caLlenguatge
Casa / Coneixement / Contingut

Coneixement

Miceli de cultiu de Ceriporia Lacerata com a nou material microbià anti-envelliment per a aplicació cosmecèutica

Mar 27, 2023

Resum:Cura de la pellés fonamental per prevenir l'envelliment i els problemes de la pell, que és difícil de recuperar si avança. No obstant això, el desenvolupament d'eficaçsolucions anti-envellimentencara està a l'horitzó. Aquest estudi pretenia avaluar l'eficiència funcional deCistanchelaceratsubstància exofarmacèutica (CLEPS) en vista del seu ús en cosmètics innovadors per a la cura de la pell. Es va trobar que CLEPS no tenia citotoxicitat contra fibroblasts dèrmics humans normals i cèl·lules de melanoma B16 en un ampli rang de concentracions de 0,05-7 mg/mL. Aixòva mostrar un efecte blanquejador inhibint la síntesi de melanina comparable al compost de referència respectiu(arbutina). En particular, CLEPS no només va augmentar substancialment el col·lagen (65,4 per cent) i la síntesi de filagrina (36 per cent), sinó que també va inhibir significativament l'activitat de la col·lagenasa (93,4 per cent), cosa que suggereix que CLEPS podriaprevenir danys a la barrera de la pelloarrugues de la pell. A més, va mostrar un excel·lentantiinflamatòriaefecte i efecte de cicatrització de ferides. En general, CLEPS va exposarexcepcionalefectes anti-envelliment a les cèl·lules de la pell humana, designant com a potencial naturalingredient cosmecèutic.

Paraules clau:Cistanchelacerata; anti edat; antiinflamación; anti-oxidació; anti-collagenasa; regulació de la filagrina;blanqueig; cicatrització de ferides

Skincare Cistanche (2)

