Crisogenamida A d'un fong endofític associat a Cistanche Deserticola i el seu efecte neuroprotector a les cèl·lules SH-SY5Y
Mar 03, 2022
Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com
Introducció
Cistanche deserticola(YC Ma) és una planta parasitària originària del nord-oest de la Xina. La tija d'aquesta planta és una important medicina tradicional xinesa i s'utilitza per al tractament de la deficiència renal i la neurastènia ("The Chinese Medicine Dictionary", 1977). Glicòsids feniltanoides deCistanchedeserticolaS'ha informat que tenen activitats per prevenir i tractar malalties dels nervis cranials i eliminar els radicals lliures [1, 2]. A partir del fet que els fongs endofits poden produir nous components medicinals i els mateixos/semblants que els de les plantes hostes, la recerca de nous compostos actius a partir de fongs endofits de plantes medicinals importants mostra el valor per al desenvolupament de nous recursos medicinals. En el curs de la nostra recerca de nous compostos neuroprotectors a partir de fongs endofits deCistanchedeserticolarecollides de Mongòlia Interior al nord-oest de la Xina, es van examinar tres soques actives mitjançant cèl·lules SH-SY5Y. Entre ells, el brou de cultiu del fong núm. 005, autenticat com a Penicillium chrysogenum, va mostrar un efecte important de protecció dels neuròcits contra la mort cel·lular induïda per l'estrès oxidatiu a les cèl·lules SH-SY5Y. Els estudis sobre els components actius d'aquesta soca van conduir a l'aïllament de la crisogenamida A (1) (Fig. 1) mitjançant un procediment d'aïllament guiat per bioassaig. A més, es van aïllar quatre compostos coneguts i es van identificar com a circumdat a G (2) [3], 2-[({2-hidroxipropionil) amino] benzamida (3) [4], 2- ,3-dihidrosorbicil·lina (4) [5] i (9Z,12Z)-2,{3-dihidroxipropil octadeca{-9,12-dienoat (5) [6] , mitjançant la comparació de les seves dades espectroscòpiques amb les de la literatura. Aquí, informem sobre l'aïllament, la identificació i l'efecte neuroprotector de la crisogenamida A.
Materials i mètodes
Material fúngic Es va aïllar una mostra de Penicillium chrysogenum núm. 005 de l'arrel de C. deserticola recollida de Mongòlia Interior al nord-oest de la Xina. A l'agar dextrosa de patata l'aspecte macroscòpic era de colònies esteses, llises, vellutates, de color blau verd, de vegades cobertes de hifes lleugeres; la superfície de les colònies sovint mostrava nombroses gotes grogues clares; groc invers. Es va dur a terme una cerca GenBank amb la seqüència del gen 18S d'ADN ribosòmic del número 005 (1676 nucleòtids; número d'adhesió del Gen-Bank EU203859). Els resultats indiquen una espècie de Penicillium chrysogenum com la coincidència més propera. Sobre la base del seu aspecte macroscòpic i de la seqüència del gen 18S rDNA, No.005 és una soca de Penicillium chrysogenum.
Fermentació i Extracció
El fong es va cultivar en condicions estàtiques a 24 graus durant 3{{10}} dies en matràs cònics de 35 1000-ml que contenien un medi líquid (30{{2{{22} }}} ml/flascó) compost de glucosa (10 g/litre), maltosa (20 g/litre), manitol (20 g/litre), glutamat monosòdic (10 g/litre), KH2PO4 (0,5 g/litre), MgSO4·7H2O (0,3 g/litre), licor de blat de moro (1,0 g/litre) i extracte de llevat (3,0 g/litre) i aigua de mar després d'ajustar el seu pH a 7,0. El brou sencer fermentat (10,5 litres) es va extreure tres vegades amb EtOAc per donar una solució EtOAc, que es va concentrar a pressió reduïda per donar un extracte brut (9,5 g).
