Caracterització dels àcids cafeoilquínics de Lepisorus Thunbergianus i la seva activitat inhibidora de la melanogènesi

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung* i Kooyeon Lee*

RESUM:La hiperpigmentació resultant de la sobreactivació de la tirosinasa condueix a taques o taques més fosques a la pell humana. Tot i que aquests fenòmens són inofensius, encara hi ha una gran demanda d'inhibidors de la melanogènesi per prevenir la hiperpigmentació mitjançant la inhibició de la tirosinasa, un enzim que limita la velocitat de la melanogènesi. Encara que Lepisorus thunbergianus s'ha utilitzat en medicaments populars com a agent diürètic i hemostàtic, encara no s'ha informat del seu efecte sobre la melanogènesi. En aquest estudi, hem preparat un extracte de L.thunbergianus i les seves fraccions de dissolvents i hem avaluat la seva activitat biològica contra la síntesi de radicals lliures i melanina. L'extracte de L. thunbergianus va inhibir l'activitat tirosinasa dels bolets de manera més eficient que, i amb una activitat antioxidant similar a, l'arbutina in vitro. L'avaluació comparativa de l'activitat anti-melanogènesi i anti-tirosinasa de les fraccions de dissolvents de L. thunbergianus va demostrar que, en inhibir l'activitat de la tirosinasa, la fracció butanol té el potencial més alt per a la inhibició de les cèl·lules del melanoma de la melanogènesi. Hem trobat mitjançant anàlisi estructural mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) i espectroscòpia RMN que els principals compostos de la fracció butanol eren tres derivats de l'àcid cafeoilquínic. Els tres derivats tenien activitats similars d'eliminació de radicals i anti-tirosinasa in vitro, mentre que només l'àcid 5-cafeoilquínic tenia un efecte inhibidor sobre la melanogènesi induïda per -MSH. L'efecte inhibidor de l'àcid cafeoilquínic es va verificar mitjançant la determinació del contingut de melanina i l'activitat de la tirosinasa en el melanoma després de tractar les cèl·lules amb un compost comercial. A més, vam revelar que l'àcid cafeoilquínic va inhibir la melanogènesi quelant un catió de coure d'un complex de coure-tirosinasa. Per tant, la fracció 5-àcid cafeoilquínic o butanol aïllada de L. thunbergianus pot ser útil en cosmètics com a agent blanquejador de la pell.

Cistanche tubulosa: l'agent blanquejador de la pell.

INTRODUCCIÓ

La melanina, un grup de pigments naturals que es troben a la majoria dels organismes, té un paper important en l'enrossament de fruites, fongs i verdures i en la pigmentació de la pell humana.1 La melanina es produeix a partir de l'aminoàcid tirosina mitjançant un procés de diversos passos que inclou oxidació i polimerització enzimàtica. 2 Els inhumans, el pigment de melanina és sintetitzat per melanòcits de cèl·lules dendrítiques especialitzades situats a la unió entre l'epidermis i la dermis, on la síntesi s'inicia per l'exposició als raigs ultraviolats (UV).3 El pigment de melanina es transporta als queratinòcits per protegir la pell dels raigs UV i dels radicals lliures; per tant, el color de la pell està determinat pel patró de distribució del pigment de melanina.2 La desregulació de la síntesi de la melanina condueix a moltes formes d'hiperpigmentació, com ara melasma, pigues, taques de l'edat, lentigo solar, hiperpigmentació postinflamatòria i altres síndromes d'hiperpigmentació.4 Més d'un cent proteïnes estan relacionades amb la síntesi de tomelanina, i entre elles, la tirosinasa és l'enzim limitador de la velocitat que es reconeix com a responsable de la síntesi de formelanina.5 Així, la majoria dels treballs de recerca per prevenir la hiperpigmentació se centren en la identificació, aïllament, síntesi i caracterització de nous potents. inhibidors de la tirosinasa per a la prevenció de la melanogènesi.1,6 Una sèrie d'inhibidors de la tirosinasa, com l'àcid cògic, l'arbutina, la hidroquinona, l'àcid azelaic, l'àcid elàgic i l'àcid tranexàmic, s'han utilitzat popularment a la indústria cosmètica com a agents anti-melanogènesi; no obstant això, a causa de les limitacions dels fàrmacs químics, que inclouen la citotoxicitat i els efectes secundaris, encara hi ha demanda de nous materials amb seguretat, estabilitat i eficàcia millorades.7

