (BKPyV). De fet, recentment hem descrit com els ronyons humans contenen un subconjunt de cèl·lules T que expressen CD69 i/o CD103, entre les quals hi ha cèl·lules T CD8 dirigides específicament a les proteïnes BKPyV, proteïna virió 1 (VP1) i proteïna antigen T gran (LTAG) [5]. Nosaltres, i altres, també vam demostrar la presència de cèl·lules T invariants associades a la mucosa (MAIT) que expressen CD69/CD103-enronyóteixit [6,7].

Per entendre millor quin tipus de cèl·lules T constitueixen la resposta immune localitzada en aquest òrgan, hem utilitzat citometria de flux multicanal per investigar el fenotip i la funció deronyóTRM, aïllats del donantronyómaterial de receptors de trasplantament renal (RTR) i de sansronyóteixit adjacent als carcinomes de cèl·lules clares renals, per veure com es comparen aquestes poblacions amb les poblacions de cèl·lules T a la circulació.Hem trobat aquell humàronyóEl teixit conté quantitats substancials de cèl·lules T CD4 i CD8 que expressen només CD69, CD69 i CD103, o cap d'aquests marcadors. Hem trobat les cèl·lules CD69-CD{103-ronyóEl teixit difereix substancialment de les cèl·lules T a la circulació i pot representar una població de TRM que no té els marcadors canònics de TRM. A més, demostrem que les cèl·lules T del ronyó fan un cicle més actiu, segons es jutja per l'augment de l'expressió de Ki-67, en comparació amb la sang. També vam trobar que les cèl·lules T CD8 i CD4 hi entravenronyóel teixit gairebé sempre expressa CXCR3 i sovint expressa CXCR6. Aquestes troballes impliquen un paper d'aquests receptors de quimiocines en l'atracció i el manteniment de les poblacions de cèl·lules T de memòria residents als ronyons.

2. Materials i Mètodes

2.1. Pacients i mostresLes mostres es van obtenir del Biobanc de Malalties Renals de la ubicació AMC d'Amsterdam UMC. En aquest Biobanc, mostres de pacients, com ara sang ironyóteixits, es recullen i s'emmagatzemen a partir d'una vida saludableronyódonants i RTR que se segueixen abans i després del trasplantament de ronyó. Aquest estudi es va dur a terme d'acord amb els principis descrits a les Declaracions d'Hèlsinki i Istanbul i tots els participants van proporcionar un consentiment informat per escrit abans de la inscripció al Biobanc. A més, el Departament de Patologia va donar teixit residual de pacients sotmesos a nefrectomia tumoral (teixit renal llunyà del tumor) i també emmagatzemat al Biobanc. Aquests teixits es van processar de manera anònima segons el codi de conducta de la Federació de Societats Científices Mèdiques Holandeses (Human Tissue and Medical Research: Code of Conduct for Responsible Use, 2011 www.federa.org).

2.2. Cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC)Es van obtenir mostres de sang de controls sans seronegatius del citomegalovirus (CMV) (viusronyódonants abans de la cirurgia, n= 13). Les característiques dels participants en aquest estudi es mostren a la taula 1. Les PBMC es van aïllar de sang d'heparina sòdica mitjançant centrifugació de gradient de densitat estàndard i posteriorment es van criopreservar fins al dia de l'anàlisi.

2.3. Teixit renalEs van obtenir mostres de teixit renal sa (n {{0}}) dels ronyons que es van extirpar quirúrgicament a causa d'un carcinoma de cèl·lules renals (teixit no tumoral llunyà del pol contralateral del ronyó) i del teixit renal del trasplantament (n {{1). }}) es va obtenir a partir d'al·loempelts renals explantats després del fracàs del trasplantament. Aquestes mostres s'anomenen mostres de ronyó sanes i de trasplantament, respectivament. Les rodanxes de còrtex renal es van tallar en cubs de 1-mm amb el McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redding, CA, EUA), es van transferir a tubs de 50 ml i es van rentar amb PBS fred fins que no hi havia sang. visiblement present i el sobrenedant era clar. Es va afegir medi de digestió preescalfat (37 graus), 40 ml per 10 g de teixit (ADNasa tipus IV (50 KU/ml) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Països Baixos), col·lagenasa tipus IV (0,5 mg/ml) (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, EUA), BSA (60 mg/ml) (Sigma Aldrich), 20 uL/ml de sèrum fetal de vedella (FCS, VWR International BV, Amsterdam, Països Baixos), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Amsterdam, Països Baixos), penicil·lina-estreptomicina (Biochrom GMBH, Berlín, Alemanya) a HBSS (Westburg BV, Leusden, Països Baixos)) i es va incubar en un agitador durant 20 minuts a 37 graus. La suspensió calenta es va transferir a un tub C (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Alemanya) i es va sotmetre al programa M_melsa_04.01 al GentleMacs (Miltenyi). El medi de digestió es va desactivar amb PBS fred i la suspensió cel·lular resultant va passar per un colador cel·lular per obtenir una suspensió unicel·lular, que es va sotmetre a una centrifugació de gradient de densitat estàndard segons el protocol del fabricant (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Noruega). ). Les cèl·lules mononuclears aïllades (MNC renals) erencriopreservat fins al dia de l'anàlisi en IMDM complementat amb un 20 per cent de FCS, 000036 per cent v/v de mercaptoetanol, un 5 per cent de DMSO, penicil·lina i estreptomicina.