Purificació
L'extracte brut (9, 5 g) es va separar en 15 fraccions en una columna de gel de sílice mitjançant una elució en gradient d'èter de petroli/Me2CO. La fracció 2, eluïda amb èter de petroli/Me2CO 8:2, es va recristal·litzar a partir de MeOH, donant-ne 3 com a agulles incolores (8,{{10}} mg). La fracció 3 (19,{{30}} mg), eluïda amb 7:3 èter de petroli/Me2CO, es va separar encara més per una columna de fase inversa (RP18, 40 6{{38). }} mm, Merck; MeOH - H2O 3:2→4:1→MeOH) per oferir fr. 3 7 (8,0 mg), que es va purificar mitjançant PHPLC extensiu (60 per cent de MeOH que conté {{7{0}}, 1 per cent de TFA, 4.{{77} } ml/minut) per donar-ne 4 (2.{{80}} mg). La fracció 4 (26,0 mg), eluïda amb èter de petroli/Me2CO 6:4, es va separar encara més per una columna de fase inversa (RP18, 40 60 mm, Merck; MeOH - H2O 3:2→4:1→MeOH) per oferir fr. 4-3 (5,4 mg) i fr. 4-9 (7,6 mg). Aleshores, el fr. 4-3 es va separar mitjançant PHPLC extens [paquet YMC ODS (A), 10 250 mm, 5 mm, 4,0 ml/minut] (60 per cent de MeOH, 4,0 ml/minut) per obtenir 2 (1,0 mg) i el fr. 4-9 es va separar mitjançant PHPLC extensiu (80 per cent de MeOH, 4,0 ml/minut) per obtenir 1 (4,0 mg) i 5 (2,6 mg). 1: obtingut com a sòlid groc pàl·lid; [a]D 25 24,5 graus (c 0,155, MeOH); UV (MeOH) l màx 208, 251 nm; CD (MeOH) (vegeu la figura 4); IR (KBr) n màx. 3433, 3200, 3076, 2928, 2862, 1677, 1440, 1370, 1324, 1188, 1029 cm 1 ; 1H- i 13C-RMN (vegeu la taula 1); HRESI-MS m/z 448,2951 [MH] (calculat per a C28H38N3O2, 448,2964)
Efecte d'eliminació radical de DPPH
Es va afegir una solució de MeOH (160 ml) de diferents concentracions de mostra (1,0 mg/ml 0,0001 mg/ml) a 40 ml de DPPH (1,1- difenil{{8 }}picrhidrazil; Sigma) MeOH soln (1,5 10 4 M). Després de barrejar suaument i deixar durant 30 minuts a temperatura ambient, es va mesurar la densitat òptica a 520 nm mitjançant un espectrofotòmetre. L'activitat antioxidant de cada mostra es va expressar en termes d'IC50 (mg/ml o mM necessari per inhibir la formació de radicals DPPH en un 50 per cent) i es va calcular a partir de la corba d'inhibició de la dosi logarítmica.
neuroprotector de cistanche deserticola
Cultiu cel·lular i tractament farmacològic
Les cèl·lules SH-SY5Y del neuroblastoma humà es van cultivar en un medi DMEM i es van mantenir a 37 graus en una atmosfera humidificada amb un 5.0 per cent de CO2. Aquestes suspensions cel·lulars (180 ml) amb una densitat de 5*104 ml de cèl·lules{-1 es van sembrar en plaques de microtitulació de 96- pous i es van incubar durant 24 hores al condició anterior. Es va afegir una solució de crisogenamida A (2, 0 ml en DMSO) a diferents concentracions a cada pou excepte els grups de control i model i es va incubar més durant 1 hora en les mateixes condicions. Es va afegir H2O2 (Sigma Chemical Co., MO, EUA) per induir l'apoptosi a les cèl·lules SH-SY5Y a una concentració final de 200 mM durant 24 hores. La viabilitat cel·lular es va determinar mitjançant un assaig MTT. El MTT dissolt en solució salina tamponada amb fosfat es va afegir al final de la incubació a una concentració final de 5, 0 mg/ml (PBS) i després es va incubar a 37 graus durant 4 hores. Descartant el sobrenedant, es va dissoldre el producte formazà resultant.
