Els deserticolapolisacàrids de Cistanche alleugen la disminució cognitiva dels ratolins model d'envelliment mitjançant la restauració de l'eix microbiota intestinal-cervell

Contacte: ali.ma@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

RESUM

L'evidència recent suggereix que les alteracions en l'eix microbiota intestinal-cervell poden provocar un deteriorament cognitiu ambenvelliment. En el present estudi, vam observar que l'administració prolongada de D-galactosa a ratolins va provocar un declivi cognitiu, disbiosi microbiana intestinal, inflamació perifèrica i estrès oxidatiu. En aquest model de declivi cognitiu relacionat amb l'edat,Polisacàrids de Cistanche deserticola(CDPS) va millorar la funció cognitiva en ratolins tractats amb D-galactosa restaurant l'homeòstasi microbiana intestinal, reduint així l'estrès oxidatiu i la inflamació perifèrica. Els efectes beneficiosos del CDPS en aquests ratolins model d'envelliment es van abolir mitjançant l'ablació de la microbiota intestinal amb antibiòtics o la immunosupressió amb ciclofosfamida. Els perfils metabolòmics sèrics van mostrar que els nivells de creatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, àcid úric i prolina estaven alterats en elenvellimentratolins model, però van ser restaurats per CDPS. Aquestes troballes ho van demostrarCDPSmillora la funció cognitiva en una D-galactosa induïdaenvellimentmodel en ratolins mitjançant la restauració de l'homeòstasi de l'eix cerebral de la microbiota intestinal, que va alleujar un desequilibri d'aminoàcids, la inflamació perifèrica i l'estrès oxidatiu.CDPSaixí mostra el potencial terapèutic per als pacients amb trastorns de la memòria i l'aprenentatge, especialment els relacionats amb la disbiosi intestinal.

Feu clic a Cistanche efecte secundari de l'anti-envelliment

INTRODUCCIÓ

L'administració prolongada de D-galactosa (D-gal) i sals de beril·li indueix l'envelliment en models animals experimentals i cultius de cèl·lules primàries in vitro i s'utilitza per identificar els mecanismes subjacents al procés d'envelliment natural [1–4]. Estudis anteriors mostren que la disminució cognitiva de la D-galactosa induïdaenvellimentEls ratolins model es relacionen amb la reducció dels nivells de proteïnes del factor de creixement nerviós (NGF) i l'augment de les espècies reactives d'oxigen (ROS) al cervell, ambdues causes degeneració de les neurones de l'hipocamp i reducció de la neurogènesi [3, 4]. Estudis recents també han demostrat que la composició i el nombre de microbiota intestinal humana canvien significativament durant laenvellimentprocés[5].

Cistanchedeserticola és una herba que creix principalment a la regió desèrtica del nord-oest de la Xina i que s'utilitza en la medicina tradicional xinesa. Es coneix comunament com "ginseng del desert". Els extractes de Cistanche deserticola contenen diversos compostos farmacològicament actius, com ara glicòsids feniletanoides, iridoides, lignosa, oligosacàrids, polisacàrids i aminoàcids; aquests compostos estan associats amb propietats antiinflamatòries, antioxidants, antisenescents, neuroprotectores i immunomoduladores [6, 7]. Per exemple, els polisacàrids extrets de Cistanche deserticola s'han utilitzat en la medicina tradicional xinesa per tractar el càncer colorectal [8]. S'ha aïllat una àmplia gamma de polisacàrids feblement tòxics amb bioactivitats útils de diversos organismes, com el polisacàrid de Chuanqiong, el polisacàrid de Ganoderma lucidum i el polisacàrid de Lycium barbarum [9–11]. CDA 0.05 és un galactoglucà aïllat deCistanchedeserticola que promou el creixement de diversos bacteris intestinals beneficiosos, incloses diverses espècies de Bacteroides i Lactobacillus [12].

