Autofàgia mediada per acompanyants en malalties neurodegeneratives i insults neurològics aguts al sistema nerviós central, part 2
Aug 05, 2024
4. Eines de recerca experimental per avaluar l'activitat CMA
En aquesta secció, es descriuen les eines de recerca experimentals disponibles per avaluar l'activitat CMA in vitro i in vivo. Els mètodes que s'utilitzen habitualment per obtenir informació es correlacionen amb l'activitat CMA, així com amb els assajos funcionals CMA.
CMA (Certified Management Accountant) és una certificació professional de comptable de gestió, que té com a objectiu certificar persones que tinguin les habilitats operatives i coneixements professionals suficients en l'àmbit de la comptabilitat de gestió. La memòria, una habilitat del cervell humà, es refereix a la capacitat de recordar informació, coneixement o experiència.
Hi ha una certa relació entre CMA i memòria. En primer lloc, l'examen CMA requereix que els candidats recordin un gran nombre de punts de coneixement i conceptes, i al mateix temps requereix que els candidats dominin les habilitats per aplicar aquests punts de coneixement. Per tant, una excel·lent memòria jugarà un paper molt important per aconseguir bons resultats a l'examen CMA.
En segon lloc, la memòria es pot millorar mitjançant l'aprenentatge i la pràctica, cosa que també ajuda a estudiar per a l'examen CMA. Per exemple, revisant repetidament els punts de coneixement, aprenent i memoritzant informació de diferents maneres i utilitzant tècniques de memòria, podeu millorar la memòria i ajudar els candidats a dominar millor els punts de coneixement i les habilitats necessàries per a l'examen CMA.
Finalment, estudiar CMA no és només un examen, sinó també una millora de la qualitat professional. En el desenvolupament professional, si vols exercir millor la teva capacitat professional, és natural que necessites una certa capacitat de memòria per ajudar-te a completar millor les teves tasques laborals.
En resum, hi ha una estreta relació entre CMA i memòria. Intentar millorar la teva memòria no només t'ajudarà a obtenir bones notes, sinó que també t'ajudarà a completar millor les teves tasques laborals i a adonar-te del teu valor personal i dels èxits professionals a mesura que es desenvolupa la teva carrera. Es pot veure que hem de millorar la nostra memòria, i Cistanche deserticola pot millorar significativament la memòria perquè té efectes antioxidants, antiinflamatoris i antienvelliment, que poden ajudar a reduir l'oxidació i la inflamació del cervell, protegint així la salut dels el sistema nerviós. A més, Cistanche deserticola també pot promoure el creixement i la reparació de les cèl·lules nervioses, millorant així la connectivitat i la funció de la xarxa neuronal. Aquests efectes poden ajudar a millorar la memòria, la capacitat d'aprenentatge i la velocitat de pensament, i també poden prevenir l'aparició de disfuncions cognitives i malalties neurodegeneratives.
Feu clic a Saber per augmentar la potència de la memòria
4.1. Anàlisis útils per al seguiment de l'activitat CMA
L'avaluació dels canvis en les quantitats dels components moleculars principals de la CMA es pot utilitzar com a forma indirecta d'avaluar l'activitat de la CMA [46]. A més, es pot analitzar el nombre i la distribució de lisosomes actius per CMA per inferir canvis en l'activitat de CMA [46].
Tanmateix, aquestes anàlisis només proporcionen les dades correlacionades amb l'estat de la CMA. Així, aquestes anàlisis s'han de complementar amb assaigs funcionals [47]. La immunoblotting i la imatge per avaluar els canvis en els components principals de la CMA són els mètodes més utilitzats per avaluar l'activitat de la CMA.
Com que els nivells lisosomals de LAMP2A estan limitats per a CMA [48], els canvis en l'abundància de la proteïna LAMP2A als lisosomes solen correlacionar-se amb l'activitat de CMA. Per tant, en les avaluacions d'imatge, s'ha d'analitzar la presència de LAMP2A a la membrana lisosomal [47].
La immunotranslació per a LAMP2A utilitzant fraccions enriquides amb lisosomes o almenys una fracció de cèl·lules membranoses és més informativa que la utilitzant lisats totals de cèl·lules senceres [46]. Els nivells de lisosomal-hsc70 també estan relacionats amb l'activitat CMA [49].
Tanmateix, hsc70 és una de les chaperones cel·lulars més abundants, i la fracció situada als lisosomes és una quantitat petita. Per tant, l'immunoblotting per a hsc70 en els lisats cel·lulars totals no és informatiu per a CMA [46]. La colocalització de hsc70 amb marcadors lisosomals (per exemple, LAMP1) es pot utilitzar per detectar lisosomes actius per CMA [49].