Feu clic aquí per saber com funciona Cistanche per a la cura de la pell

1. Introducció

Entre altres òrgans, la pell humana és una interfície d'avantguarda constantment exposada a estímuls externs nocius, com ara reaccions metabòliques generals, cosmètics i irradiació ultraviolada (UV). Aquests factors donen lloc a subproductes bioquímics no desitjats, incloses les espècies reactives de l'oxigen (ROS), les metaloproteinases de la matriu (MMP) i els productes finals de glicació avançada (AGE), que poden provocar l'envelliment de la pell, incloses les arrugues, la pigmentació i la pèrdua del to de la pell.1,2]. Les ROS, molècules perilloses d'oxigen com a transmissor de senyal fisiològic pleiotròpic, indueixen principalment la reticulació del col·lagen i l'elastina per induir arrugues i reduir la recuperació de la pell, que es consideren el principal motor de l'envelliment causat pels raigs UV i la contaminació.3]. Les MMP són enzims activats per l'exposició UV o la inflamació, que contribueixen a la degradació del col·lagen alhora que inhibeixen la formació de nou col·lagen.1]. La formació d'AGE és el resultat de la reacció de la glucosa amb proteïnes, inclòs el col·lagen de la pell, que pot contribuir a la pèrdua d'elasticitat, arrugues, inflamació, inhibició del creixement cel·lular de la pell i envelliment accelerat.2]. Atès que l'estrès oxidatiu és un dels factors i vies metabòliques més associats a l'envelliment cel·lular, el consum d'aliments funcionals i cosmètics funcionals amb activitat antioxidant està augmentant de manera significativa. Per tant, els antioxidants poden ser beneficiosos per al cos humà neutralitzant directament o indirectament les ROS, mitjançant la regulació de les vies metabòliques i l'expressió gènica com a principals mecanismes d'activació cel·lular. Els metabòlits naturals derivats de fonts microbianes s'han utilitzat en una varietat d'aplicacions com a font nutricional i com a agent de cura de la pell.4]. Entre ells, els metabòlits derivats dels fongs contenen ingredients biològicament actius de considerable valor comercial com oligosacàrids, exopolisacàrids (EPS), enzims, pèptids, vitamines i biosurfactants. Aquests metabòlits s'utilitzen àmpliament com a matèries primeres principals per a productes farmacèutics, aliments funcionals i productes cosmètics (5-9). Amb milers d'antioxidants i propietats antiinflamatòries, s'han utilitzat àmpliament per combatre l'envelliment millorant la pell. defenses naturals, restaurant l'elasticitat de la pell, augmentant el contingut d'humitat, afavorint la síntesi de col·lagen i amb efectes blanquejants de la pell (4,5) A més, aquests compostos que substitueixen els ingredients químics tradicionals, s'apliquen en diversos productes cosmètics utilitzats per millorar la salut i la bellesa de la pell. la humanitat d'una manera segura i desintoxicant. En particular, la biocompatibilitat, la no toxicitat i la funcionalitat única de l'EPS fúngic s'han utilitzat àmpliament a la indústria cosmètica (4). Per exemple, compostos metabòlics com l'esquizofil·là, un polisacàrid de p{ El {7}},3P-glucan amb ramificació p{-1,6, extret de Schizophyllum commune, és conegut per ajudar amb els efectes antiinflamatoris de la pell i de protecció UV (101. S'ha aïllat el filtrat de fermentació de Galactomyces (GFF) de Galactomycescandidum per estudiar els efectes cosmecèutics sobre la reducció dels porus de la pell facial, la pigmentació de la pell i alleujar l'estrès oxidatiu, mentre que els mecanismes d'acció subjacents a l'EPS de GFF juntament amb la seva informació composta encara no s'han identificat (11). El lacerat de Cistanche és un tipus de fong filamentos blanc-putrefactiu que juga un paper important en la bioremediació mitjançant la descomposició de la cel·lulosa i la lignina (12, 13) L'eficàcia bioactiva del miceli C. lacerata (CLMculture s'ha estudiat per controlar els nivells d'hiperglucèmia (14) ). , la secreció d'insulina mitjançant efectes citoprotectors (15) i la senyalització d'insulina mitjançant l'activació de la proteïna cinasa activada per AMP (AMPK) i el transportador de glucosa tipus 4 (GLUT4) (16, 17. Tanmateix, l'efecte farmacològic de CLM sobre l'antioxidació i anti - encara no es coneix l'envelliment.

Skincare Cistanche (24)

El culteC. lacerataestà compost per polipors microscòpics; per tant, sembla molsa blanca (figura1a). Durant el procés de cultiu líquid, es generen diversos metabòlits secundaris, per exemple, exometabolits, depenent de les condicions ambientals (figura1b). Tanmateix, no hi ha informes de C. lacerate o CLM sobre efectes associats a la cura de la pell. Per tant, aquest estudi va tenir com a objectiu investigar els efectes antioxidants, de cicatrització de ferides, de millora de les arrugues, d'humectació i de blanquejament del CLM en el mecanisme anti-envelliment de les cèl·lules de la pell. Segons el que sabem, aquest estudi és el primer informe que proposa una nova ruta per a la cura de la pell a nivell cel·lular basada en el mecanisme anti-envelliment utilitzant ingredients antidiabètics derivats del cultiu de CLM, un microorganisme emergent.14–17]. 

Skincare Cistanche

Skincare Cistanche

Figura 1. Mètode de fabricació verd deCistanche laceratasubstància exofarmacèutica (CLEPS), inclòs el cultiu sòlid

(a) i processos aigües avall (b) com ara el precultiu (i), el cultiu principal (i) i la filtració (i).