2.4. Citometria de fluxLes mesures es van realitzar en un citòmetre de flux LSRFortessa (BD Biosciences). Per a cada mostra, es van analitzar 2 × 106 PBMC o 0,5 × 106 a 10 × 106 MNC de ronyó. El volum de cada reacció de tinció era relatiu al nombre de cèl·lules i les concentracions d'anticossos es van mantenir constants. Les cèl·lules es van incubar amb els anticossos de superfície (taula suplementària S1) durant 30 min a 4 graus a la foscor. Les cèl·lules mortes es van excloure mitjançant el colorant de viabilitat fixable eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, EUA). Es van afegir anticossos monoclonals amb dianes intracel·lulars (taula suplementària S1) després de la fixació i permeabilització de les cèl·lules mitjançant el conjunt de tinció de factor de transcripció FoxP3 (eBioscience Inc.). Es van seguir els mètodes publicats per a la citometria de flux i la classificació cel·lular amb finalitats immunològiques [8]. L'estratègia de gating utilitzada per a l'anàlisi fenotípica es pot trobar a la figura suplementària S1. Abans hem demostrat que cap dels marcadors analitzats es va veure afectat pel mètode de digestió utilitzat per aïllar les MNC renals [7].

Les limitacions de mostres de teixit van donar lloc a l'exclusió de mostres dels panells de cortina. A la figura S3 es poden trobar els recomptes de cèl·lules CD3 més analitzats per mostra en PBMCs, MNCs de ronyó sans i ronyons TX. Les mostres de MNC només es van analitzar quan contenien més del 50 per cent de cèl·lules vives dins del limfòcit, tal com va avaluar el dve de viabilitat, i els subconjunts de cèl·lules T basats en CD69/CD103 només es van caracteritzar més si el seu recompte total de cèl·lules superava les 50.

CISTANCHE MILLORARÀ LA INSUFICIÈNCIA RENAL/RENAL

2.5. Assaig d'estimulacióPBMC i MNC renal es van estimular tal com es va descriure anteriorment [7,9]. Les PBMC i les MNC renals es van descongelar en presència d'ADNasa I (200 KU/ml), es van rentar i es van deixar recuperar durant la nit en plaques de 96-pous de fons rodó no tractades (Corning) en medi de cultiu (RPMI complementat amb 10 per cent de FCS i penicil·lina-estreptomicina) a una concentració de 20 × 106/mL (100 μL/pou).

L'endemà al matí, es va afegir acetat de 12-mirstat 13- de forbol (PMA, 10 ng/mL; Sigma Aldrich) i ionomicina (1 ug/mL; Sigma Aldrich) per estimular les cèl·lules. Es va afegir un medi sol com a control negatiu. Totes les incubacions es van realitzar en medi de cultiu en presència de CD28 (clon 15E8; 2 ug/mL), CD29 (clon TS 2/16; 1 ug/mL), brefeldina A (10 ug/mL, Invitrogen) i GolgiStop ( BD Biosciences) en un volum final de 200 uL durant 4 h a 37 graus i 5 per cent de CO2.

Posteriorment, les cèl·lules es van incubar durant 30 min amb els anticossos de superfície (taula suplementària S2). Les cèl·lules mortes es van excloure mitjançant el colorant de viabilitat fixable eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, EUA). Els anticossos monoclonals per a la tinció intracel·lular (taula S1) es van afegir després de la fixació i permeabilització de les cèl·lules mitjançant el conjunt de reactius Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Les cèl·lules es van rentar dues vegades i es van analitzar en un citòmetre de flux LSRFortessa. L'estratègia de gating utilitzada en l'anàlisi funcional es pot trobar a la figura suplementària S2. Per determinar la polifuncionalitat de cada subconjunt de cèl·lules T, es va calcular el nombre mitjà de funcions de cada població mitjançant la fórmula següent:((percentatge de cèl·lules que produeixen 1 citocina]*1) més ([percentatge de cèl·lules que produeixen 2 citocines]*2) més ([percentatge de cèl·lules que produeixen 3 citocines]*3) més ([percentatge de cèl·lules que produeixen 4 citocines]*4) més ([percentatge de cèl·lules que produeixen les 5 citocines]*5))/100.

