Cistanche Rb1 atenua la deterioració vascular associada a l'edat mitjançant la modulació de la via Gas6

Resultats Rb1 va alleujar la senescència a les aortes de ratolins envellits

Per identificar l'efecte antisenescència de Rb1, primer vam investigar la senescència cel·lular, que es caracteritza per l'expressió de proteïnes implicades en la inhibició del cicle cel·lular i l'aturada irreversible del creixement (Yang et al. 2019). Com es mostren els resultats de la immunohistoquímica a la figura 1 (A, B), en comparació amb els del grup Young, els ratolins del grup Old + Vehicle van demostrar que l'envelliment accelerava la regulació de p21Cip1 i p16INK4a a les cèl·lules de l'aorta toràcica. Tanmateix, el tractament amb Rb1 va alleujar la senescència cel·lular als vasos sanguinis, especialment al grup Old þ Rb1-20. A més, els resultats de Western blot estaven d'acord amb elresultats de la immunohistoquímica. Tal com es mostra a la figura 1 (C), l'expressió de proteïnes de p21Cip1 i p16INK4a va augmentar significativament aproximadament 2- vegades a les aortes toràciques dels ratolins vells en comparació amb els ratolins joves. Després del tractament amb 20 mg/kg de Rb1, els nivells de proteïnes de p21Cip1 i p16INK4a van augmentar un 41,92% i un 37,52% en comparació amb els del grup Young, que eren significativament inferiors als del grup Old plus Vehicle. A més, no hi va haver cap diferència significativa en l'expressió de p21Cip1 o p16INK4a entre ratolins joves amb i sense tractament amb Rb1.

Figura 1. Efecte de Rb1 sobre la senescència de l'aorta toràcica. Imatges de la tinció immunohistoquímica (400) de p21Cip1 (A) i p16INK4a (B) en seccions transversals de l'aorta toràcica del ratolí. ( C ) Anàlisi de Western blot de l'expressió p21Cip1 i p16INK4a aòrtica toràcica del ratolí. Les dades s'expressen com a mitjana ± SD. p < 0,01 enfront del grup Young; # p < 0,05 enfront del grup Oldþ Vehicle.

Rb1 va millorar la reactivitat vascular en ratolins envellits

Es va utilitzar un experiment d'anell vascular per avaluar la vasodilatació dependent de l'endoteli. Com es mostra a la figura 2, en tots els anells aòrtics toràcics del ratolí, l'administració d'Ach va donar lloc a una vasorelaxació. A concentracions màximes (10–5 mol/L), Ach va induir aproximadament un 88,84 per cent ± 1,20 per cent i un 58,35 per cent ± 2,50 per cent de vasorelaxació en el grup Young i el grup Old + Vehicle, respectivament, demostrant que l'envelliment s'associa amb un deteriorament de la reactivitat vascular. Tanmateix, el tractament amb Rb1 de 10 i 20 mg/kg va donar lloc a una relaxació aproximadament del 70,48 per cent ± 2,20 per cent i el 80,90 per cent ± 3,24 per cent, respectivament, en l'envelliment dels anells aòrtics toràcics del ratolí en resposta a 10 5 mol/L d'Ach.

Feu clic aquí per obtenir Cistanche per anti-envelliment

Rb1 va reduir l'expressió de molècules d'adhesió cel·lular a l'aorta toràcica de ratolins envellits

Hem examinat l'expressió de proteïnes de certes molècules d'adhesió cel·lular per determinar-neinflamatòriaiefectes antiinflamatorisde Rb1 en ratolins envellits. Els resultats van mostrar que l'expressió de proteïnes d'ICAM-1, VCAM-1 i PAI-1 va augmentar significativament aproximadament 2-4 vegades a l'aorta toràcica de ratolins vells en comparació amb aquells. al grup Jove (Figura 3). En canvi, el tractament amb Rb1 va inhibir significativament aquests canvis en les aortes toràciques del ratolí envellit, però no va tenir cap efecte sobre els grups de ratolins joves. L'anàlisi quantitativa va indicar que el tractament amb 20 mg/kg de Rb1 va donar lloc a aproximadament un 36,58 per cent, un 46,66 per cent i un 49,34 per cent de regulació a la baixa de l'expressió de proteïnes ICAM-1, VCAM{-1 i PAI{-1, respectivament, en l'envelliment del teixit aòrtic toràcic, en comparació amb els dels ratolins del grup Old plus Vehicle.