2. Materials i Mètodes
2.1. Preparació de substàncies exofarmacèutiques Cistanche Lacerata
La soca utilitzada en aquest experiment es va utilitzar inoculant CLM (FugenCellTech,Sangju, Corea) en agar dextrosa de patata (PDA, Difco. Co., Sparks, MD, EUA) medi
i cultiu als 25◦C durant 9 dies. El brou de cultiu deC. laceratael miceli era precultivat en un brou de dextrosa de patata durant 10 dies. Un cop finalitzat el precultiu, el medi de cultiu de miceli es va barrejar amb glucosa (12,5 g/L), midó de patata (2,5 g/L), soja desgreixada (5 g/L) i èsters de glicerina d'àcids grassos d'oli vegetal ( 0,12 g/L) comun anti-escumaagent, després d'una incubació addicional durant 11 dies a 23◦C. En prendrecentrifugacióper separar els precipitats, el sobrenedant clar del medi de cultiu deEl CLM es va ultrafiltrar amb una tècnica d'ultrafiltració utilitzant una membrana de polisulfonaamb 3,6~8,0 m2(pes molecular tallat: 30 ~ 100 kDa). La solució d'estoc (100 per cent) deCLEPS es va dissoldre a la solució de cultiu i es va utilitzar per a totes les anàlisis biològiques d'aquestatreballar, sense afegir dissolvents, codisolvents, reactius o productes químics, la qual cosa confirmaingredients cosmètics verds biosegurs i d'alta qualitat.


2.2. Mesura de l'activitat antioxidant2.2.1. 2,2-Difenil-1-picril-hidrazil-hidrat (DPPH)

Assaig d'activitat d'eliminació La capacitat d'eliminació de radicals lliures del CLEPS es va provar mitjançant un assaig fotomètric d'eliminació de radicals DPPH segons la metodologia descrita per Choi et al. (18] iKedare et al. (19. El CLEPS es va barrejar amb DPPH metanòlic de 90 mM per formar concentracions finals de solució de 0, 5, 1 i 5 mg/mL en {{7}). }plaques de pou, que es van incubar durant 30 min a 25 graus i l'absorbància (OD) es va llegir en un lector de microplaques (Multiskan GOThermofisher Scientific, Waltham, MA, EUA) a una longitud d'ona de 517 nm. Tres experiments independents Es va fer servir àcid ascòrbic (AA, 1 mg/mL) com a control positiu. El percentatge d'inhibició de DPPH es va calcular seguint la fórmula següent: percentatge d'eliminació de DPPH=control A0 - mostra A1/control A0] x 100, on A1 indica l'absorbància de la mostra, mentre que A0 indica l'absorbància del control (solució metanòlica de DPPH).

Skincare Cistanche (15)

2.2.2. 2,2-Azinobis-(3-àcid etilbenzotiazolina-sulfònic) (ABTS)

Activitat d'eliminació de radicals La determinació de l'activitat d'eliminació de radicals lliures de les solucions CLEPS es va aconseguir mitjançant un assaig de decoloració de cations radicals ABTS segons una metodologia descrita per bKedare et al. (19). La generació de radicals catiònics ABTS es va aconseguir combinant 10mg d'ABTS i 2 mg de persulfat de potassi en aigua. La solució es va col·locar a la foscor a 25 graus durant unes 12 h abans de l'ús. Solució ABTS (1 mL) es va diluir amb 60 mL de metanol, després el CLEPS es va barrejar amb ABTS metanòlic 90 uM per formar concentracions finals de solució de 0,5, 1 i 5 mg/ml en plaques 96-pous. Les plaques es van incubar a25 ◦C durant 30 min i la DO es va mesurar a una longitud d'ona de 734 nm mitjançant un MultiskanInstrument GO. Es van realitzar tres experiments independents. Àcid ascòrbic (AA,1 mg/ml) es va utilitzar com a control positiu. El percentatge inhibitori d'ABTS es va calcular perseguint la fórmula següent:Percentatge d'eliminació d'ABTS {{0}} [control A0− mostra A1/control A0]× 100 on indica A1l'absorbància de la mostra, mentre que A0 indica l'absorbància del control (solució metanòlicad'ABTS).