Resultats i discussió
1 es va obtenir com un sòlid groc pàl·lid. La fórmula molecular es va determinar com a C28H37N3O2 per HRESI-MS (observat [MH] a m/z 448,2951, anomenat [MH] C28H38N3O2, 448,2964). L'espectre IR va suggerir la presència de NH (3433 i 3200 cm 1 ) i grup(s) carbonil (1677 cm-1 ). L'espectre 1H-RMN (taula 1) registrat a DMSO-d6 va revelar tres grups metil (d H 0.62, 0,87, 0,98) i dos senyals de protons intercanviables (d H 10,36 i 8,29). A més, tres senyals aromàtiques acoblades d'ortos (d H 6,90 dd, J 7,3, 7,3 Hz, 6,94 d, J 7,3 Hz i 7,18 J 7,3 Hz) van indicar un anell de benzè trisubstituït 1,23-. Els protons de metilè (d H 3,23) acoblats amb un protó olefínic (d H 5,27), juntament amb dos metils vinílics (d H 1,67 i 1,70), van indicar la presència d'un grup 3-metil-2-butenil a 1. Les connectivitats d'un enllaç d'aquests protons i altres 14 protons de metilè i/o metilè es van establir mitjançant un experiment HMQC. Els espectres 13C-NMR i DEPT (Taula 1), que van revelar 28 senyals, també van confirmar la presència d'aquests dos fragments [anell de benzè trisubstituït (dC 123,6 CH, 120,8 CH, 127,7 CH, 122,1 QC i 140,4 QC) {79}}metil-2-butenil (dC 28 CH2, 121,9 CH, 132,3 QC, 25,5 CH3 i 17,7 CH3)]; a més, dos carbonils (dC 183,1 i 172,3), quatre carbonis sp3 quaternaris (dC 46,5, 58,7, 60,4 i 62,3), dues sp3 metines (dC 46,1 i 58,7) i sis sp3 metilens (dC 20,3, 34,3, 3,3, 3,4, 3,4, 3,3 dC). 35,2, 39,9 i 64,9) també es van observar. Com que es van comptabilitzar 6 de cada 12 insaturacions, es va deduir que 1 contenia sis anells. Una avaluació addicional d'aquestes dades espectrals, juntament amb els resultats d'1 H-1 H COSY i HMBC, van revelar que 1 està estretament relacionat amb el grup de marcfortina de metabòlits fúngics [7]. La interpretació de les correlacions HMBC (Fig. 2) va indicar la presència de l'estructura parcial A (correlacions HMBC 1-NH a C-8 i C-9; H{-6 a C{{ 136}}; H-5 a C{-7 i C{-9; H-26 a C{-28 i C{-8 i H{{143 }} a C-29 i C{-30) i B (correlacions HMBC H-10 a C{-3, C{-22, C-21, C-11, C-12; H-20 a C-13, C{-18, C{-22, C{-11 i { {157}}NH a C-13, C{-10) i C, un anell G de sis membres [8] amb un carboni metilat a C-17 (correlacions HMBC H{{ 163}} a C-17, C{-16). La connectivitat de la subestructura A a B a C-3 estava suportada per les correlacions clau HMBC de H-4 i 1-NH a C-3; H-10 a C{-2 i C-9. La connexió entre l'estructura B i C amb un àtom de nitrogen es va deduir per les correlacions clau HMBC de H-12 a C-17 i C{-13 i comparant els seus corresponents desplaçaments químics de C{{176 }} i C-17 (dC 64,9 i 58,7). L'anàlisi anterior va indicar que 1 tenia una estructura similar a la marcfortina A excepte per les diferències de la cadena lateral a l'anell de benzè i el metil a C-17 de l'anell G de sis membres. Així, l'estructura bruta d'1 es va assignar tal com es mostra a la figura 1
L'estereoquímica relativa d'1 es va dilucidar a partir de les dades de NOESY (Fig. 3). Estudis anteriors han revelat que els compostos de tipus alcaloide 2-oxindol adoptaven una conformació en què l'anell central de cinc membres és ortogonal al pla de la subunitat oxindol [9].