2.6.Anàlisi de dades

Les dades es van analitzar mitjançant la versió 10 de FlowJo (FlowJo, Ashland, OR, EUA). Tots els gràfics i figures es van crear amb Graphpad Prism versió 8.00 per a Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). També es va utilitzar el mateix programa per a les anàlisis estadístiques de les dades. La prova no paramètrica de Mann-Whitney-U es va utilitzar per determinar la importància de les mostres no aparellades. Per comparar mostres aparellades, es va utilitzar la prova de rang signat de Wilcoxon. valors p<0.05 were="" considered="" statistically="">

3. Resultats

3.1. Expressió diferent de CD8 i/o CD4 i marcadors de residència de teixit per part de cèl·lules T en teixit renal saEn primer lloc, vam comparar l'expressió de CD4 i CD8 per les cèl·lules T CD3-positives a la sang perifèrica amb les cèl·lules detectades en teixit renal sa. Les cèl·lules T CD4-CD8 plus (CD8) es van detectar significativament més sovint al teixit renal que a la sang ((mediana)25 per cent enfront del 38 per cent ) (Figura la). En canvi, CD4*CD{{9} Les cèl·lules T }(CD4) es van detectar en freqüències més altes a la sang que al teixit renal ((70 per cent vs. 52 per cent) Figura la). En general, les cèl·lules T CD4 es van veure amb més freqüència al teixit renal sa que les cèl·lules T CD8 (figura 1b).

A continuació, vam investigar l'expressió dels marcadors de residència dels teixits, CD69 i CD103, en subconjunts de cèl·lules T definits CD8 i CD{4-. Com era d'esperar, CD69 i CD103 pràcticament no eren expressats per cèl·lules de la sang perifèrica (figura 1c). En els teixits sans, els fenotips CD69-CD{103-, CD69 més CD{103-, CD69tCD103 plus i CD{69-CD103 més s'expressaven per, 46 per cent, 45 per cent, 6,6 per cent i 1,8 per cent de cèl·lules CD8T, 61 per cent, 38 per cent, 0,44 per cent i 0,43 per cent de cèl·lules CD4T, respectivament (figura lc). En conclusió, es van detectar cèl·lules T CD8, però particularment CD4 en un nombre substancial en teixit renal humà sa. A més, es va detectar l'expressió de CD69 i CD103, marcadors de residència de teixits, principalment entre les cèl·lules T trobades en teixits sans i no a la sang.

3.2.Diferents patrons d'expressió de marcadors comuns que denominan subconjunts per cèl·lules T en salut/pel teixit renal

CD45RA, una tirosina fosfatasa, CCR7, un receptor de quimiocines conegut per mediar el tràfic de cèl·lules T cap a òrgans limfoides secundaris, i CD28 i CD27, ambdós receptors coestimuladors molt implicats en l'activació de cèl·lules T, són tots marcadors utilitzats tradicionalment per identificar subconjunts de cèl·lules T funcionals J1{ {53}},1l. Volíem investigar fins a quin punt la distribució d'aquests subconjunts a la sang difereix de la distribució al teixit renal. Com era d'esperar, els subconjunts de cèl·lules T CD8 més grans detectats a la circulació (és a dir, els referits a Més o menys al 5 per cent de la població total) eren els que tenien un CD45RA més CCR7 més CD28 més CD27 plus (cèl·lules T ingènues o TN, ( mediana) 13 per cent ), CD45RA-CCR7 més CD28 més CD27 plus (cèl·lules T de memòria central o TcM, 6 per cent), CD45RA-CCR7-CD28 més CD27 més (TEv1,30 per cent ), CD45RA-CCR7-CD28 més CD27-(Tau2,10 per cent ), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 per cent ) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 per cent) i CD45RA més CCR7-CD28-CD{27-(TEMRA ,10 per cent )fenotip. Al teixit sa, gairebé no es van detectar cèl·lules T CD8 (0,6 per cent) amb un fenotip TN i només algunes (0,8 per cent) mostraven un fenotip Tax. En canvi, les cèl·lules T CD8 detectades al teixit renal sa estaven compostes per un considerable TEv1-(22%), TEM2-(12%), Tpx{3-(18%),TEx{ {65}} (23 per cent) i poblacions de cèl·lules T TEyRA (11 per cent) (figura ld i figura S4). Quan es miren les cèl·lules T CD4 a la sang, les poblacions més grans eren les que expressaven un Ty-(35 per cent), TcM- (25 per cent), TEMl- (16 per cent), TFM2-(9 per cent) i una població amb un fenotip CD45RAtCCR7-CD28 més CD27* no especificat (0,4 per cent) (figura 1d i figura S4). En el teixit renal sa, poques cèl·lules T CD4 expressaven un TN- (3 per cent) o un TcM -(3 per cent) fenotip. En canvi, es va detectar un nombre substancial de cèl·lules amb un fenotip TEM1-(22 per cent), TEM2- (40 per cent) o TEM4 (14 per cent) al teixit sa (figura ld i figura S4). . En conclusió, la distribució dels subconjunts de cèl·lules T CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}definits CD8 i CD4 difereix substancialment entre la sang i el teixit renal sa.