Rb1 va inhibir la calcificació vascular i la fibrosi relacionades amb l'edat

Hem realitzat una tinció d'HE i una tinció de vermell S d'alizarina per avaluar l'estructura del teixit aòrtic i la calcificació vascular medial en ratolins envellits respectivament. La tinció d'HE va demostrar que les parets engrossides induïdes per l'envelliment de l'aorta toràcica i la desorganització de la matriu extracel·lular aòrtica es podrien alleujar amb el tractament amb Rb1 (Figura 4 (A)). Com es mostra a la figura 4 (B), els ratolins envellits van desenvolupar una calcificació medial més severa (àrea tacada de vermell) que els ratolins joves, mentre que la intervenció de Rb1 va reduir aquest canvi patològic. A continuació, es van examinar les seccions transversals de l'aorta toràcica mitjançant la tinció de tricrom de Masson per avaluar la fibrosi vascular medial en ratolins envellits. Els resultats van mostrar que hi va haver un augment notable de la deposició de col·lagen (àrea tacada de blau) al grup Old + Vehicle en comparació amb el grup Young (Figura 4 (C)), i aquest efecte es va inhibir significativament per la intervenció de Rb1. A més, el Western blotting va mostrar que l'expressió del col·lagen I i del col·lagen III va augmentar significativament en 4,34- i 2,62- vegades en els ratolins del grup Old + Vehicle en comparació amb els ratolins joves; tanmateix, el tractament amb Rb1 va regular a la baixa l'expressió de col·lagen I i col·lagen III en ratolins envellits (figura 4 (D)). A més, el tractament amb Rb1 no va tenir cap influència en els graus de calcificació i fibrosi de l'aorta toràcica en ratolins joves (figura 4 (A-D)).

Rb1 va regular la via de senyalització de Gas6

Vam investigar més si Rb1 funcionava a través de la via de senyalització Gas6/Axl per millorar el deteriorament de l'aorta toràcica associada a l'edat en ratolins. La regulació a la baixa de l'expressió de la proteïna Gas6 en un 41, 72 per cent i l'expressió d'ARNm en un 52, 73 per cent en ratolins vells en comparació amb ratolins joves va ser abrogada pel tractament amb Rb1 (figura 5 (A, B)). També vam determinar l'expressió de proteïnes d'Axl mitjançant Western blotting. Curiosament, no hi va haver cap diferència significativa en l'expressió de la proteïna Axl entre els cinc grups experimentals (figura 5 (A)). Tampoc vam detectar una diferència significativa en els nivells d'ARNm d'Axl entre els grups (figura 5 (B)).

Figura 2. El tractament amb Rb1 va atenuar la deterioració de la vasorelaxació dependent de l'endoteli associada a l'edat en els anells vasculars de l'aorta toràcica. Figures que mostren els resultats de l'anàlisi. Les dades s'expressen com a mitjana ± SD. p < 0.05, p < 0.01 contra el grup Young; # p < 0,05, ##p < 0,01 enfront del grup de vehicles antics.

Figura 3. Rb1 va reduir l'expressió de molècules d'adhesió cel·lular en aortes toràciques de ratolí envellit. Anàlisi Western blot de l'expressió ICAM-1, VCAM-1 i PAI-1 als teixits de l'aorta toràcica. Les dades s'expressen com a mitjana ± SD. p < 0.01 contra el grup Young; # p < 0,05, ##p <0,01 enfront del grup Oldþ Vehicle.

Discussió

En el present estudi, vam demostrar que Rb1 va millorardeteriorament vascular relacionat amb l'edatsuprimint la calcificació i la fibrosi mitjançant la regulació de l'expressió Gas6 però no l'expressió Axl, que proporciona una estratègia terapèutica potencial per prevenir la malaltia vascular relacionada amb l'edat. Està ben acceptat que la senescència de les cèl·lules vasculars, que es caracteritza per una disfunció endotelial i la transició fenotípica de les cèl·lules musculars llises, pot provocar un augment de la rigidesa vascular i un augment del gruix de les parets vasculars (Liu et al. 2019). La senescència de cèl·lules vasculars és una característica comuna de diverses malalties complexes relacionades amb l'edat, especialment les cardiovasculars (O'Rourke et al. 2010). Amb el desenvolupament de la senescència de les cèl·lules vasculars, la funció vascular es veu afectada (Gong et al. 2014). La disfunció vascular relacionada amb l'edat s'exemplifica amb alteracions fisiopatològiques, inclosa una disminució progressiva de la vasodilatació dependent de l'endote lium (Herrera et al. 2010; Gong et al. 2014). En el nostre estudi, vam confirmar la senescència cel·lular a les aortes toràciques de ratolins envellits, que es va indicar per una major expressió de les proteïnes relacionades amb l'edat p21Cip1 i p16INK4a, així com una disminució de la vasodilatació dependent de l'endoteli. La coherència dels nostres resultats amb els estudis esmentats anteriorment suggereix que hi havia alguns mecanismes moleculars importants associats als canvis en la fisiopatologia de les cèl·lules vasculars durant l'envelliment. Els agents que actuen sobre aquests mecanismes probablement reduirien i retardaran molt la senescència de les cèl·lules vasculars.