Els mecanismes subjacents de la normalitatenvellimentEl procés també està implicat en diverses malalties humanes com ara trastorns neurodegeneratius, aterosclerosi coronària, diabetis tipus 2 (DM2) i hipertensió [13, 14]. Estudis recents han demostrat que els canvis en la flora intestinal tenen un paper important en l'envelliment humà [15]. Diversos estudis han demostrat que l'administració prolongada de D-galactosa en ratolins i rates experimentals imita el procés d'envelliment normal i és un model útil per estudiarenvellimentfenotips relacionats, com ara la disminució de la cognició [16]. A més, els ratolins model d'envelliment induït per D-galactosa mostren canvis en la composició de la microbiota intestinal [17]. Per tant, vam plantejar la hipòtesi que els canvis en la composició de la microbiota intestinal poden causar un declivi cognitiu en els ratolins model d'envelliment induït per la D galactosa i vam investigar siPolisacàrids de Cistanche deserticola(CDPS) pot alleujar el declivi cognitiu restaurant la disbiosi de la microbiota intestinal.

RESULTATS

Els ratolins model d'envelliment induït per la D-galactosa demostren un declivi cognitiu i una disbiosi microbiana intestinal

Es va analitzar el rendiment del comportament dels ratolins de tipus salvatge (WT) i els tractats amb 150 mg D-gal per Kg de pes corporal durant 2 mesos (model o Mod) mitjançant el reconeixement d'objectes nous i proves de laberint d'aigua de Morris (MWM). Els valors de l'índex preferent a la prova de reconeixement d'objectes es van reduir significativament als ratolins del grup Mod en comparació amb els ratolins del grup WT (figura 1A, 1B). Els resultats de la prova MWM van mostrar que el temps de latència d'escapament després del sisè dia va augmentar significativament al grup Mod en comparació amb el grup WT (figura 1C, 1D). A més, els encreuaments de la plataforma objectiu i els temps de natació dins del quadrant objectiu es van reduir significativament al grup Mod en comparació amb el grup WT (Figura 1E, 1F). Aquests resultats van demostrar una disminució significativa de les capacitats d'aprenentatge i memòria de la D gal induïdaenvellimentratolins model.

A continuació, es van analitzar les diferències en l'abundància i la composició dels fils, gèneres i espècies microbians intestinals a les mostres fecals dels grups de ratolins Mod i WT mitjançant dades de seqüenciació d'ARN ribosòmic (ARNr) 16S de mostres fecals. La flora intestinal predominant en els ratolins del grup WT i Mod eren Firmicutes i Bacteroides. Tanmateix, l'abundància de Bacteroides es va reduir significativament i l'abundància de Firmicutes va augmentar significativament al grup Mod en comparació amb el grup WT (figura 2A). A continuació, vam realitzar una anàlisi discriminant lineal (LDA) per determinar les puntuacions de la mida de l'efecte LDA (LEfSe) seguides de les proves de Kruskal-Wallis i Wilcoxon per avaluar l'abundància relativa de diferents tàxons als ratolins del grup WT i Mod. Els resultats de l'LDA es mostren a la figura 2B. A més, vam construir cladogrames que mostraven l'enriquiment diferencial de diversos gèneres i espècies pertanyents als phyla Bacteriodes i Firmicutes als grups WT i models (figura 2C). En general, els nostres resultats van demostrar una capacitat cognitiva deteriorada i una disbiosi microbiana intestinal en els ratolins model d'envelliment induït per D-galactosa.

El tractament amb CDPS millora la capacitat cognitiva dels ratolins model d'envelliment induït per D-gal

Hem analitzat siCDPSEl tractament alleuja el declivi cognitiu induït per D-galenvellimentratolins model. Durant els 2 mesos de l'administració, es va mesurar el pes corporal cada dos dies. Els pesos corporals del model i dels grups de ratolins CDPS eren similars (figura 3A). Realitzar experiments de comportament després de l'última dosi. El reconeixement d'objectes nous i els resultats de la prova del laberint d'aigua de Morris van mostrar que la memòria a curt termini era significativament més alta en els grups de ratolins CDPS en comparació amb el grup de ratolins model; La memòria a llarg termini del grup de ratolins CDPS era més alta, però estadísticament insignificant en comparació amb el grup de ratolins model (figura 3B, 3C). Això va suggerir que el tractament amb CDPS va abrogar la pèrdua de memòria de reconeixement d'objectes a curt termini en ratolins tractats amb D-gal.