3.3. Les cèl·lules T CD8 i CD4 del teixit renal humà sa comprenen més sovint cèl·lules que ciclen activamentA continuació, es va investigar si hi ha diferències en l'expressió de marcadors típics d'un perfil efector-memòria citotòxic, entre les poblacions de cèl·lules T CD8 i CD4 a la sang i el teixit renal. Primer, vam analitzar l'expressió dels factors de transcripció T-box T-bet i eomeso-dermin (Eomes). Aquests reguladors transcripcionals estan directament implicats en la generació de cèl·lules efectores de fase aguda, induint l'expressió de molècules com l'interferó-y i el granzima B, i en la generació de respostes de memòria secundàries. Com era d'esperar, l'expressió de T-bet era freqüent entre les cèl·lules T CD8 circulatòries (54 per cent), mentre que les cèl·lules T CD4 circulatòries rarament expressaven aquest factor de transcripció (13 per cent). Curiosament, per a les cèl·lules T CD4, l'expressió T-bet va ser significativament més alta entre les cèl·lules T detectades en teixit renal sa que a la circulació (53 per cent enfront del 13 per cent). També es va detectar amb freqüència alguna expressió entre les cèl·lules T CD8 circulatòries (59 per cent), mentre que de nou era rara entre les cèl·lules T CD4 circulatòries (15 per cent). Tanmateix, l'expressió d'Eomes era més freqüent entre les cèl·lules T CD4 del teixit renal (32 per cent) que a la sang (figura 2a, b).

A continuació, es va investigar l'expressió del granzima B, una serina proteasa que se sap que media l'apoptosi després de la injecció al citoplasma per les cèl·lules T citotòxiques. D'acord amb els informes anteriors, l'expressió T-bet i granzyme B es va detectar en un nombre substancial a les cèl·lules T CD8 circulants (28 per cent). Tanmateix, la seva expressió era rara entre les cèl·lules T CD4 circulants (1 per cent), per a les cèl·lules T CD8, l'expressió del granzim B era similar al teixit renal i a les poblacions circulants (28 per cent ys. 23 per cent) (figura 2c). Curiosament, les freqüències d'expressió T-bet i Eomes més altes detectades a les cèl·lules T CD4 del ronyó no es corresponien amb una freqüència d'expressió més alta del granzima B en aquest compartiment (5 per cent). A continuació, vam analitzar l'expressió de KLRGl, un receptor coinhibitori conegut que s'expressa predominantment per cèl·lules efectores de fase aguda citotòxica i cèl·lules efectores de memòria. 10 per cent). No es van trobar diferències entre els compartiments anatòmics en l'expressió de KLRG1l per a les cèl·lules T CD8 o CD4. Finalment, vam investigar l'expressió de Ki-67, un marcador que denota cèl·lules en cicle actiu. D'acord amb les observacions anteriors, l'expressió de Ki-67 entre les cèl·lules T CD8 i CD4 circulants era rara (1 per cent i 2 per cent, respectivament). Curiosament, entre les cèl·lules T CD8, però particularment entre les cèl·lules T CD4, l'expressió Ki -67 es va detectar significativament més sovint a les cèl·lules T del teixit renal (3 per cent i 11 per cent, respectivament) (figura 2e). En conclusió, es van detectar cèl·lules T CD4 en teixit renal humà sa, però no cèl·lules T CD8 en aquest compartiment, que s'expressen amb més freqüència T-bet i Homes. Tanmateix, això no es va traduir en una expressió més freqüent del granzima B per les cèl·lules T CD4 del ronyó. A més, tot i que el nombre total de cèl·lules ciclades eren baixes, el teixit renal contenia cèl·lules T CD8 i CD4 que circulaven de manera significativament més activa que la circulació.

3.4. Les cèl·lules T CD8 i CD4 del teixit renal sa són gairebé totes les posicions CXCR3-A continuació, vam buscar diferències en l'expressió d'altres marcadors, típiques en poblacions circulants d'ells de memòria no citotòxica immediatament, com es va mostrar anteriorment per a poblacions de cèl·lules T circulants. Primer vam analitzar l'expressió de IL-7R, expressada principalment en cèl·lules de memòria ingènues i diferenciades primerencament de la circulació, on està implicada en el manteniment de la proliferació homeostàtica [10,12,13]. A la sang perifèrica, IL-7Ra es va expressar amb freqüència per les cèl·lules T CD8 (84 per cent) i les cèl·lules T CD4 (98 per cent). Les cèl·lules T CD8 i CD4 del teixit renal sa van expressar aquest marcador significativament menys sovint que les cèl·lules T circulants (71 per cent i 76 per cent, respectivament) (figura 2f).