Els productes naturals, incloses plantes, bacteris i fongs, s'han convertit en fonts alternatives per al descobriment d'ingredients eficients per blanquejar la pell a causa de la seva menor toxicitat i millor biocompatibilitat i biodisponibilitat.1,8 Lepisorus thunbergianusis és una falguera pertanyent a les Polypodiaceae, que creix adherida a roques velles. o l'escorça dels arbres i es distribueix a les regions temperades de l'Àsia oriental, com Corea, Japó, Xina, Filipines i Indoxina. L. thunbergianus s'ha utilitzat com a agent adiürètic, hemostàtic i és antitussiu en els medicaments populars coreans. Estudis anteriors van informar que un extracte de L. thunbergianus té activitat tòpica de peroxidació anti-lípids en l'activitat local i antioxidant.9 A més, l'extracte de L. thunbergianus va mostrar una inhibició significativa del creixement depenent de la concentració en cèl·lules de càncer oral i càncer de còlon.10 L'extracte de L. thunbergianus pot tenir aplicacions potencials. a la indústria cosmètica perquè aquesta planta conté diversos compostos flavonoides i nombroses molècules bioactives, que inclouen quercetina 3-metil èter-glucòsid, vitexina, oriental, periòdic-glucòsid, isovitexina, orientina, corentina i àcid cafeoilquínic.9a No obstant això, els efectes de la La síntesi d'onmelanina de l'extracte de L. thunbergianus als melanòcits encara no s'ha dilucidat.

Figura 1. Anàlisi de l'extracte de L. thunbergianus per a (A) activitats d'eliminació de radicals ABTS, (B) anti-tirosinasa i (C) activitats intracel·lulars d'eliminació de ROS

En aquest estudi, vam preparar l'extracte de L. thunbergianus i les seves fraccions dissolvents mitjançant el fraccionament en sèrie i vam investigar els efectes inhibidors de les fraccions de dissolvents sobre la melaninbiosíntesi a les cèl·lules de melanoma B16F10. Vam identificar la fracció de butanol (n-BuOH) com a part principal que contenia l'inhibidor natural i vam caracteritzar encara més els efectes dels derivats de l'àcid cafeoilquínic aïllats dels extractes de L. thunbergianus sobre la inhibició de la biosíntesi de melanina.

Revisió de cistanche: anti-oxidació

RESULTATS I DISCUSSIÓ

L'extracte d'etanol de L. thunbergianus elimina els radicals 2,2′-Azinobis(3-etil-benzotiazolina-6-àcid sulfònic (ABTS) i inhibeix l'activitat de la tirosinasa.

L'extracció de L. thunbergianus amb un 70 per cent d'etanol (EtOH) es va realitzar per avaluar la potencial activitat inhibidora dels compostos naturals a la planta. L'activitat d'eliminació de radicals de l'extracte de L.thunbergianus es va determinar en el rang de concentració de 2-200 ug/mL. L'extracte d'etanol va mostrar una activitat d'eliminació de radicals depenent de la concentració amb un efecte màxim a 50 ug / ml en la qual el resultat era coherent amb el de l'arbutina utilitzada com a control positiu (figura 1A).

També es va avaluar l'efecte inhibidor de l'extracte sobre l'activitat de la tirosinasa de bolets mesurant la taxa de síntesi de dopacrom catalitzada per la tirosinasa. L'extracte d'etanol va inhibir el 87 per cent de l'activitat de la tirosinasa a 500 ug/mL, mentre que l'arbutina va inhibir només el 38 per cent de l'activitat de la tirosinasa a la mateixa concentració (figura 1B). A continuació, es va avaluar l'activitat d'eliminació de l'extracte sobre ROS intracel·lular augmentada en peròxid d'hidrogen 100 μM. El tractament amb peròxid d'hidrogen va provocar un augment d'aproximadament 2,1- vegades del nivell de ROS intracel·lular de les cèl·lules B16F10 (figura 1C). Vam trobar que l'augment de ROS intracel·lular mediat pel peròxid d'hidrogen va ser eliminat per l'extracte de manera dependent de la dosi: l'activitat màxima d'eliminació a 100 ug/mL va ser del 78 per cent (figura 1C). Aquests resultats suggereixen que l'extracte d'etanol de L. thunbergianus conté ingredients bioactius que inhibeixen l'activitat de la tirosinasa, així com l'eliminació de radicals ABTS i ROS intracel·lulars.

extracte de cistanche deserticola: inhibeix l'activitat de la tirosinasa.