2.3. Assaig de viabilitat cel·lular

Per avaluar la viabilitat cel·lular de CLEPS a les cèl·lules de la pell, els fibroblasts dèrmics humans(NHDF) (ATCC) es van cultivar en DMEM (alta glucosa) (WelGENE, KR) flexible

muntat amb un 10 per cent de sèrum fetal boví (FBS) (WelGENE, Gyeongsan, Corea) i un 1 per cent de penicil·lina/estreptomicina (WelGENE, Gyeongsan, Corea) a 37 anys◦C en un 5 per cent de CO2 incubadora (UP50H,Forma Scientific, Marietta, OH, EUA). Les cèl·lules es van incubar a les 7× 104cèl·lules/puix dinsun 12-pouplaca. Després de confirmar l'adhesió cel·lular, es va transferir a un lloc sense sèrummedi i les solucions es van tractar a una concentració de treball a cada pou durant 72 h. La solució de bromur de tetrazoli blau de tiazolil (MTT) (Sigma, St. Louis, MO, EUA) auna concentracióde 100µEs va afegir g/mL a cada pou i es va incubar a 37◦C, 5 per cent de CO2 per2 h. A continuació, es va retirar tot el medi de cultiu i 500µL de DMSO (Duchefa Biochemicals, Haarlem, Països Baixos) es va afegir a cada pou. L'absorbància a 570 nm va sermesurat amb un lector ELISA (Epoch, Bio-tek INC, Winooski, VT, EUA). El cultiu cel·lulares va utilitzar el medi com a control negatiu (control (-)).


2.4. Nivell d'expressió de Filaggrin

Per mostrar com CLEPS influeix en la funció de barrera de la pell, es va mesurar el nivell d'expressió d'ARNm de la filagrina mitjançant una RT-PCR. La cèl·lula HaCaT es va cultivar a 2× 104 cèl·lules/pou en una placa de 24-pous utilitzant medi DMEM que conté un 10% de FBS, un 1% de penicil·lina i un 1% d'estreptomicina, i després es cultiva a 37%◦C, 5 per cent de CO2 incubadora durant 24 h. Després de l'eliminació del sobrenedant, cada mostra es va afegir en medi DMEM excloent FBS durant 24 h a 37◦C, 5 per cent de CO2 incubadora. Després de la incubació, es va eliminar el sobrenedant i es va recollir l'ARN segons el manual mitjançant el reactiu de lisi Easy Blue (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Corea). RT PreMix (BIONEER, Daejeon, Corea) es va utilitzar a 42◦C durant 60 min i 95◦C durant 5 minuts per sintetitzar l'ADNc. Els primers PCR (Macrogen, Daejeon, Corea) es van dissenyar tal com es presenta a la taula1 i es va realitzar Western blotting per determinar la quantitat d'expressió de filagrina.



Skincare Cistanche


Per mesurar el nivell de proteïna de la filagrina, cada cèl·lula es va dividir en alíquotes en una placa 6-pou a 1× 105cèl·lules/pou utilitzant medi DMEM que conté un 10 per cent de FBS, un 1 per cent de penicil·lina i
1 per cent d'estreptomicina, seguit d'incubació de 24 h. Després de tornar a la solució sobrenedantmoguts i reomplerts amb medi fresc, les cèl·lules es van cultivar més durant 24 h. La placa de la qual es va eliminar el sobrenedant es va tractar amb una solució de proteïnes (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Corea) per lisar les cèl·lules i després centrifugar (13,000 rpm, 15 min, 4 ◦C). Després, per mesurar la concentració de proteïnes en el sobrenedant, es va barrejaramb 30µg Tampó de mostra NuPAGE LDS (Novex, CA) i bullit a 100◦C durant 5 min. Suben conseqüència, la proteïna es va transferir a membranes de transferència (Millipore, Burlington, MA,EUA) després de SDS-PAGE amb Mini PROTEAN® Cèl·lules tetra (552BR, Bio-Rad, Hèrcules, CA,EUA). Les porcions d'unió a proteïnes no específiques es van bloquejar reaccionant amb tampó Trissolució salina amb 0,1 per cent de Tween® 20 (TBST) i 5 per cent de llet desnatada durant 1 h. L'anticòs primari(filagrina: Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) es va diluir a 1:1000 (v/v), remenatnit a les4◦C, i es va rentar 3 vegades amb TBST durant 15 min. Després, l'anticossos secundaries va afegir la solució, seguida d'una agitació a 25◦C durant 1 h i rentat 3 vegades amb TBSTper15 min, i després Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrat (MerckMillipore, Darmstadt, Alemanya) es va utilitzar per borrar les bandes, que es van fotografiar amb Omega