El nombre d'aquests lisosomes colocalitzats amb hsc70 en proporció a tot el conjunt lisosomal augmenta quan s'activa CMA [12]. A més, una anàlisi microscòpica electrònica mitjançant la tinció d'immunogold per a hsc70 també pot proporcionar informació sobre el conjunt de lisosomes actius per CMA [49].
En anàlisis que utilitzen lisosomes aïllats de cèl·lules o teixits, l'augment dels nivells de substrats CMA coneguts (per exemple, GAPDH) pot indicar una disminució de l'activitat de CMA [46].
En general, els substrats CMA es degraden ràpidament després de la translocació [6]. Així, una comparació dels nivells lisosomals de substrats de CMA en cèl·lules o animals entre models tractats o no tractats amb inhibidors de proteases lisosomals (és a dir, leupeptina) permet mesurar el flux en valors de CMA [24].
4.2. Assajos funcionals
Diversos assajos funcionals permeten el seguiment de l'activitat CMA al llarg del temps en cèl·lules, teixits i orgànuls aïllats.
4.2.1. Avaluació de la degradació de proteïnes intracel·lulars
Aproximadament el 30% de les proteïnes citosòliques totals poden ser degradades per CMA [9]. Tanmateix, la fracció real de la proteïna citosòlica degradada per CMA varia en funció del tipus cel·lular i de les condicions cel·lulars [6].
Per tant, la mesura del conjunt de proteïnes cel·lulars que pateixen degradació mitjançant CMA és un mètode comú per determinar l'activitat global de la via CMA [46].
Els experiments de pols i persecució que utilitzen un aminoàcid radiomarcat i inhibidors de proteases lisosomals o d'altres vies autofàgiques es poden utilitzar per discriminar les proteïnes que pateixen degradació CMA de les gestionades per altres vies [50].
4.2.2. Reporters CMA fotoconvertibles
A més, un mètode de seguiment de l'associació lisosomal de reporters de CMA fluorescents artificials també seria útil per fer el seguiment del lliurament i la degradació del substrat mitjançant CMA [51].
Utilitzant reporters fluorescents fotoconvertibles [51], és possible rastrejar l'associació de la proteïna fotoconvertida amb lisosomes en un canal de fluorescència diferent. Un augment del nombre de punts fluorescents per cèl·lula seria un bon indicador de l'activació de CMA [46].
4.2.3. Anàlisis in vitro de CMA utilitzant lisosomes aïllats
La conversa creuada entre diferents vies autofàgiques fa que sigui difícil avaluar amb precisió l'activitat CMA a les cèl·lules intactes [41]. Per tant, hem d'analitzar per separat tots els passos funcionals implicats en el procés de degradació dinàmica de les vies CMA [46,49].
L'enfocament més fiable per analitzar l'activitat de CMA s'obté mitjançant la reconstitució in vitro de CMA amb lisosomes aïllats [52]. L'aïllament de la fracció específica de lisosomes actius en CMA permet una anàlisi del contingut de substrats CMA endògens als compartiments de CMA [47].
Els lisosomes aïllats també permeten la reconstitució de CMA in vitro per seguir els passos implicats en la unió del procés CMA-substrat, l'absorció lisosomal i la degradació lisosomal [50].
El tractament amb inhibidors de la proteasa lisosomal seguit d'incubació amb el substrat CMA permetrà mesurar el substrat unit i translocat als lisosomes (unió i captació) [39].
Descomptant la quantitat de substrat unit a la lisosomasina que no s'ha impedit la proteòlisi, llavors seria possible calcular l'absorció [39,53].
Les fraccions lisosomals aïllades també permeten la comparació directa dels canvis en el contingut, la modificació post-traduccional i l'organització dels components CMA a la membrana del lisosomal. Les reduccions dels nivells de LAMP2A lisosomal o lys-hsc70 en lisosomes aïllats són indicatives d'una disminució de l'activitat de CMA [54, 55], mentre que els augments de LAMP2Alevels suggereixen una regulació de l'activitat de CMA [56].
A més, la proporció de LAMP2A lisosomal reunida en un complex multimèric en un moment donat es pot determinar mitjançant electroforesi bluenative de lisosomes aïllats i immunoblot per a LAMP-2A [57].
5. Malalties Neurodegeneratives i CMA
Les neurones són cèl·lules post-mitòtiques i requereixen una maquinària eficient de degradació de proteïnes per mantenir l'homeòstasi cel·lular en condicions d'estrès [58,59]. El deteriorament del procés de degradació de proteïnes al SNC provoca l'agregació de proteïnes aberrants o danyades, que és una característica diferent de moltes malalties neurodegeneratives.
S'ha recopilat evidència substancial que la disfunció de la CMA està associada a diferents patologies en diverses malalties neurodegeneratives que afecten el SNC [1,14].