Les correlacions NOESY entre H{{0}} i H-10a, H-25 i entre 19-NH i H{-10a van indicar que tots dos eren a la cara de l'anell de ciclopentanona que els orienta cap a H-4, fixant l'estereoquímica relativa a C-3 tal com es mostra. Les interaccions NOESY entre H-21, H-12a, H-10b, H{-23 i H{-24 van col·locar els substituents corresponents junts a la cara frontal de l'anell de ciclopentanona. L'estereoquímica relativa proposada per a 1 està d'acord amb les característiques rellevants de l'estereoquímica relativa de la marcfortina A [7]. L'efecte Cotton a 200-250 nm sorgeix d'una transició np* dels enllaços amida de dicetopiperazina, que és diagnòstic per al nucli de biciclo-[2.2.2] diazaoctà dicetopiperazina [10, 11]. L'espectre CD d'1 (Fig. 4) es va correlacionar amb les regions rellevants de la de -brevianamida A [11]. Així, l'estereoquímica absoluta d'1 hauria de ser 3S, 11S, 13S, 17S, 21R i se li va donar el nom de crisogenamida A. L'avaluació preliminar de l'efecte protector de la crisogenamida A sobre els neuròcits es va avaluar mitjançant la mort cel·lular induïda per l'estrès oxidatiu en SH-SY5Y. cèl·lules mitjançant un assaig MTT. L'activitat d'eliminació de radicals lliures de la crisogenamida A es va examinar per primera vegada utilitzant DPPH com a donant de radicals lliures. A diferència de la vitamina C (IC50: 29,0 mM), la crisogenamida A no va mostrar cap capacitat (IC50 superior o igual a 100 mM) per eliminar els radicals lliures de DPPH a una concentració de fins a 100 mM. Mentrestant, vam provar si la crisogenamida A protegia les cèl·lules contra la mort cel·lular induïda per l'estrès oxidatiu en el neuroblastoma humà SH-SY5Y
cèl · lules. L'estrès oxidatiu del peròxid d'hidrogen va provocar una disminució de la viabilitat cel·lular en un 43 per cent en comparació amb el grup control. La crisogenamida A va inhibir la mort cel·lular induïda pel peròxid d'hidrogen millorant la viabilitat de les cèl·lules en un 59,6 per cent a una concentració d'1*10-4 mM. Aquestes dades van suggerir que l'amida del crisogen A mostrava un efecte de protecció dels neuròcits contra la mort cel·lular induïda per l'estrès oxidatiu, no a través de la seva activitat antioxidant. S'han aïllat alcaloides indol que posseeixen un sistema d'anells biciclo [2.2.2] diazaoctà inusual de diferents gèneres de fongs com Aspergillus [12, 9, 13], Penicillium [14, 16] i Malbranchea [17]. 1 era un nou membre d'aquest grup de compostos, posseïa un esquelet que s'esperava que fos un intermedi en la biosíntesi dels administradors de citrina A i B, informats com una nova classe d'alcaloides de dolinona d'espiroïna pentacíclica el 2005 [18]. Des del punt de vista estructural, és important assenyalar que 1 és una estructura única amb metilació a la posició C-17 i un fragment 2- oxindol que posseeix una unitat d'isoprè a C-7. Alguns d'aquests alcaloides indol aïllats fins ara presenten una potent activitat antiparasitària [19], inhibició de cèl·lules tumorals humanes [13] i citotoxicitat [10]. Segons el que sabem, és el primer informe de neuroprotecció per part d'aquest tipus d'alcaloides.
ReconeixementAquest treball va comptar amb el suport financer del Fons Nacional de Ciències Naturals de la Xina (núm. 30472136).