Potencial inhibidor de les fraccions de L. thunbergianus contra la melanogènesi.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2> Hex, que és coherent amb l'informe anterior.10b A més, els efectes inhibidors de les diferents fraccions de dissolvents de l'activitat de l'ontirosinasa van augmentar de manera dependent de la concentració: les activitats inhibidores màximes de les fraccions n-Hex i CH2Cl2 eren per sota del 65 per cent, però les d'EtOAc i Les fraccions n-BuOH eren superiors al 70 per cent (figura 2B). L'activitat inhibidora va ser de l'ordre de n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Aquests resultats suggereixen que les fraccions més hidròfiles, incloses les fraccions n-BuOH i EtOAc, van mostrar una major activitat d'eliminació de radicals i una millor activitat inhibidora que les fraccions lipòfiles n-Hex i CH2Cl2. .

A continuació, es van investigar els efectes de les fraccions de dissolvent de L. thunbergianus sobre la proliferació cel·lular de melanoma tractant cèl·lules B16F10 amb 200 ug/mL cadascuna de les diferents fraccions o 2 mg/mL d'arbutina en el presència d'una hormona estimuladora de melanòcits (-MSH), que és ben coneguda per promoure la melanogènesi mitjançant la inducció del factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF).11 Els resultats van mostrar que cap de les fraccions va tenir cap efecte significatiu sobre la proliferació cel·lular del melanoma (figura 2C). A continuació, vam investigar l'efecte inhibidor de les fraccions de dissolvent sobre la melanogènesi estimulada per -MSH a les cèl·lules de melanoma. El tractament amb -MSH va induir un augment d'aproximadament 2.0- vegades en el contingut de melanina intracel·lular de les cèl·lules B16F10 (figura 2D). Vam trobar que la melanogènesi mediada per -MSH estava completament inhibida per la fracció n-BuOH (p <0,01) i="" parcialment="" inhibida="" per="" la="" etoacfraction="" (40="" per="" cent,="" p=""><0,01), mentre="" que="" la="" melanogènesi="" mediada="" per="" -msh="" no="" es="" va="" canviar="" significativament="" per="" n-hex.="" i="" fraccions="" ch2cl2="" (figura="" 2d).="" a="" més,="" es="" van="" determinar="" els="" efectes="" inhibidors="" de="" les="" fraccions="" de="" dissolvents="" sobre="" l'activació="" de="" la="" tirosinasa="" mediada="" per="" -msh,="" ja="" que="" la="" tirosinasa="" té="" un="" paper="" clau="" en="" la="" melanogènesi.="" per="" -msh,="" mentre="" que="" les="" fraccions="" n-hex="" i="" ch2cl2="" no="" ho="" van="" fer,="" tal="" com="" es="" mostra="" a="" la="" figura="" 2e.="" a="" més,="" el="" peròxid="" d'hidrogen="" va="" estimular="" l'efecte="" eliminador="" de="" diferents="" fraccions="" de="" dissolvents="" sobre="" l'augment="" de="" ros="" intracel·lular.="" totes="" les="" fraccions="" de="" dissolvent="" van="" invertir="" l'augment="" intracel·lular="" de="" ros="" mediat="" pel="" peròxid="" d'hidrogen,="" tal="" com="" es="" mostra="" a="" la="" figura="" 2f.="" aquests="" resultats="" indiquen="" que="" la="" fracció="" buoh="" de="" l.="" thunbergianus="" va="" inhibir="" la="" melaninsíntesi="" induïda="" per="" -msh="" mitjançant="" la="" inhibició="" de="" l'activitat="" de="" la="" tirosinasa="" intracel·lular="" a="" les="" cèl·lules="" b16f10.="" a="" més,="" aquests="" resultats="" suggereixen="" que="" els="" ingredients="" bioactius="" que="" inhibeixen="" la="" síntesi="" de="" melanina="" eren="" hidròfils="" i="" es="" van="" trobar="" principalment="" a="" la="" fracció="">

Figura 2. Efectes de les fraccions de dissolvents sobre les activitats d'eliminació de radicals ABTS, anti-tirosinasa i anti-melanogènesi.