L'aprenentatge espacial i la memòria d'aquests ratolins es van avaluar mitjançant la prova del laberint d'aigua de Morris, i els resultats van mostrar que els temps de latència d'escapament delCDPSEl grup de ratolins era comparable al grup de ratolins WT i significativament més curt que el grup de ratolins Mod (figura 3D). A més, els temps de latència d'escapament van ser significativament més baixos en el sisè dia posterior a l'administració de CDPS en comparació amb el grup model (figura 3E). El temps de natació dins del quadrant objectiu va ser significativament més gran als grups CH i CM en comparació amb el grup model. El grup CL és superior al grup model, però no té significació estadística (figura 3F). A més, el nombre d'encreuaments de plataformes va ser significativament més gran als grups CM i CL en comparació amb el grup model. Tanmateix, el grup CH és superior al grup model i no té significació estadística (figura 3G). Aquests resultats van demostrar que el tractament amb CDPS va millorar l'aprenentatge i la memòria espacials en els ratolins model d'envelliment induït per D-gal.

El tractament amb CDPS restaura l'homeòstasi de la composició de la microbiota intestinal en els ratolins model d'envelliment de D-galactosa

Els monosacàrids i els polisacàrids són els nutrients essencials necessaris per al creixement dels bacteris [18-21]. També s'informa queCDPSregula la composició de la microbiota intestinal [22]. Per tant, es va analitzar si els tractaments amb CDPS van alleujar la disbiosi microbiana intestinal en els ratolins del grup model mitjançant l'avaluació de les dades de seqüenciació d'ARNr 16S de mostres de femta dels grups de ratolins WT, model i CDPS.

Primer, vam calcular els índexs de diversitat alfa per avaluar la riquesa global de la microbiota fecal i la diferència estructural entre aquests grups. Es van analitzar índexs de diversitat alfa (-diversitat) com les espècies observades, els valors dels índexs Shannon, Chao 1, ACE i Simpson per determinar els canvis en la composició de diverses espècies bacterianes a les mostres de femta de diferents grups murins. Els índexs de diversitat (espècies observades, índexs Shannon, Chao 1, ACE i Simpson) van ser més alts en el WT iCDPSgrups de ratolins en comparació amb el grup model, però només es va observar significació estadística per als valors de l'índex Chao 1 entre el grup CM i el grup Mod. Va indicar que l'administració amb CDPS augmenta la riquesa del microbioma (figura 4A-4E). A continuació, vam analitzar els índexs de diversitat per identificar les diferències en les espècies microbianes intestinals entre els grups de ratolins WT, model i CDPS mitjançant l'escala multidimensional no mètrica (NMDS), l'anàlisi de coordenades principals (PCoA) i l'anàlisi de components principals (PCA) . La PCA va mostrar variacions en la composició microbiana intestinal dels ratolins del grup model durant elenvellimentprocés, inclosa la reducció de dimensions i el manteniment de patrons i tendències (figura 4F). Les diferències en la microbiota fecal entre els grups WT, model i CDPS es van identificar a partir de la PCoA de les distàncies UniFrac no ponderades per als gens rRNA 16S (figura 4G). L'anàlisi de agrupació va mostrar diferències significatives en NMDS entre el grup model i els grups WT i CDPS (figura 4H).

Vam avaluar els 10 principals phyla de la microbiota intestinal i vam trobar que l'abundància de la phyla Bacteroides era significativament més alta al grup CH, CM i CL en comparació amb el grup model (figura 4I). Això va suggerir que CDPS va restaurar l'homeòstasi de la microbiota intestinal en ratolins tractats amb D-gal. Els cladogrames van mostrar l'enriquiment diferencial de diversos gèneres i espècies pertanyents a phyla Bacteriodes i Firmicutes en els grups WT, model i CDPS (figura 4J). Com es mostra als mapes de calor,CDPSEls tractaments van reduir les abundàncies relatives de Thermoplasmata, Bacils, Actinobacteria, Fusobacteriia no identificats i Elusimicrobia no identificats i van augmentar les abundàncies relatives de Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaselolinechia i Esiperoline{1} no identificats. }Cianobacteris en comparació amb el grup model (figura 4K). Aquests resultats van demostrar que el tractament amb CDPS va restaurar significativament l'homeòstasi de la microbiota intestinal en els ratolins model d'envelliment induït per D-gal.