A continuació, vam investigar l'expressió de diversos altres receptors de quimiocines Curiosament, CXCR3, un receptor de quimiocines implicat en el tràfic de cèl·lules T cap a teixits inflamats [14-17], es va expressar per un nombre excessivament gran de cèl·lules T CD8 i CD4 al teixit renal (99). per cent i 91 per cent, respectivament), i significativament menys sovint per les cèl·lules T circulants (58 per cent i 26 per cent, respectivament) (figura 2g). Finalment, vam determinar l'expressió de CXCR6, que se sap que està implicada en la formació de poblacions TRM [18-22]. Mentre que CXCR6 només es va expressar per una petita població de cèl·lules T CD8 circulants (16 per cent), i pràcticament no per cèl·lules T CD4 circulants. una proporció significativament més gran de cèl·lules T CD8 i CD4 al teixit renal va expressar aquesta molècula (40 per cent i 40 per cent, respectivament) (figura 2h). En conclusió, els marcadors normalment associats a un estat no diferenciat immediatament en la circulació, probablement-7Ra, CCR7, CD28 i CD27, s'expressaven significativament menys sovint per les cèl·lules CD8 i T del ronyó en comparació amb les de la sang. En canvi, les cèl·lules T del ronyó expressaven més sovint CXCR6 i gairebé sempre expressaven CXCR3.

3.5. Les diferències en el fenotip entre cèl·lules T de ronyó sans i al·lograft són mínimesA continuació, vam voler investigar si aquestes troballes es van mantenir dempeus al teixit d'al·loempelts de ronyó trasplantats que es van obtenir per a diverses indicacions clíniques (Taula 1).Pel que fa al nombre de cèl·lules T CD8 i CD4 en teixit sa i al·loempelt, no es van observar diferències (figura 3a). Tanmateix, vam notar una tendència no significativa cap a més cèl·lules CD4T i menys cèl·lules CD8T al teixit sa que al teixit al·lograft (Figura 3b). A més, en mirar els subconjunts definits de CD69/CD103expression i CD45RA/CCR7/CD28/CD27-, no hi ha diferències en la distribució de CD69/CD103- o CD45RA/CCR7/CD28/CD27- es van observar subconjunts definits, independentment del fenotip CD8/CD4 (figura 3d i figura S5). Quan es van examinar les freqüències d'expressió dels marcadors més típics de les cèl·lules T circulants citotòxiques, no vam trobar diferències en l'expressió de T-bet, KLRG1 o granzyme B entre cèl·lules T de ronyó o al·lograft sans (figura 3a, gh). Vam trobar que l'expressió d'Eomes es va veure amb menys freqüència a les cèl·lules T CD4 del teixit al·lograft que a les cèl·lules T del teixit sa (figura 3f). No es van observar diferències en l'expressió dels altres marcadors. (Figura 3-l i figura S5b-d). En conclusió, a part d'una menor freqüència d'expressió d'Eomes entre les cèl·lules T CD4 d'al·lograft, les poblacions cel·lulars no difereixen entre les poblacions d'estudi.

3.6. Les cèl·lules CD69-CD{103-T del teixit renal són diferents de les cèl·lules circulantsAtesa la composició fenotípica similar de les cèl·lules T CD8 i CD4 que es troben al teixit renal sa i al teixit d'al·loempelt renal, vam reunir les dades dels dos grups d'estudi per examinar més a fons les característiques d'aquestes cèl·lules segons l'expressió CD69 i CD103. Com que les cèl·lules CD69-CD103 plus es van detectar sempre en freqüències molt baixes(<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Primer, vam investigar les diferències en aquests subconjunts segons la coexpressió de CD69/CD103 en poblacions de cèl·lules T renals (figura 4 i figura S6). Curiosament, tant per a les cèl·lules T CD8 com per a les CD4, es van observar diferències substancials en la distribució dels subconjunts definits CD45RA/CCR7/CD28/CD27-entre CD69-CD{103-, CD69 més CD{{10} {14}}i subconjunts CD69*CD103*. Per a les cèl·lules T CD8, les cèl·lules CD69-CD{103- contenien una població important de cèl·lules TeyRA (21 per cent) que era molt més petita entre els subconjunts CD69 més CD{103- i CD69 més CD103 (5,8 En canvi, aquestes últimes poblacions contenien subpoblacions TEy3 (13 per cent, 30 per cent i 32 per cent, respectivament) i TEy4 (8 per cent, 19 per cent i 33 per cent, respectivament) molt més grans. Per a les cèl·lules T CD4, es van observar poques cèl·lules TEyRA entre els subconjunts CD69-CD103-, CD69*CD103- i CD69 més CD103* (2,6 per cent, 0 per cent i 1,7 per cent, respectivament). En canvi, aquestes cèl·lules contenien grans subpoblacions de TFw1 (26 per cent, 24 per cent, i 10 per cent, respectivament) i TEy2 ells (30 per cent, 46 per cent i 27 per cent, respectivament). Entre CD69 més CD103-i particularment entre les cèl·lules CD69 * CD103 *, es va observar una subpoblació TEM4 molt més gran (6 per cent, 11 per cent i 34 per cent, respectivament).