Identificació i caracterització de compostos bioactius d'extracte de L. thunbergianus.

Per identificar i caracteritzar els ingredients que inhibeixen la melanogènesi, es va realitzar una anàlisi de cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) per a totes les fraccions de dissolvents. L'anàlisi HPLC de les fraccions de dissolvents va revelar que totes les fraccions contenen tres compostos principals en temps de retenció de 21, 28 i 29 min per als compostos 1, 2 i 3, respectivament (figura 3A-D). Aquests tres compostos principals es van aïllar encara més mitjançant purificació preparativa per HPLC. Les quantitats dels tres compostos principals de la fracció n-BuOH es van determinar utilitzant derivats comercials de l'àcid cafeoilquínic com a molècules estàndard internes, segons l'informe anterior.12

Els compostos aïllats es van identificar llavors comparant les seves dades de RMN 1H i 13C amb la literatura i es va trobar que estaven d'acord amb les estructures proposades (figura 4).13 La figura 3E mostra l'estructura molecular dels tres compostos. El compost 1 (rendiment, 3,2 ± 0,1 mg/100 mg n de fracció BuOH) es va obtenir com una pols de color groc pàl·lid. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,66 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,49 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1H, s), 6,99 ( 1H, d, J=8,2 Hz), 6,78 (1H, d, J=8,1 Hz), 6,23 (1H, d, J=15,9 Hz), 5,20( 1H, m), 5,08 (1H, brs), 4,89 (1H, brs) 4,13 (1H, m), 3,84 (1H, m), 3,56 (1H, s), 3,35 (1H, s), 1,99 (1H, s), m), 1,92 (1H, m), 1,89 (1H, m), 1,79 (1H, m). 13C{1H} RMN (100 MHz, DMSO-d6) δ (176,42, 168,10, 148,14, 145,53, 144,75, 125,65, 121,07, 115,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75, 114,75. El compost 1 es va identificar com a 3-àcid cafeoilquínic per anàlisi de RMN i per comparació amb la literatura anterior.13b

El compost 2 (rendiment, 14,1 ± 0,1 mg/100 mg de fracció n-BuOH) es va obtenir com una pols de color groc pàl·lid. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} RMN (100MHz, DMSO-d6) δ (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 114,68,63,114,68,63,114,68,63,114,683,114,683,55,144,77). El compost 2 es va identificar com a 5-àcid cafeoilquínic mitjançant l'anàlisi de RMN i per comparació amb la literatura anterior.13c

El compost 3 (rendiment, 3,9 ± 0,2 mg/100 mg de fracció n-BuOH) es va obtenir com una pols de color groc pàl·lid. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) δ 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1H, brs), 4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} RMN (100MHz, DMSO-d6) δ (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 114,68,63,114,68,63,114,68,63,114,683,114,683,55,144,77). El compost 3 es va identificar com a 4-àcid cafeoilquínic per anàlisi de RMN i per comparació amb la literatura anterior.13a

Figura 3. Cromatogrames HPLC de les fraccions (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc i (D) n-BuOH de L. thunbergianus i (E) estructura dels tres compostos principals.

Potencial inhibidor dels derivats de l'àcid cafeoilquínic aïllats de L. thunbergianus contra la melanogènesi.

A continuació, per identificar l'ingredient biològicament actiu subjacent a la potent anti-melanogènesi, vam determinar l'activitat inhibidora dels tres derivats de l'àcid cafeoilquínic aïllats de L. thunbergianus contra les cèl·lules del melanoma de síntesi de melanina. En primer lloc, es van investigar els efectes dels tres derivats sobre l'eliminació de radicals ABTS. Els resultats van mostrar que els tres derivats tenien activitats similars d'eliminació de radicals ABTS (figura 5A). A continuació, es va investigar l'efecte inhibidor dels tres derivats aïllats de l'activitat de la ontirosinasa de L. thunbergianus. Els tres derivats van mostrar una inhibició de l'activitat de la tirosinasa depenent de la concentració, amb una inhibició màxima a una concentració de 200 μM (figura 5B). A més, es va investigar l'efecte inhibidor dels tres derivats sobre la síntesi de melanina induïda per -MSH a les cèl·lules B16F10. El tractament amb -MSH va induir un augment d'aproximadament 2.0- vegades en el contingut de melanina intracel·lular de les cèl·lules B16F10 (figura 5C). Curiosament, els compostos 1 (3-àcid cafeoilquínic) i 3 (4-àcid cafeoilquínic) van augmentar significativament la síntesi de melanina en un 25 i un 23 per cent, respectivament (figura 5C, p.< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Figura 4. Espectres de RMN 1H de (A) 3-àcid cafeoilquínic, (B) 4-àcid cafeoilquínic i (C) 5-àcid cafeoilquínic i espectres de RMN 13C de (D) {{ 6}}àcid cafeoilquínic, (E) 4-àcid cafeoilquínic i (F) 5-àcid cafeoilquínic