El tractament amb CDPS alleuja la neurodegeneració en els ratolins model d'envelliment induït per D-gal reduint l'estrès oxidatiu

A continuació, vam analitzar els efectes del CDPS sobre la inflamació mitjançant l'anàlisi dels nivells sèrics de citocines proinflamatòries (IL-2 i TNF-) i de citocines antiinflamatòries (IL-4 i IL{-10). ) en diferents grups de ratolins. Els nivells sèrics d'IL-2 i TNF- eren significativament més baixos i els nivells sèrics d'IL-4 i IL{-10 eren significativament més alts al grup CH, CM i CL en comparació amb el grup model . Ho va demostrarCDPSté efectes antiinflamatoris (figura 5A-5D).

L'estrès oxidatiu és causat per l'augment de la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i és un dels principals factors que promouenenvelliment[23]. Per tant, es van analitzar els efectes del CDPS sobre l'estrès oxidatiu en el model de ratolí d'envelliment induït per D-gal avaluant els nivells sèrics de l'enzim antioxidant, SOD, i el producte de peroxidació lipídica, malondialdehid (MDA). Els nivells sèrics de MDA eren significativament més alts i els nivells sèrics de SOD es van reduir significativament al grup Mod en comparació amb el grup WT, però,CDPSel tractament va revertir aquests efectes (figura 5E, 5F). Aquests resultats van demostrar que l'estrès oxidatiu va ser elevat en els ratolins model d'envelliment induït per D-gal, però es va reduir amb el tractament amb CDPS.

A més, es van avaluar els nivells d'estrès oxidatiu als teixits cerebrals mitjançant l'anàlisi dels nivells del producte proteic oxidat avançat (AOPP), la peroxidació lipídica directa (LPO) i MDA, així com les activitats d'enzims antioxidants com la glutatió peroxidasa (GSH-Px). ) i la superòxid dismutasa (SOD) en els homogeneïtats del teixit cerebral. Els cervells dels ratolins del grup Mod van mostrar activitats significativament reduïdes de SOD i GSH-PX i augmentar significativament els nivells d'AOPP, LPO i MDA en comparació amb el grup WT, però aquests efectes es van invertir al grup CH, CM i CL (Figura 6A-6E). ).

A més, vam realitzar una tinció histològica de les seccions del cervell amb taques H&E i Nissl per avaluar els efectes protectors deCDPSen els cervells de D-gal induïtenvellimentratolins model. Els ratolins del grup Mod van mostrar una reducció significativa del nombre i el volum neuronals, augment de la bretxa entre neurones, disposició irregular de les neurones i picnosi nuclear a la regió de l'hipocamp CA1 en comparació amb el grup WT, però aquests canvis patològics es van reduir significativament amb els tractaments CDPS ( Figura 6F). Aquests resultats van demostrar que els tractaments amb CDPS van reduir significativament l'estrès oxidatiu i la patologia cerebral en els ratolins model d'envelliment induït per D gal.

El tractament amb CDPS redueix la inflamació perifèrica i l'estrès oxidatiu mantenint l'homeòstasi microbiana intestinal en ratolins model induïts per D-gal

A continuació, es va analitzar si els canvis en la composició de la microbiota intestinal estaven associats amb un augment de la inflamació perifèrica i l'estrès oxidatiu durant l'envelliment. Per a això, hem utilitzat un còctel de triple antibiòtic (grup ABX) o ciclofosfamida (grup Cy; també vegeu Materials i mètodes) per extirpar la microbiota intestinal o induir la immunosupressió en els pacients tractats amb CDPS.envellimentratolins model. El tractament amb antibiòtics va abrogar els efectes beneficiosos del tractament amb CDPS en els ratolins model d'envelliment. Vam observar un deteriorament de l'aprenentatge i la memòria (figura 7A) i alteracions en la composició de la microbiota intestinal (figura 7B, 7C) en els ratolins del grup ABX en comparació amb el grup tractat amb CDPS. Els resultats anteriors indiquen que fins i tot l'administració deCDPSno pot augmentar la capacitat d'aprenentatge i memòria dels ratolins després de canviar la flora intestinal. A més, vam observar un augment dels nivells de citocines proinflamatòries al cervell i al sèrum de ratolins del grup ABX en comparació amb el grup CDPS (figura 7D-7N). Els resultats del grup ABX i del grup CY van demostrar que després de destruir la flora intestinal i la funció immune, fins i tot l'administració de CDPS no podia millorar la capacitat d'aprenentatge i memòria dels ratolins. Aquests resultats van suggerir que el tractament amb CDPS va disminuir la inflamació perifèrica, l'estrès oxidatiu i el declivi cognitiu en el D gal induït.envellimentmodelar ratolins mitjançant la prevenció de la disbiosi intestinal.