Tenint en compte aquestes distincions i l'observació anterior que les poblacions de cèl·lules T renals amb prou feines comprenien cèl·lules TN i TcM, vam investigar més a fons les cèl·lules CD{69-CD{103-es trobades al teixit renal per determinar fins a quin punt eren aquestes cèl·lules. no només les cèl·lules circulants que passen per la circulació renal. Per fer-ho, hem comparat aquestes cèl·lules amb cèl·lules circulants. Les cèl·lules CD69-CD103~ del teixit renal diferien significativament de les de la circulació: T-bet, Ki{-67 i CXCR3 s'expressaven més sovint per les cèl·lules T renals, independentment del fenotip CD8/CD4 (figura 5a-c). En canvi, IL-7R, CCR7, CD28 i CD27 es van expressar amb una freqüència significativament menor per les cèl·lules T del ronyó CD{{{69-CD{103-, independentment del fenotip CD8/CD4 (figura 5d-). g). Les cèl·lules T CD{69-CD{103-CD4 del teixit renal expressaven KLRG1 significativament més sovint que a la sang i les cèl·lules T CD{69-CD{103-CD8 del teixit renal expressaven Eomes significativament més sovint que en sang.

A continuació, hem volgut veure com la coexpressió CD69 i CD103 afectava els marcadors de potencial funcional. Primer, vam analitzar els marcadors associats al potencial citotòxic. Tot i que es van observar diferències entre subpoblacions individuals, no es van observar patrons conseqüents per a T-bet i Eomes a les cèl·lules T CD8 quan es van coexpressar CD69 o CD103 (figura 6a, b). En canvi, a les cèl·lules T CD4, aquests factors de transcripció van augmentar juntament amb Coexpressió CD69 i CD103 (figura 6a, b). En mirar KLRG1, ens vam adonar que per a les cèl·lules T CD8, l'expressió KLRG1 va disminuir juntament amb la coexpressió CD69/CD103. Per a les cèl·lules T CD4 es va observar una tendència similar. Tanmateix, aquí només les cèl·lules CD{69-CD{103- expressaven KLRG1 a una freqüència més alta que les cèl·lules CD69 més CD{103- i CD69 més CD103* (figura 6c). Les freqüències d'expressió del granzima B també van disminuir juntament amb els marcadors de residència dels teixits, sent la seva freqüència d'expressió més baixa entre les cèl·lules CD69 més CD103 *, tant a les cèl·lules T CD8 com a CD4 (figura 6d). L'expressió de Ki-67, que era més alta entre les cèl·lules T renals en comparació amb les cèl·lules T a la sang, no va variar segons la coexpressió CD69 o CD103 (figura 6e).

A continuació, vam investigar marcadors normalment associats a un perfil de memòria no citotòxic segons la coexpressió CD69/CD103. L'expressió d'IL-7Ra, CCR7 i CD28 va ser més alta a les poblacions de CD{{69-CD{{103-, amb una tendència a definir l'expressió juntament amb la coexpressió de CD69/CD103 (figura 6f-h). ). A continuació, vam mirar l'expressió de CXCR3 i CXCR6. Ambdós receptors de quimiocines es van expressar amb més freqüència per cèl·lules CD69tCD103t, independentment del fenotip CD8/CD4, i van mostrar una tendència a l'alça amb la coexpressió de CD69/CD103. Només per a CXCR6, aquesta tendència va ser estadísticament significativa, afectant tant CD8 com CD4 Tells (figura 6j, k). En conclusió, les cèl·lules CD69-CD{103- del teixit renal difereixen substancialment de les cèl·lules de la circulació i poden afectar a una altra població de TBv no marcada per l'expressió CD69 o CD103. L'únic marcador que va diferir de manera consistent, independentment del fenotip CD8/CD4, en termes de coexpressió CD69 i CD103, va ser CXCR6.

3.7. Les cèl·lules T del teixit renal produeixen més sovint interferó que les cèl·lules T a la sangFinalment, vam investigar la capacitat de producció de citocines per les poblacions de cèl·lules T definides per CD8/CD4-al teixit renal. En primer lloc, vam comparar la producció d'interferó-y (IFNy), factor de necrosi tumoral (TNF), interleucina-2 (IL{-2), factor estimulant de colònies de granulòcits i macròfags (GM-CSF) i IL-17 mitjançant l'estimulació de les poblacions de cèl·lules T de CD8/CD4-que es troben a la sang a les del teixit renal sa (figura 7a-e). Curiosament, només IFNy es va expressar constantment per una proporció més gran de cèl·lules T al teixit renal sa, en comparació amb les cèl·lules T a la sang, independentment del fenotip CD8/CD4 (figura 7a). També es van notar diferències a nivell de subconjunt individual. Concretament, el TNF i el GM-CSF van ser produïts amb més freqüència per les cèl·lules T CD4 al teixit renal (figura 7b.c). Pel que fa a la polifuncionalitat (és a dir, el nombre de citocines produïdes simultàniament), es va trobar que les cèl·lules T CD4 del teixit renal eren més polifuncionals que les cèl·lules CD4 a la sang (Figura 7f).