Verificació de l'eficàcia anti-melanogènesi de l'àcid 5-cafeoilquínic.

Per verificar l'efecte inhibidor de l'àcid cafeoilquínic contra la melanogènesi, vam determinar l'efecte inhibidor de la síntesi comercial d'onmelanina de l'àcid cafeoilquínic mediada per -MSH. El tractament amb concentracions més baixes de 0,1 i 0,2 mM 5-àcid cafeoilquínica va augmentar lleugerament la síntesi de melanina i l'activitat intracel·lulartirosinasa, mentre que les concentracions més altes de 0,5 i 1 mm del compost van revertir la melanogènesi mediada per MSH. i l'activitat intracel·lular de la tirosinasa (Figura 6A, B) en la qual els resultats són coherents amb l'informe anterior.14

L'àcid cafeoilquínic és un compost fenòlic format per l'enllaç èster entre l'àcid cafeic i l'àcid L-quínic. S'ha conegut que els derivats de l'àcid cafeoilquínic tenen activitats anti-melanogènesi i anti-tirosinasa, així com activitat eliminadora de ROS. La tirosinasa és un metaloenzim multifuncional que conté coure amb cations de coure divalents.1 Els derivats de l'àcid cafeoilquínic poden inhibir l'activitat de la tirosinasa en quelant un catió de coure responsable de mantenir l'estat actiu de la tirosinasa. Per predir la interacció entre 5-àcid cafeoilquínic i tirosinasa, es va realitzar un estudi d'acoblament molecular computacional mitjançant el programa Maestro. La millor posició per al compost, la totirosinasa acoblada, es mostra a la figura 6C, D. L'estudi d'acoblament molecular va revelar que l'àcid cafeoilquínic interacciona amb el coure a una distància de 2,43 Å i estableix una sèrie d'apilament π−π amb His. 259, residus Asn 260, His 85 i His 263 i un enllaç H amb Arg 268. A més, l'energia d'unió entre la tirosinasa i l'àcid 5-cafeoilquínic era de -4,425 kJ/mol. Aquests resultats indiquen que 5-àcid cafeoilquínic podria inhibir l'activitat de la tirosinasa mitjançant la quelació del coure. Per verificar el mecanisme inhibidor de la melanogènesi per 5-àcid cafeoilquínic, vam determinar la capacitat quelant del coure de l'àcid 5-cafeoilquínic. La capacitat quelant del coure de l'àcid cafeoilquínic es va augmentar de manera dependent de la concentració (figura 6E). Aquest resultat suggereix que 5-àcid cafeoilquínic inhibeix la síntesi de melanina mitjançant la quelació d'un catió de coure que interacciona amb la tirosinasa.

Figura 5. Efectes dels tres derivats de l'àcid cafeoilquínic sobre l'activitat de depuració de radicals, anti-tirosinasa in vitro i anti-melanogènesi a les cèl·lules B16F10.

MATERIALS I MÈTODES

Materials

L. thunbergianus es va comprar al mercat en línia www.jirisangol.com (Corea) i es va assecar en condicions ambientals abans d'utilitzar-lo en aquest estudi. Reactius, com ara 2,2′-zinc bis(3-etil-benzotiazolina-6-àcid sulfònic (ABTS) i 3-(4,5-dimetiltiazol-2- yl)-2,5-bromur de difeniltetrazoli (MTT), una hormona estimulant dels melanòcits (-MSH) i enzims, com la tirosinasa de bolets, es van obtenir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). El persulfat de potassi (K2S2O8), el violeta de pirocatecol i la 3,4-dihidroxi-L fenilalanina (L-DOPA) es van comprar a Alfa Aesar (Haverhill, MA, EUA).