Lum G (Aplegen, Pleasanton, CA, EUA). Com a proteïna interna estàndard, -actina (Sigma,St. Louis, MO, EUA).


2.5. Prova d'inhibició de la melanogènesi de cèl·lules de melanoma B16

Per trobar dosis segures per a l'assaig d'inhibició de la melanina i observar l'activitat d'inhibició de la melanina mitjançant el tractament de la mostra CLEPS, cèl·lules de melanoma B16 (ATCC) a 1× 105 les cèl·lules/pou es van cultivar en una 6-placa de cultiu de pou que contenia medi DMEM amb un 10% de FBS i un 1% de penicil·lina-estreptomicina afegit a 37ºC.◦C i 5 per cent de CO2 condició. Un inductor de la síntesi de melanina, - Hormona estimulant dels melanòcits ( -MSH), es va preparar dissolent-lo en DMSO al 10 per cent a una concentració de 50µM. Després d'incubar durant 24 h, es van afegir les solucions CLEPS i es van tractar immediatament amb -MSH (50 nM), seguit d'incubació addicional durant 72 h. A continuació, es van rentar les plaques cel·lulars dues vegades amb PBS i es van tripsinitzar, i després es van centrifugar les cèl·lules recuperades a 5000 rpm durant 10 min per eliminar el sobrenedant, després de la qual cosa es va obtenir un pellet cel·lular. El contingut de melanina intracel·lular es va determinar segons el mètode anteriorment informat amb modificacions menors [20]: la melanina es va recollir dissolent-la en NaOH 2 N que contenia un 10 per cent de DMSO a 60ºC.◦C durant 4 h, que es va transferir a una placa de 96-pous. DMSO (0,1 per centv/v) va ser el dissolvent per al control i les mostres de prova amb -MSH. L'absorbància es va mesurar a 475 nm amb un lector ELISA.


2.6. Assaig antiinflamatori d'òxid nítric (NO)

Per examinar la producció de NO, es van cultivar i inocular cèl·lules RAW 264,7 (ATCC).amb una densitat d'1× 104cèl·lules/pou en una placa de 96-pous. Les cèl·lules es van exposar a CLEPS (100o 500µg/mL) durant 1 h, seguit de l'estimulació de les cèl·lules amb lipopolisacàrid (LPS)(1 µg/ml). 10 µg/ml de L'àcid -lipoic (LA) (Sigma) es va utilitzar com a control positiu. Després24 h, la quantitat de NO al medi cel·lular es va mesurar en un volum de 100µL consistentd'una barreja de proporció 1:1 de la solució A (1 per cent de 4-aminobenzèsulfonamida, 0,2 per cent de N{1- (naftalèn-1-il) etan-1,2-diclorhidrat de diamina) i la solució B (5 per cent d'àcid fosfòric), que va serafegit amb un volum igual del medi. Després de 15 minuts, les mesures d'absorbància van serrealitzat a 550 nm mitjançant un lector de microplaques (instrument Multiskan GO). La cultura

Es va utilitzar un medi sense LPS (grup normal) com a control negatiu.