A continuació, vam analitzar les diferències en la capacitat de producció de citocines entre les cèl·lules T estimulades del teixit sa i al·loempelt. No es van detectar diferències en la producció de citocines individuals ni en un nombre de citocines produïdes simultàniament entre cèl·lules T de teixit renal sa o al·lograft (figura S7). Com que CD69 s'expressa amb l'estimulació de les cèl·lules T, només vam estudiar la diferència entre les cèl·lules T CD103-negatives i CD103-que expressen CD4 i CD8 (figura 7g-). En comparar les cèl·lules T CD4 i CD8 que expressen CD103 amb cèl·lules que no expressen CD103 al teixit renal, vam observar que les cèl·lules CD8 i CD4 CD103 expressaven més IFNy que les cèl·lules CD103- (figura 7g). A més, tot i que les cèl·lules productores d'IL-1ZA eren baixes entre les cèl·lules T CD103 més CD8 i CD4 del teixit renal, es van trobar constantment amb més freqüència en aquesta població en comparació amb la població CD103-. En conclusió, més cèl·lules T' del teixit renal van produir IFNy en comparació amb les cèl·lules T circulants, independentment del fenotip CD8/CD4. De fet, el percentatge més alt de cèl·lules productores d'IFNy es va trobar entre les cèl·lules T derivades del ronyó que expressaven CD103-CD4 i CD8. A més, les cèl·lules T dels al·loempelts de ronyó no difereixen de les del teixit renal sa pel que fa a aquests paràmetres.

4. Discussió

En l'estudi actual hem abordat la diversitat de subconjunts de cèl·lules T, segons l'expressió de CD8 i CD4, i els marcadors de residència en teixits, CD69 i CD103, en els ronyons humans i en comparació amb aquests amb la sang. De fet, es van detectar un nombre substancial de cèl·lules T CD8 i CD4 al teixit renal. A més, aquestes cèl·lules T als ronyons contenien un nombre considerable de cèl·lules CD69*CD103-. També es van detectar cèl·lules CD69 més CD103 més, però predominantment entre les cèl·lules T CD8 i pràcticament no existien entre les cèl·lules T CD4. Una troballa similar es referia a la TRM pulmonar anteriorment [23]. Com era d'esperar, aquestes poblacions que expressaven CD69 i CD103-estaven gairebé absents de la circulació. Una diferència sorprenent en comparar les cèl·lules T del ronyó amb les de la sang, es refereix a una distribució diferent dels subconjunts definits tradicionals de CD45RA/CCR7/CD28/CD27-. Curiosament, l'expressió de CD28 no s'expressava més sovint quan les cèl·lules T coexpressaven CD69 sols o en combinació amb CD103. Teòricament, això hauria de fer que aquestes poblacions siguin menys susceptibles als senyals coestimuladors de CD80 i CD86. Altres diferències es refereixen a una freqüència d'expressió més alta de CXCR3, CXCR6 i Ki-67. A més, les cèl·lules T renals contenien més sovint cèl·lules productores d'IFNy i sovint eren polifuncionals. De fet, dins del ronyó, CD103 més Tpys contenien més cèl·lules productores d'IFN que les seves homòlegs CD103-negatius. A més, les cèl·lules CD103T produïen amb més freqüència IL-17, tot i que es tractava d'una població modesta.

CISTANCHE MILLORARÀ LA INFECCIÓ RENAL/RENAL

Pel que fa a l'expressió més freqüent de CXCR3 per les cèl·lules T del ronyó CD8 i CD4, anteriorment es va demostrar que l'eix CXCR3/CXCL10 estava implicat en la formació de poblacions de TpM a la pell, el fetge i el teixit limfoide [24-28]. A més, està implicat en el tràfic d'epiteli estressat i inflamació en un sentit general [14-17]. Tenint en compte les altes freqüències de CXCR3 entre aquestes cèl·lules T en el teixit renal sa, CXCR3 sembla estar implicat també en l'homeòstasi de TRM en el teixit renal i pot no implicar necessàriament inflamació o senyals de perill per fer-ho. Pel que fa a CXCR6, l'eix CXCR6/CXCL16 ja s'ha demostrat que és essencial per al tràfic de Tpst a diferents compartiments com els pulmons, la pell, el fetge i el cervell, i pot ser un mecanisme universal essencial per guiar i retenir TRM cap i en teixits, també pel que fa a TRM en teixit renal humà [18-22].