Extracció i fraccionament de L. thunbergianus.

L. thunbergianus sec (80 g) es va polveritzar amb un polveritzador (HBL-3500S, Samyang Electronics, Corea) i es va extreure amb un 70 per cent d'EtOH tres vegades (800 ml, cada vegada). ) a 70 graus durant 3 dies. L'extracte resultant es va filtrar al buit amb paper de filtre Advantec núm. 1 i 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tòquio, Japó) i es va concentrar mitjançant un evaporador rotatiu Hei-Vap Advantage (Heidolph, Alemanya) per obtenir 17,2 g d'extracte EtOHcrude. Aquest extracte brut es va suspendre en dH2O (180 ml) i es va fraccionar successivament amb Hex, CH2Cl2, EtOAc i n-BuOH per produir Hex (1,51 g, 8,8 per cent), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 per cent), EtOAc (3,95 g, 23. per cent) i n-BuOH (3,02 g, 17,6 per cent), tal com es va descriure anteriorment.15 Els extractes i les fraccions resultants es van liofilitzar i es van emmagatzemar a -80 graus abans d'utilitzar-los.

Determinació de l'activitat d'eliminació de radicals lliures d'ABTS.

Per avaluar l'activitat antioxidant dels extractes de L.thunbergianus i les seves fraccions de dissolvents, es va determinar l'activitat d'eliminació del radical ABTS, tal com s'ha descrit anteriorment.16 Per generar el radical ABTS, es va barrejar 10 mL de 7 mMABTS amb 176 μL de 140 mM. disulfat de potassi en dH2O i incubat a la foscor a temperatura ambient (RT) durant 16 hores abans de l'ús. La solució radical ABTS es va diluir amb metanol absolut per obtenir una absorbància de prop de 0,7 a 734 nm. Es van afegir alíquotes de 100 μL de cada extracte o fraccions en l'interval de concentració indicat de 2-200 ug/mL a 100 μL de la solució radical ABTS diluïda i es van incubar durant 10 min a la foscor a RT. A continuació, es va mesurar l'absorbància a 732 nm mitjançant un lector de microplaques multimode SpectraMaxM5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). L'activitat d'eliminació de radicals ABTS es va calcular de la següent manera

Activitat d'eliminació de radicals ABTS (percentatge) =1−(Asample/Acontrol)×100 (1)

Inhibició de la tirosinasa in vitro.

L'efecte inhibidor dels extractes de L.thunbergianus i les seves fraccions de dissolvents sobre l'activitat de la tirosinasa es va avaluar mitjançant la quantitat de dopacromesintetitzat a partir de la reacció catalítica de la tirosinasa. Tirosinasa de bolets U/ml en 50 mM de solució salina tamponada amb fosfat (PBS; 8,1 mM de Na2HPO4, 1,2 mM de KH2PO4, pH 6,8, 2,7 mMKCl i 138 mM de NaCl) en una placa de 96-pous i incubada durant 30 min a RT. A continuació, es van afegir 100 μL de L-DOPA 1 mM a cada pou seguit d'incubació durant 10 min addicionals a 37 graus. L'absorbància de la solució resultant es va mesurar a 475 nm mitjançant el microplatreader multimode SpectraMax M5.

Cultiu cel·lular.

Les cèl·lules de melanoma murí B16F10 es van cultivar en el medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, EUA) complementat amb un 10 per cent de sèrum fetal boví inactivat per calor (Gibco), 100 unitats/mL de penicil·lina i 100 ug/mL d'estreptomicina (37Gibco) sota humidificació del 5 per cent de CO2.

Viabilitat cel·lular.

La viabilitat de les cèl·lules B16F10 es va determinar mitjançant un assaig MTT, tal com es va descriure anteriorment.18 Breument, les cèl·lules B16F10 es van sembrar en plaques de 24-pous a una densitat d'1 × 104 cèl·lules per pou. Després de 24 h, les cèl·lules es van tractar amb les concentracions indicades d'extractes o fraccions de L. thunbergianus durant 48 h. A continuació, les cèl·lules es van incubar amb solució MTT durant 4 h i els cristalls de formazà reduïts es van dissoldre en DMSO. La solució resultant es va transferir a 96-plaques de pous i es va mesurar l'absorbància a 540 nm mitjançant el lector de microplaques multimode SpectraMax M5.