Després vam utilitzar el fàrmac immunosupressor, la ciclofosfamida [24] per determinar el paper de la inflamació en els efectes beneficiosos del CDPS. Els ratolins CDPS tractats amb ciclofosfamida (grup Cy) van mostrar alteracions en la capacitat d'aprenentatge i memòria, alteracions en la composició de la microbiota intestinal i nivells aberrants de citocines pro i antiinflamatòries al cervell i al sèrum en comparació amb les de tipus salvatge iCDPSgrup de ratolins. Tanmateix, no hi ha cap importància en comparació amb el model i el grup ABX. (Figura 7A-7N). Aquestes dades demostren que les alteracions en la composició de la microbiota intestinal augmenten la inflamació perifèrica a la D-gal induïda.envellimentratolins model.

CDPS prevé l'envelliment induït per D-gal regulant el metabolisme dels aminoàcids

El sistema immunitari de l'hoste està influenciat pels metabòlits generats per la microbiota intestinal [25]. Els metabòlits fecals representen una lectura funcional del metabolisme microbià intestinal i la composició microbiana intestinal [26]. A més, els metabòlits de la microbiota intestinal entren a la circulació sanguínia i afecten el metabolisme i la salut de l'hoste [26, 27]. Es van identificar un total de 1058 metabòlits en una mostra de sèrum de fWT, Mod iCDPSratolins. A continuació, vam analitzar aquests metabòlits mitjançant BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) i Human Metabolome Database (HMDB) i vam trobar que 65 metabòlits es van expressar de manera diferent al grup Mod en comparació amb el grup WT. A més, vam trobar que els nivells de 8 metabòlits (creatinina, valina, L-(-)-metionina, o-toluidina, N etilanilina, àcid úric, prolina i fenilalanina) difereixen significativament entre els grups WT, Mod i CDPS. L'anàlisi d'enriquiment de la via d'aquests 8 metabòlits mitjançant MetaboAnalyst [28, 29] va demostrar que aquests metabòlits estaven relacionats amb el metabolisme de l'arginina, la histidina, l'arginina, la prolina i la purina (figura 8A, 8B). 7 metabòlits diferents del grup MOD i del grup CDPS al grup WT.

Després vam analitzar si els canvis en el metabolisme dels aminoàcids estaven relacionats amb alteracions en la composició de la microbiota intestinal. Vam observar que 7 metabòlits diferents dels grups WT, Mod i CDPS (creatinina, valina, L-(-)-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, àcid úric i prolina) es van reduir significativament a ABX, Cy i Grups de modificacions en comparació amb els grups WT i CDPS. A més, no hi ha cap importància entre els grups ABX i Cy (figura 8C). Finalment, per explorar hi ha una correlació entre el metabolisme diferencial i altres malalties relacionades amb l'envelliment. Vam analitzar la correlació entre aquests set metabòlits expressats de manera diferenciada i malalties humanes mitjançant la base de dades MetaboAnalyst i vam trobar que aquests metabòlits estaven associats amb la malaltia d'Alzheimer (p=0.00173; Figura 8D, 8E). En general, aquestes dades ho suggereixenCDPSprotegeix contra la induïda per D-galenvellimentmitjançant la regulació del metabolisme dels aminoàcids.

DISCUSSIÓ

Un declivi progressiu de la funció cognitiva és un tret característic de l'envelliment. Estudis anteriors van demostrar que el tractament amb CDPS va millorar significativament l'aprenentatge i la memòria en els ratolins model d'envelliment [30–33]. En aquest estudi, vam demostrar que el tractament amb CDPS va millorar la funció cognitiva mitjançant la inhibició de la inflamació perifèrica i l'estrès oxidatiu mitjançant la restauració de l'homeòstasi microbiana intestinal a la D-gal induïda.envellimentratolins model (figura 9). Rates Sprague-Dawley alimentades ambPolisacàrids de Cistancheva mostrar un creixement més gran de bacteris intestinals beneficiosos i una diversitat microbiana intestinal millorada [34]. CDA-0.05, un polisacàrid neutre de Cistanche, va millorar el creixement dels lactobacils probiòtics [22]. Aquestes dades van suggerir que els polisacàrids de Cistanche van millorar l'homeòstasi dels bacteris intestinals.