En aquestes malalties, s'han identificat diverses proteïnes patògenes com a substrats de la CMA, com ara -sinucleïna en PD [60], tauproteïna en AD [61], huntingtina (Htt) en HD [62, 63] i TDP{{5} } en ALS i FTLD [64,65].
5.1. Malaltia de Parkinson
La PD és un dels trastorns neurodegeneratius més freqüents. Les principals característiques patològiques de la MP són la pèrdua gradual de neurones dopaminèrgiques dins de la substància negra i l'agregació de la proteïna -sinucleïna als cossos de Lewy.
Nombrosos estudis han demostrat que el deteriorament de la CMA està relacionat amb la patogènesi principal de la MP [4,66]. En pacients amb PD, el nivell de proteïna LAMP2A disminueix al cervell, cosa que indica que l'activitat CMA s'atenua [67,68].
Molts estudis anteriors han suggerit que la inhibició de la via de degradació de CMA provoca l'acumulació de -sinucleïna, que s'associa amb la pèrdua gradual de neurones dopaminèrgiques [8].
És important destacar que les formes mutants A53T i A30P de -sinucleïna identificades a la PD familiar no poden ser degradades per CMA. A més, aquestes formes mutants s'uneixen estretament a LAMP2A a la membrana lisosomal i, en conseqüència, inhibeixen la degradació normal d'altres substrats de CMA in vitro [60, 69]. La mutació G2019S a la proteïna repetida quinasa 2 rica en leucina (LRRK2) pot ser una causa patològica de la PD familiar. [70].
El mutant G2019S inhibeix l'assemblatge dinàmic del complex de translocació CMA a la membrana lisosomal, causant la disfunció de CMA en el model d'amouse de PD i el cervell dels pacients mutants LRRK2 PD [25]. A més, les formes mutants patògenes de LRRK2 s'uneixen a Hsc70 citosòlic i interaccionen de manera anormal amb components CMA, bloquejant la degradació d'altres substrats de CMA i la proteïnhomeòstasi neuronal in vitro [25,71].
La hidrolasa C-terminal de la ubiquitina L1 (UCH-L1) interacciona físicament amb LAMP-2A, Hsc70 i Hsp90 i està implicada en el mecanisme regulador de la via CMA [72]. En un estudi anterior, la forma mutant I93M de UCH-L1 es va identificar en una única família de PD [73].
També s'ha informat que la mutació I93M en UCH-L1 va millorar la interacció anormalment amb la regió citosòlica de LAMP2A, inhibint la via CMA in vitro [74]. A més, l'expressió de la forma mutant I93M de cèl·lules de mamífers UCH-L1 va induir l'augment de la quantitat de sinucleïna associat a la inhibició de CMA [74].
Aquestes troballes suggereixen que la interacció aberrant de la forma mutant I93M d'UCH-L1 amb la maquinària CMA podria ser la base de la patogènesi de la MP associada a l'agregació de -sinucleïna. La proteïna 7 de la malaltia de Parkinson (PARK7), també coneguda com DJ-1, és una proteïnes multifuncionals implicades en una varietat d'activitats cel·lulars, inclosa la resistència a l'oxidació [75].
PARK7/DJ-1té un paper important en el manteniment de l'homeòstasi mitocondrial [75]. S'ha informat que una mutació en el gen DJ-1 media les formes autosòmiques recesives i primerenques de PD [76]. La deficiència de DJ-1 va accelerar la degradació de LAMP2A als lisosomes, donant lloc a l'agregació de -sinucleïna [77]. ].
En canvi, DJ-1 va poder inhibir l'acumulació de -sinucleïna mitjançant la regulació de la CMA [78]. En general, es considera que diversos mecanismes moleculars que causen una disfunció de la CMA són la base de la patogènesi de la MP.
No obstant això, els mecanismes patològics associats a la CMA segueixen sent poc clars. Es necessitaran més investigacions per aclarir la relació entre el procés CMA i les patologies reals de la MP.
5.2. Malaltia d'Alzheimer
La MA és la malaltia neurodegenerativa més freqüent en la gent gran. La patogènesi principal de la MA és la formació de plaques amiloides i l'agregació de Tau causada pel deteriorament de l'homeòstasi de les proteïnes. S'han identificat diverses proteïnes relacionades amb l'AD com a substrats de la CMA. Es va demostrar que la degradació de la CMA d'aquests substrats de proteïnes estava deteriorada en pacients amb AD [45,61,79].
L'acumulació progressiva d'oligòmers amiloides és un esdeveniment tòxic central a l'AD [80, 81]. Un estudi recent va demostrar que l'etiquetatge d'oligòmers amiloides amb múltiples motius KFERQ va promoure la seva entrada als endosomes i lisosomes, protegint les neurones corticals de cultiu primari humans de la neurotoxicitat [82]. La proteïna precursora d'amiloide (APP) és una molècula patògena important en la MA perquè es pot processar per produir amiloide- [83].