Determinació de les espècies reactives d'oxigen intracel·lular (ROS).

El nivell de ROS intracel·lular es va mesurar mitjançant un kit d'assaig de ROS cel·lular DCF/H2DCFDA (ab113851, Abcam), segons les instruccions del fabricant. Breument, les cèl·lules B16F10 es van sembrar en plaques de 48-pous a una densitat de 2 × 104 cèl·lules per pou. Després d'un cultiu de 24 h, les cèl·lules es van tractar durant 1 h amb les concentracions indicades d'extractor de L. thunbergianus o fraccions de dissolvent en un medi de cultiu que contenia albúmina sèrica bovina (BSA) al 0, 1 per cent sense vermell de fenol. Les cèl·lules es van incubar amb peròxid d'hidrogen 100 μM durant 30 min. Després de rentar-les amb PBS, les cèl·lules es van tractar amb 25 μMH2DCFDA en PBS durant 45 min. El nivell de ROS es va analitzar mitjançant un lector de microplaques (Synergy H1, Biotek, Vermont, EUA) equipat amb un filtre de fluorescència a 485/545 nm (longitud d'ona d'excitació/emissió). La intensitat mitjana de fluorescència relativa del control es va equiparar al 100 per cent, amb les condicions de tractament calculades proporcionalment.

Determinació del contingut de melanina.

El contingut de melanina es va determinar, tal com s'ha descrit anteriorment, amb algunes modificacions.19 Les cèl·lules de melanoma es van cultivar en una placa de sis pous durant 24 h. Es van tractar amb les concentracions indicades de l'extracte de L. thunbergianus o les seves fraccions de dissolvent durant 48 h més en presència de 100 nM -MSH. Després de rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat de Dulbecco, complementada amb clorur de calci i clorur de magnesi (D-PBS, Gibco), les cèl·lules resultants es van separar mitjançant la incubació amb una solució de tripsina-EDTA. Després de la centrifugació a 1000 rpm durant 3 min, el pellet cel·lular es va dissoldre en 150 μL de NaOH 1 M que contenia un 10 per cent de DMSO durant 1 h a 60 graus durant 1 h. El contingut de melanina es va determinar per l'absorbància a 405 nm mitjançant el lector de microplaques.

L'extracte de Cistanche inhibeix la melanina.

Determinació de l'activitat de la tirosinasa cel·lular en cèl·lules de melanoma.

L'activitat de la tirosinasa a les cèl·lules B16F10 es va examinar en funció de la quantitat de dopacrom produïda a partir de la reacció catalítica de la tirosinasa intracel·lular.20 Breument, les cèl·lules de melanoma es van cultivar en una placa de sis pous durant 24 h, seguida d'un tractament amb diferents concentracions de l'extracte de L.thunbergianus o el seu dissolvent. fraccions durant 48 h més la presència de 100 nM -MSH. Després de rentar dues vegades amb D-PBS fred, les cèl·lules es van lisar en 200 μL de tampó d'assaig de radioimmunoprecipitació (RIPA) (Sigma-Aldrich) que contenia inhibidors de proteasa i fosfatasa. Després de la centrifugació del lisat cel·lular recollit de cada pou a 15, 000 g durant 15 min, es van barrejar 100 μL del sobrenedant amb 100 μL de L-DOPA 1 mM en PBS (pH 6,8) seguit d'incubació durant 30 min a 37 graus. . L'absorbància del dopacrom es va mesurar a 475 nm mitjançant el microplateador. Les dades es van normalitzar amb la concentració de proteïnes determinada per l'assaig d'àcid bicinconínic.

Aïllament i caracterització de compostos bioactius mitjançant HPLC.