En aquest estudi ho hem demostratCDPSté efectes antiinflamatoris i millora la capacitat cognitiva dels ratolins model d'envelliment modulant l'abundància de gèneres bacterians intestinals com ara Bacteroidetes, Firmicutes i Proteobacteria. Per tant, el CDPS pot ser terapèuticament beneficiós per a malalties relacionades amb l'envelliment mitjançant la remodelació de la composició de la microbiota intestinal [35,36]. A més, estudis anteriors han demostrat que els nivells de citocines inflamatòries al sèrum i al còlon estan associats amb l'abundància relativa de gèneres bacterians com Bacteroidetes, Firmicutes i Proteobacteria [37, 38]. A més, la composició microbiana intestinal regula la funció cerebral modulant els nivells circulants de diverses citocines [39–43]. Els nostres resultats van mostrar que el tractament amb CDPS va disminuir l'abundància relativa de Thermoplasmata, Bacils, Actinobacteria no identificats, Fusobacteriia i Elusimicrobia no identificats, i va augmentar l'abundància relativa de Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, Deferribacteres, Mollisosphaeria, Nitrolinesosphaeria, Erisipelotríquia i cianobacteris_no identificats.

Els metabòlits microbians intestinals s'alliberen al torrent sanguini i regulen la salut i el metabolisme de l'hoste [26, 27]. Els metabòlits microbians intestinals es poden estimar avaluant la composició dels metabòlits fecals, que canvia amb les alteracions en la composició dels microbis intestinals [44]. Estudis recents han demostrat que els nivells plasmàtics de citrulina, prolina, arginina, asparagina, fenilalanina i treonina s'associen amb trastorns neurodegeneratius, inclosa la malaltia d'Alzheimer [45, 46]. El nostre estudi va demostrar que els nivells sèrics de creatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N etilanilina, àcid úric i prolina es van associar amb la D-gal induïda.envellimenten ratolins.

Els braços innats i adaptatius del sistema immunitari tenen un paper important en el manteniment de l'homeòstasi microbiana hoste a la superfície luminal intestinal [47]. La microbiota intestinal també té un paper important en la regulació del sistema nerviós central (SNC) i la immunitat alliberant citocines i metabòlits al torrent sanguini [48, 49]. Les citocines proinflamatòries tenen un paper clau en diverses malalties neurodegeneratives [50–52]. Per exemple, la degeneració macular relacionada amb l'edat (DMAE) i el glaucoma s'associen amb l'acumulació extracel·lular d'amiloide (A) i la deposició intracel·lular de tau hiperfosforilada (p-tau) i ferro a les cèl·lules ganglionars de la retina (RGC) [44]. A més, la inflamació té un paper important en la patogènesi associada al glaucoma [53]. La discapacitat visual és un símptoma primerenc de la malaltia d'Alzheimer (MA) i es manifesta abans de l'inici del declivi cognitiu [54]. El nostre estudi ho va demostrarCDPSprotegeix contra el declivi cognitiu i la inflamació perifèrica mantenint l'homeòstasi de la microbiota intestinal.

Aquest estudi té diverses limitacions. En primer lloc, no es coneix bé la relació entre el metabolisme dels aminoàcids i la composició de la microbiota intestinal. En segon lloc, no es coneix la composició i l'estructura molecular del CDPS. Per tant, es requereixen estudis futurs per explorar encara més el paper regulador del CDPS en l'alleujament de l'AD a través de l'eix d'insignificació de la microbiota intestinal.

En conclusió, el nostre estudi ho demostraCDPScapacitat cognitiva millorada en D-gal induïdaenvellimentmodelar ratolins restaurant l'homeòstasi de la microbiota intestinal, restaurant així el desequilibri d'aminoàcids, la inflamació perifèrica i l'estrès oxidatiu. Aquestes troballes suggereixen que el CDPS és un potencial terapèutic per als pacients amb trastorns de l'aprenentatge i la memòria, especialment els associats a la disbiosi intestinal.