Farber i els seus companys de feina han caracteritzat i comparat àmpliament les poblacions de CD8 i CD4 TRM que resideixen en diferents tipus de teixits humans derivats de donants d'òrgans. Van descriure com les poblacions de TRM al pulmó, la melsa, l'intestí prim i diversos teixits limfoides secundaris difereixen pel que fa al transcriptoma, però també a l'expressió de diverses proteïnes, incloses les citocines, investigades en l'estudi actual [29-31. Tanmateix, aquestes investigacions no incloïen poblacions de TRM al ronyó humà i dades sobre això

el tema és escàs. Prèviament vam demostrar que les cèl·lules T CD8 dirigides a les proteïnes BK VP1 i LTAG del poliomavirus, derivades d'un virus que té un fort tropisme per a les cèl·lules epitelials renals, es poden detectar als ronyons d'al·lograft. Aquestes cèl·lules T específiques del virus van expressar CD69 i CD103 en major quantitat que les seves homòlegs que es troben a la circulació dels mateixos pacients. A més, aquestes cèl·lules T generalment expressaven un fenotip CD45RA-CD27-granzima B negatiu[5]. Més tard, altres també han informat sobre poblacions de TRM en teixit renal humà obtingut a partir de nefrectomies de trasplantament. En aquesta publicació, els autors informen que les cèl·lules T d'aquests teixits es refereixen principalment a les cèl·lules T CD8 [321. En canvi, vam trobar que les cèl·lules T CD4, de fet, comprenien el subconjunt de cèl·lules T més gran. Tanmateix, també vam trobar que l'equilibri es va desplaçar, encara que no de manera significativa, cap a un nombre més gran de cèl·lules T CD8 al teixit d'al·loempelt en comparació amb el teixit renal sa. Com a tal, aquesta discrepància podria ser explicada per un grup d'estudi diferent, i pot ser que en salut, la defensa immunològica estigui més centrada en les amenaces extracel·lulars, com els bacteris, versus les amenaces més intracel·lulars, com els virus i el càncer en els hostes immunodeprimits. No hem trobat altres diferències en els marcadors estudiats, entre cèl·lules T renals sanes i al·loempelt. Tanmateix, s'haurien d'utilitzar més investigacions, utilitzant tècniques amb una visió més àmplia dels transcriptomes, com la seqüenciació d'ARN, o el proteoma, com l'espectrometria de masses, per establir si aquest és realment el cas.

A més, de Leur et al. descriure com el TRM als ronyons expressava freqüentment el granzima B, mentre que només vam detectar quantitats baixes de granzima B tant en teixit renal sa com en al·lograft [32]. Tanmateix, vam detectar cèl·lules T substancials que expressen T-bet i Eomes al teixit renal, que en les poblacions de cèl·lules T circulants, normalment s'associa amb una expressió més alta del granzima B [10]. Tot i que això últim pot no sorprendre, atès que l'expressió del granzim B també és induïda directament per T-bet [33, 34], aquesta associació no va ser evident entre les cèl·lules T renals en l'estudi actual. Com nosaltres i altres hem demostrat que també els TRM derivats de pulmons, cervells i pells humans [25,26,3536], així com els MAIT ælls 【6,7】residents en teixits derivats del ronyó són baixos en la seva granzima B. contingut, tot i que sovint expressa quantitats substancials de T-bet i Eomes, aquest podria ser un tret comú de TkM (humà). A més, es va veure que l'expressió del granzima B del TRM pulmonar es regulava ràpidament després de l'estimulació [35l, cosa que suggereix que això també podria ocórrer en altres TeM. Aquí, els autors van plantejar la hipòtesi que aquesta "citotoxicitat oculta serveix per protegir la integritat estructural dels teixits del dany de les cèl·lules T citotòxiques".

En conclusió, mostrem que les cèl·lules T al teixit renal estan presents en nombre substancial i comprenen poblacions que sovint expressen CD69 plus i CD103 plus, molècules per les quals les cèl·lules T s'adhereixen i persisteixen en els teixits. No obstant això, les cèl·lules T CD69-CD{103- del teixit renal semblen ser diferents de les cèl·lules T circulants i poden afectar a una altra població TiM diferent, possiblement persistint als ronyons per altres mecanismes que s'han de descobrir. Una altra opció pot ser que aquestes cèl·lules CD69-CD{103-T concerneixen a una població que només ha sortit recentment de la circulació, i que només hagi adquirit nous trets fenotípics de manera transitòria a causa d'una interacció amb el microambient renal. Es necessiten més investigacions sobre aquesta població per dilucidar aquestes possibilitats. A més. Les cèl·lules T del ronyó CD8 i CD4 sovint estaven en cicle actiu i expressaven CXCR6 amb més freqüència. A més, les poblacions CD8 i CD4 van desplaçar una expressió especialment alta de CXCR3, implicant fortament aquests receptors de quimiocines, així com CXCR6 en l'acumulació i la persistència de TRM en els ronyons humans. Per tant, calen més investigacions per millorar la nostra imatge de les poblacions de Tpv al ronyó humà. No obstant això, les troballes que es presenten aquí constitueixen un primer pas sòlid cap a una caracterització més detallada de les poblacions de cèl·lules T al teixit renal i el seu paper en la salut i la malaltia.