neuroprotector de cistanche deserticola: anti-Alzheimer
Cistanche deserticola té molts efectes, feu clic aquí per saber-ne més
Referències
Li LL, Wang XW, Wang XF. Peroxidació antilipídica i acció antiradiació dels glucòsids enherba Cistanches. China J Chin Mater Med 22: 364–367 (1997)
Xie JH, Wu CF. Efecte de l'extracte etanòlic deCistanche deserticolasobre el contingut de neurotransmissors monoamines al cervell de rata. Chin Trad Herb Drugs 24: 417–419 (1993)
Dai JR, Carte BK, Sidebottom PJ, Yew ALS, Ng SB, Huang Y, Butler MS. Circumdatina G, un nou alcaloide del fong Aspergillus ochraceus. J Nat Prod 64: 125–126 84 Fig. 2 Correlacions clau HMBC i 1 H-1 H COSY de 1. Fig. 3 NOESYs d'1. Fig. 4 Espectre CD de 1. (2001)
Kettering M, Sterner O, Anke T. Antibiòtics en la comunicació química dels fongs. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences 59: 816–823 (2004)
Trifonov LS, Bieri JH, Prewo R, Dreiding AS, Hoesch L, Rast DM. Aïllament i dilucidació de l'estructura de tres metabòlits de Verticillium intertextum: sorbicil·lina, dihidrosorbicil·lina i bisvertinoquinol. Tetraedre 39: 4243–4256 (1983)
Zhang GL, Xing QY, Zhang MZ. Glicolípids de Mirabilis Himalaya. Phytochemistry 45: 1213–1215 (1997)
Polonsky J, Merrien MA, Prange T, Pascard C, Moreau S. Aïllament i estructura (anàlisi de raigs X) de marcfortine A, un nou alcaloide de Penicillium roqueforti. JCS Chem Comm 13: 601–602 (1980)
Lee BH, Kornis GI, Cialdella JI, Clothier MF, Marshall VP, Martin DG, McNally PL, Mizsak SA, Whaley HA, Wiley VH. Hidroxilació microbiològica en sis àtoms de carboni individuals de marcfortina A. J Nat Prod 60: 1139–1142 (1997)
Whyte AC, Gloer JB, Wicklow DT, Dowd PF. Esclerotiamida: un nou membre de la classe de les paraherquamides amb una potent activitat antiinsectà dels esclerocis d'Aspergillus sclerotiorum. J Nat Prod 59: 1093–1095 (1996)
Kato H, Yoshida T, Tokue T, Nojiri Y, Hirota H, Ohta T, Williams RM, Tsukamoto S. Notoamides AD: alcaloides d'indol prenilats aïllats d'un fong derivat del mar, Aspergillus sp. Angew Chem Int Ed 46: 2254–2256 (2007)
Williams RM, Kwast E, Coffman H, Glinka T. Biogènesi notable i enantio-divergent de brevianamida A i B. J Am Chem Soc 111: 3064–3065 (1989)
Banks RM, Blanchflflower SE, Everett JR, Manger BR, Reading C. Novel metabòlits antihelmíntics d'una espècie d'Aspergillus: les aspergillimides. J Antibiot 50: 840–846 (1997)
Qian-Cutrone J, Haung S, Shu YZ, Vyas D, Fairchild C, Menendez A, Krampitz K, Dalterio R, Klohr SE, Gao Q. J Am Chem Soc 124: 14556–14557 (2002)
Wilson BJ, Yang DTC, Harris TM. Producció, aïllament i estudis preliminars de toxicitat de brevianamida A a partir de cultius de Penicillium Viridicatum. Appl Microbiol 26: 633–635 (1973)
Birch AJ, Russell RA. Estudis en relació amb la biosíntesi XLIV. Elucidacions estructurals de brevianamides B, C, D i F. Tetrahedron 28: 2999–3008 (1972)
Liesch JM, Wichmann CF. Agents antinematodals i antiparasitaris nous de Penicillium Charles. II. Determinació de l'estructura de les paraherquamides B, C, D, E, F i G. J Antibiot 43: 1380–1386 (1990) 17. Martinez-Luis S, Rodriguez R, Acevedo L, Gonzalez MC, Lira-Rocha A, Mata R Malbrancheamida, un nou inhibidor de la calmodulina del fong Malbranchea aurantiaca. Tetraedre 62: 1817–1822 (2006)
Mishima T, Tsuda M, Kasa Y, Ishiyama H, Fukushi E, Kawabata J, Watanabe M, Akao K, Kobayashi J. Absolute stereochemistry of citrinadins A and B from a marine-derived fungus. J Org Chem 70: 9430–9435 (2005)
Lopez-Greta MP, Gonzalez MC, Ciavatta L, Ayala I, Moya P, Primo J. Activitat insecticida de paraherquamides, paraherquamides, including paraherquamide H and paraherquamide I, Two New Alcaloids Isolated from Penicillium cluniae. J Agric Food Chem 54: 2921–2925 (2006)
neuroprotector de cistanche deserticola: malaltia anti-Alzheimer i malaltia de Parkinson