MATERIALS I MÈTODES

Preparació de CDPS

Uns 1.0 Kg de netejatCistanche deserticolaes va assecar a l'aire al forn a 40 graus C i es va pulveritzar en pols cru. La pols es va extreure en etanol calent durant 3 h. El residu es va filtrar a través de gasa per eliminar el filtrat i després es va diluir amb aigua (8X) i es va posar a reflux seqüencialment durant 2 h, 1,5 h i 1 h a 90 graus C. En cada moment, la solució es va centrifugar per separar el sobrenedant i combinat amb el filtrat marró-vermell. A continuació, el filtrat es va concentrar a pressió reduïda, es va refredar a temperatura ambient, es va afegir lentament a etanol al 95 per cent (3X) i es va deixar reposar a 4 graus C durant 24 h. A continuació, es va centrifugar la solució a 6000 r/min durant 20 min a 4 graus C. El precipitat es va recollir després de repetir l'extracció d'aigua i la precipitació amb alcohol tres vegades. El precipitat es va reconstituir en aigua, es va desproteinitzar, es va dialitzar i es va liofilitzar per obtenir un cru.Polisacàrid de Cistanche deserticola(CDPS). El contingut de polisacàrids va ser superior al 90 per cent avaluat per espectrofotometria ultraviolada.

Agrupaments i tractaments d'animals

Es van comprar ratolins Kunming mascles de vuit setmanes (núm. de llicència SCXK 2019-0010) a SPF Biotechnology Co. Ltd (Beijing, Xina), allotjats en una habitació amb llum i temperatura controlada i alimentats amb menjar i aigua. Tots els experiments amb animals es van dur a terme segons els protocols aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat Mèdica de Mongòlia Interior. Els experiments es van dur a terme segons la Guia per a la cura i l'ús d'animals de laboratori dels Instituts Nacionals de Salut (NIH).

Després d'una setmana d'adaptació al nou entorn, 120 ratolins es van dividir en els 7 grups següents: (1) control de tipus salvatge (WT); grup model (150 mg/Kg/dia D-gal; Mod); (3) CH: D-gal més 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal més 50 mg/kgCDPS; (5) CL: D-gal més 25 mg/kg CDPS; (6) Grup ABX: antibiòtics més D-gal més 50 mg/Kg CDPS; (7) Grup Cy: ciclofosfamida més D-gal més 50 mg/kg CDPS.

Els ratolins del model, els grups ABX, Cy i CDPS van rebre injeccions subcutànies de 15 0 mg/kg D-gal dissolts en solució salina cada dia durant 2 mesos. El grup WT es va injectar per via subcutània amb un volum igual de solució salina durant 2 mesos. Els ratolins del grup CDPS també es van administrar diàriament amb injeccions intragàstriques que contenien 100 mg/kg, 50 mg/Kg o 25 mg/Kg CDPS durant 2 mesos. Els ratolins del grup ABX van rebre aigua potable amb 0,1 mg/ml d'ampicil·lina i 0,5 mg/ml d'estreptomicina durant 2 mesos a més de D-gal iCDPSinjeccions. Abans d'administrar D-gal, els ratolins van rebre injeccions que contenien 0,1 mg/ml ampicil·lina, 0,5 mg/ml estreptomicina i 0,1 mg/ml colistina durant 7 dies al grup ABX. Els ratolins del grup Cy van rebre injeccions intraperitoneals de 20 mg/Kg de ciclofosfamida cada dos dies (qod) durant 2 mesos, a més de les injeccions diàries de D-gal i CDPS.

Nova prova de reconeixement d'objectes

Realitzar experiments de comportament després de l'última dosi. La prova de reconeixement d'objectes va implicar etapes de familiarització, formació i prova. Durant l'etapa de familiarització, els ratolins es van habituar a una cambra de proves buida durant 10 minuts durant dos dies. A continuació, el tercer dia (dia d'entrenament), es van col·locar dos objectes de la mateixa mida, forma i color (A1 i A2) als extrems oposats de la cambra. Aleshores, cada ratolí va tenir 10 minuts per explorar els dos objectes similars. Després d'intervals d'entrenament a prova de 1-hores (al tercer dia) i 24- hores (al quart dia), un dels objectes similars (A1 o A2) es va substituir per un B o C objecte que és diferent en mida, color i forma el dia de la prova. Durant l'etapa de prova, es va provar cada ratolí durant 5 minuts i es va calcular l'índex preferencial per determinar la memòria del reconeixement d'objectes nous (B o C) mitjançant la fórmula següent: Índex preferent=Temps a l'objecte B o C/( Temps a l'objecte B o C més Temps a l'objecte A)×100 per cent.