L'APP conté un motiu semblant a KFERQ al seu extrem C. Aquest motiu és important per al processament i la degradació normals de l'APP per evitar l'acumulació de fragments APP-C-terminals [84]. Un estudi recent va revelar que l'APP és un substrat CMA que s'uneix a Hsc70 [85].
La inhibició de la degradació de CMA d'APP millora la seva citotoxicitat. A més, l'activació de CMA per la sobreexpressió Hsc70 o la metformina va reduir els nivells acumulats de placa amiloide cerebral i va invertir els fenotips d'AD molecular i de comportament en un model de ratolí d'AD [85]. La tau és una proteïna citosòlica que normalment estabilitza els microtúbuls a les cèl·lules neuronals.
La tauproteïna té motius orientats a CMA i es pot degradar per la via CMA [79]. L'agregació de proteïnes Tau mutants que resulta en una hiperfosforilació de Tau i la formació d'embolics neurofibril·lars és un segell distintiu de l'AD i les tauopaties relacionades [86,87).
A més, les proteïnes Tau mutants poden interactuar de manera anormal amb LAMP2A i inhibir la translocació al lumen del lisosoma, perjudicant l'activitat CMA [79]. El regulador de la calcineurina 1 (RCAN1) és un substrat de la CMA [45] i està elevat en pacients amb AD [88].
RCAN1 és un inhibidor de la desfosforilació de proteïnes Tau depenent de la calcineurina. És important destacar que l'activitat CMA es pot inhibir augmentant el nivell de RCAN1, perjudicant així la degradació d'altres substrats de CMA [45].
5.3. Malaltia de Huntington
La HD és un trastorn neurodegeneratiu d'aparició tardana caracteritzat per moviments incontrolats, demència i trastorns emocionals. La HD és una malaltia hereditària dominant causada per l'acumulació i l'agregació de la proteïna Htt mutant a les neurones estriatals i corticals.
Htt conté un tracte de poliglutamina (poliQ) N-terminal expandit anormalment [62,63,89]. Es suggereix que la disfunció de la degradació de Htt és la patogènesi principal de la HD.
Estudis anteriors han demostrat que la CMA està implicada en la degradació de Htt mutant en models cel·lulars i de ratolí de HD [62]. Htt alberga un motiu KFERQ putatiu i interactua amb els components clau de CMA, Hsc70 i LAMP2A. A més, el mutant Htt amb una expansió del tracte poliQ mostra una captació deteriorada per CMA in vitro [89].
No només la CMA sinó la macroautofàgia està implicada en la degradació de Htt [90]. Htt es pot unir tant a LAMP2A com a la proteïna Atg7 relacionada amb la macroautofàgia en el procés de degradació [89,91,92].
S'ha informat que l'activitat CMA està regulada en models cel·lulars i animals de HD en l'etapa inicial de la malaltia. Tanmateix, l'activitat de la CMA disminueix durant l'etapa final de la malaltia [91]. Aquestes troballes suggereixen que l'augment precoç de l'activitat CMA pot ser una regulació compensatòria en resposta a la ineficiència de la macroautofàgia. La disminució del nivell de LAMP2A lisosomal indica que hi ha una pèrdua de la funció CMA a la fase tardana de la HD [91].
5.4. Esclerosi Lateral Amiotròfica i Degeneració Lobar Frontotemporal
ALS i FTLD són malalties neurodegeneratives amb moltes característiques clíniques i patològiques similars [93]. La proteïna d'unió a l'ADN de 43 kDa de resposta de transactivació (TDP-43) és una proteïna ribonuclear que regula molts aspectes del metabolisme de l'ARN.
L'acumulació de fragments C-terminals de TDP-43 a les cèl·lules neuronals es detecta amb freqüència en pacients amb ALS i FTLD [65]. Per tant, l'acumulació de TDP-43 es considera àmpliament un segell distintiu d'aquestes malalties.
La proteïna TDP-43 conté un motiu semblant a KFERQ que s'uneix a Hsc70 i es pot degradar pel procés CMA [94,95]. S'ha informat que l'expressió de Hsc70 es va reduir en limfomòcits de pacients amb ELA esporàdica i va contribuir a l'acumulació de TDP -43 [64].
Una mutació en el motiu semblant a KFERQ en TDP-43 pot interrompre la seva degradació mitjançant CMA, induint l'acumulació de TDP-43 i la inhibició de CMA en cèl·lules cultivades [94]. CMA pot ajudar a controlar la rotació de les formes fisiològiques i patològiques de TDP-43 [94].
For more information:1950477648nn@gmail.com