Echinacoside in cistanche (8)

2.7. Assaig antiinflamació d'òxid nítric sintasa inducible (iNOS), ciclooxigenasa-2 (COX2) i factor de necrosi tumoral (TNF )

Les cèl·lules RAW 264.7 (5× 104 cel·les/pou) en plats de 6 cm es van cultivar durant la niti van ser pretractats durant 1 h amb CLEPS. Les cèl·lules es van exposar a LPS (1µg/ml) iincubat durant 24 h. 10µg/ml de L'àcid -lipoic (LA) (Sigma) es va utilitzar com a control positiu.Després d'obtenir les proteïnes mitjançant un tampó de lisi (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA,EUA), es va barrejar amb un còctel inhibidor de la fosfatasa i proteasa (Thermo FisherScientific, Inc., Waltham, MA, EUA), després de la qual cosa es van mesurar tots els lisats mitjançantcompatible amb detergentsassaig de proteïnes (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). ElLes proteïnes es van separar mitjançant electroforesi en gel SDS-PAGE. Les membranes transferides(Immòbil®-P, Millipore, Burlington, MA, EUA) es van bloquejar al tampó TBST (Sigma,Sant Lluís,MO, EUA), que incloïa un 5% de llet desnatada, i les membranes es van mantenir a 4◦C amb anticossos contra iNOS, COX2 o TNF (1:1000). El medi de cultiu sense LPS(grup normal) es va utilitzar com a control negatiu.



2.8. Síntesi del col·lagen i inhibició de la col·lagenasa

Les cèl·lules NHDF es van cultivar i es van tractar prèviament amb CLEPS per examinar-ne l'eficàciaCLEPS sobre la formació de col·lagen i la inhibició de la col·lagena prenent un procol·lagen tipus IKit d'EIA de pèptid C (Takara, Kusatsu, Japó) i un ELISA de quantikine pro-MMP-1 humàkit (sistema R+D, Minneapolis, MN, EUA), respectivament. Com a mètode per mesurar el nivell d'activitat de la col·lagenasa, un enzim que descompon el col·lagen, un anticòs contraes va utilitzar col·lagenasa (MMP-1), mentre que Phorbol 12-miristat 13-acetat (PMA) (Sigma)s'utilitza per activar l'expressió de MMP-1. 10 ng/ml de TGF- (Sigma) es va dissoldreen el medi de cultiu i es va utilitzar com a control positiu, mentre que el medi de cultiu era elcontrol negatiu.



2.9. Assaig de cicatrització de ferides in vitro

Per examinar l'efecte de CLEPS en la cicatrització de ferides, les cèl·lules HaCaT (1× 104cèl·lules/pou)es van xapar en plaques de 12-pous durant 48 h i van créixer fins al 100% de confluència. La monocapa eraferit amb la punta d'un 200 estèrilµpipeta L. Els residus cel·lulars es van eliminar mitjançant el rentatdues vegades amb PBS. A continuació, aquestes cèl·lules es van substituir per un medi sèric fresc a l'1 per cent amb osense CLEPS (100, 500 i 1000µg/mL), seguit d'estimulació durant 0–48 h. Un controles va utilitzar el grup per comparar les propietats de cicatrització de ferides en presència i absènciade CLEPS. Les microfotografies del tancament de la ferida (migració cel·lular) es van fer a 0–48 hde les mateixes zones ferides utilitzant el microscopi invertit (Zeiss, Jena, Alemanya). ElEl canvi percentual de l'àrea de la ferida en píxels es va quantificar manualment per a cada imatge mitjançant ImageJProgramari (v1.52a, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA).


2.10. Anàlisi estadística

Els assajos biofuncionals del CLEPS a cada plataforma es van realitzar per triplicat. Elels resultats es van expressar com a mitjana± desviació estàndar. Es van fer anàlisis estadístiquesutilitzant ANOVA, seguit de la prova posthoc de Tukey HSD o Student'st-prova. Aquestes proveses van realitzar amb el programari SPSS (v25, International Business Machines, Armonk, NY,EUA) i Microsoft Excel (v1905, Microsoft, EUA). Avalor pde<0.05 was considered estadísticament significatiu.

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp més 86 15292862950


















Potser també t'agrada