Prova del laberint d'aigua de Morris

La prova del laberint d'aigua de Morris es va realitzar en una piscina rodona de 45 cm de profunditat i 90 cm de diàmetre. El protocol descrit per Ruediger S, et al. (2011) [55] i Wood RA, et al. (2018) [56] es va emprar aquí. La profunditat de l'aigua a la piscina era de 30 cm i la temperatura de l'aigua era de 20 ± 1 graus C. La plataforma tenia 6 cm de diàmetre i 1 cm sota l'aigua. El temps d'entrenament i de prova va ser de 60 s cadascun. Per a la formació, vam realitzar quatre assaigs de 60 s cadascun amb una plataforma oculta cada dia durant cinc dies continus. Si la plataforma no va ser descoberta pels ratolins en 60 s, es van guiar a la plataforma i es van col·locar a la plataforma durant 5 s. Durant l'etapa de proves, es va registrar i analitzar la latència per arribar a la plataforma oculta en sessions d'entrenament i proves de sondeig, el nombre de creuaments sobre la ubicació de la plataforma eliminada i el temps passat al quadrant objectiu (plataforma).

Assajos ELISA

Els nivells sèrics de citocines proinflamatòries com IL-2(), IL-4, IL{-10 i TNF- es van analitzar per a cada grup de ratolins mitjançant kits ELISA comprats a Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Xangai, Xina) segons les instruccions del fabricant. L'activitat d'un enzim antioxidant, la superòxid dismutasa (SOD) i els nivells de producte de peroxidació lipídica, malondialdehid (MDA), en el sèrum de cada grup de ratolins es va analitzar mitjançant kits d'assaig comprats a l'Institut de Bioenginyeria de Nanjing Jiancheng (Nanjing, Xina) . Els nivells de productes proteics d'oxidació avançada (AOPP) a les mostres d'hipocamp murí es van estimar mitjançant un kit ELISA de Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Xangai, Xina) segons les instruccions del fabricant.

Estimació de l'estrès oxidatiu en cervells murins

Hem homogeneïtzat 100 mg de teixit d'hipocamp amb 0,9 ml de solució salina refrigerada amb gel i l'homogeneïtat es va centrifugar a 12.000 rpm durant 30 min a 4 graus C. El contingut de proteïnes del sobrenedant es va analitzar mitjançant el kit d'assaig de proteïnes BCA ( Beyotime Biotechnology, Xangai, Xina). Els nivells de peroxidació lipídica (LPO) i malondialdehid (MDA) i les activitats de GSH-Px i SOD a les mostres d'hipocamp es van analitzar mitjançant colorimetria mitjançant kits de l'Institut de Bioenginyeria Nanjing Jiancheng (Nanjing, Xina) segons les instruccions del fabricant.

Composició de la microbiota intestinal

Es van recollir mostres fecals de tots els ratolins i es van emmagatzemar immediatament a -80 graus C. La regió V3 més V4 del gen de l'ARNr 16S es va seqüenciar mitjançant Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Beijing, Xina) i es va analitzar amb el QIIME plataforma oberta per determinar els perfils de la microbiota intestinal.

Anàlisi LC/MS de metabòlits sèrics

Les mostres de sèrum es van incubar durant 10 minuts amb metanol prèviament refrigerat en una proporció d'1: 3 per precipitar les proteïnes. Les mostres es van centrifugar a 12000r/min durant 15 minuts a 4 graus C. Els sobrenedants es van analitzar mitjançant la cromatografia líquida de resolució ràpida Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 i l'espectre de masses QExactive. Les condicions cromatogràfiques es mostren a la taula 1. Els analits es van separar en una columna cromatogràfica XBridge BEH Amide (2,1 × 100 mm; Waters Co., Milford, MA, EUA) utilitzant àcid fòrmic al 0,1 per cent i acetonitril com a fases mòbils A i B. , respectivament. El cabal es va establir a 0, 4 ml/min, el volum d'injecció va ser de 5 µl i la temperatura de la columna es va establir a 25 graus C (taula 1). Els senyals de l'espectre de masses es van obtenir mitjançant els modes d'exploració d'ions positius i negatius. A la taula 2 es mostren la tensió de polvorització d'ions i altres paràmetres específics de MS.

Anàlisi estadística

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 i pàg< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">