La HPLC es va realitzar a YL{{0}}(Young Lin Instrument, Corea), equipat amb una columna TC-C18 (4,6 mm, 250 mm i 5 μm, Agilent, EUA), inconjunció amb un sistema de gradient compost per dissolvent A (0,2 per cent d'àcid fòrmic) i dissolvent B (MeOH). La proporció de dissolvents de pendent es va establir a 0-5 min, 15 per cent B; 5−10 min, 15−20 per cent B; 10−15 min, 20−30 per cent B; 15−30 min, 30−40 per cent B; 30−37 min, 40−60 per cent B; 37−40 min, 60−100 per cent B; 40−45 min, 100 per cent B; 45−50min, 100−15 per cent B; i 50-55 min, 15 per cent B. Per identificar els ingredients en fraccions de dissolvents, la fase mòbil es va lliurar a un cabal d'1 ml/min, i la detecció de l'elució es va dur a terme a 330 nm. Per recollir les fraccions insolvents dels ingredients bioactius, la fase mòbil es va lliurar a un cabal de 15,0 ml/min i la detecció de l'elució es va dur a terme a 330 nm mitjançant prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Corea). ), equipat amb una columna prep-C18 (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, EUA), juntament amb un sistema de gradient compost per dissolvent A (0,2 per cent d'àcid fòrmic) i dissolvent B (MeOH). La proporció de dissolvents de pendent es va establir en 0-10 min, 10 per cent B; 10-20 min, 10-15 per cent B; 20−40 min, 15 per cent B; 40−60 min, 15−20 per cent B; i 60−70 min, 30 per cent B.

Modelatge Molecular.

L'estructura cristal·lina de la tirosinasa de bolets per al modelatge molecular era una agaricustirosinasa (PDB fa: 2Y9X) obtinguda del Protein DataBank (PDB). L'enzim es va preparar mitjançant el flux de treball de preparació de l'assistent de proteïnes incrustat al programa Maestro (Maestro, versió 11.9.011, Schrödinger, LLC, Nova York, NY, EUA, 2019). L'aigua i totes les altres molècules presents als fitxers PDB es van eliminar. L'acoblament molecular es va realitzar mitjançant el protocol d'acoblament d'ajust induït (IFD) (protocol d'acoblament d'ajust induït de Schrödinger Suite 2019), tal com es va informar anteriorment.21

Capacitat quelant del coure.

La capacitat quelant del coure dels compostos aïllats de L. thunbergianus es va determinar segons l'informe anterior.22 Cada derivat de l'àcid cafeoilquínic (10 μL) a la concentració indicada es va barrejar amb 280 μL de tampó d'acetat de sodi 50 mM (pH 6,0), 6 μL de solució de violeta de pirocatecol 4 mM preparada en el mateix tampó, i 10 μL d'1 ug/μL CuSO4·5H2O. La desaparició del color blau es va observar mesurant l'absorbància a 632 nm amb el lector de microplaques multimode SpectraMax M5. Es va utilitzar aigua com a control en lloc de mostra. El percentatge d'activitat quelant del coure es va calcular a partir de l'absorbància a 632 nm, que és el següent

capacitat quelant del coure (percentatge)=1− (Una mostra/Un control)×100 (2)

Anàlisi estadística.

Totes les dades d'aquest estudi es van expressar com la mitjana ± desviació estàndard (DE) de tres experiments independents. Les anàlisis estadístiques es van realitzar amb GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). Les diferències entre els valors mitjans del control i els grups exposats es van analitzar mitjançant una anàlisi de variància unidireccional (ANOVA) seguida del post hoctest de Dunnett. El llindar de significació estadística de totes les anàlisis va ser p < 0,05="" (de="" dues="">

CONCLUSIONS

En aquest estudi, vam demostrar que l'extracte de L. thunbergianus elimina els radicals ABTS i presenta un potent efecte inhibidor sobre la biosíntesi de melanina sense citotoxicitat significativa. L'ingredient abioactiu existent a L. thunbergianus i inhibidor de la melanogènesi es va aïllar a la fracció n-BuOH. A més, vam trobar que els tres derivats de l'àcid cafeoilquínic són compostos principals que existeixen a la fracció n-BuOH i que 5-àcid cafeoilquínic és un ingredient important per a suprimir la melanogènesi a les cèl·lules de melanoma inhibint l'activitat de la tirosinasa cel·lular. Aquí, vam aïllar un inhibidor de compostos naturals 5-àcid cafeoilquínic de l'extracte de L.thunbergianus per prevenir la hiperpigmentació i vam revelar el seu mecanisme d'inhibició que subjau a la melanogènesi. Així, els nostres resultats suggereixen que l'àcid cafeoilquínic i la fracció n-BuOH aïllada de L. thunbergianus poden ser útils en cosmètics com a agents blanquejants de la pell.

rodanxes de cistanche