Figura 4. El tractament amb Rb1 va millorar la calcificació vascular induïda per l'envelliment i la fibrosi. (A) Tinció d'hematoxilina i eosina (HE) (400), (B) Tinció de vermell d'alizarina S (4{00) i (C) Tinció de tricrom de Masson (400 ) de seccions d'aorta toràcica representatives a cada grup. (D) Anàlisi Western blot de les expressions de col·lagen I i col·lagen III als teixits de l'aorta toràcica. Les dades s'expressen com a mitjana ± SD. p < 0,01 enfront del grup Young; # p < 0,05, ##p < 0,01 enfront del grup de vehicles antics

Figura 5. La influència de Rb1 en la via de senyalització Gas6/Axl. (A) Es va realitzar Western blotting per examinar l'expressió de proteïnes de Gas6 i Axl. (B) Es va realitzar qPCR per examinar l'expressió d'ARNm de Gas6 i Axl. Les dades s'expressen com a mitjana ± SD. p < 0.05, p < 0.01 contra el grup Young; # p < 0,05 enfront del grup de vehicles antics.

L'evidència acumulada ha revelat que Rb1 es considera un fàrmac prometedor per prevenir el dany vascular (Zhou et al. 2017, 2019a, 2019b; Zheng et al. 2020). Estudis anteriors han revelat que Rb1 prevé la senescència de les cèl·lules vasculars i inhibeix la calcificació vascular (Nanao-Hamai et al. 2019; Zhou et al. 2019b; Zheng et al. 2020). Tanmateix, encara no està clar si Rb1 pot protegir les funcions arterials contra l'envelliment i el mecanisme molecular rellevant. Aquí, vam trobar que Rb1 va reduir i retardar la senescència arterial en ratolins envellits, com es demostra amb la disminució de l'expressió de proteïnes relacionades i la millora de la vasodilatació vascular, cosa que indica que Rb1 pot bloquejar de manera eficient la senescència excessiva en l'envelliment de l'aorta toràcica del ratolí i es pot utilitzar com a agent eficaç per tractar o prevenir el deteriorament arterial relacionat amb l'edat.

L'evidència prèvia ha demostrat l'acumulació d'inflamació arterial crònica de baix grau amb l'avançament de l'edat, que contribueix a alteracions estructurals i funcionals vasculars associades a l'edat (Wang et al. 2014). Estudis addicionals han indicat que un microambient enriquit en perfils inflamatoris indueix un canvi fenotípic en les VSMC del tipus contràctil al sintètic. Aquest canvi fenotípic es caracteritza per l'expressió atenuada de proteïnes contràctils específiques de SMC i la secreció de citocines proinflamatòries addicionals, quimiocines, proteïnes ECM i molècules d'adhesió cel·lular, com ara col·lagen, ICAM-1, VCAM-1 , i PAI-1 (Wang et al. 2011; Lacolley et al. 2018). A més, les molècules d'adhesió contribueixen a la remodelació de les artèries induïda per la inflamació, especialment mitjançant la reorganització de les interaccions ECM-VSMC i influència en la modulació fenotípica de les VSMC (Intengan et al. 1999). A més, els estudis han demostrat que Rb1 té efectes antiinflamatoris in vivo i in vitro (Miao et al. 2017; Zhou et al. 2017). En el present estudi, vam trobar que el tractament amb Rb1 podria disminuir significativament els nivells d'expressió de molècules d'adhesió cel·lular relacionades amb processos inflamatoris en ratolins envellits, cosa que suggereix que Rb1 podria actuar com a fàrmac antiinflamatori i protegir la vasculatura durant l'envelliment.

A més del dany inflamatori, la remodelació de la paret arterial caracteritzada per la calcificació i la fibrosi és l'altre canvi fisiopatològic principal en les modificacions avasculars relacionades amb l'edat i provoca rigidesa vascular que contribueix a una disminució de la vasodilatació (McEniery et al. 2005; Iyemere et al. 2006; Kovacic et al. 2006; Kovacic et al. .2011). Estudis a gran escala han demostrat que la calcificació ateroscleròtica coronària augmenta amb l'edat (Tesauro et al. 2017). Altres investigacions també van demostrar la presència d'un augment de la calcificació amb l'envelliment a la regió de l'artèria caròtida (Wendorff et al. 2015). De la mateixa manera, els nostres resultats van indicar que els ratolins envellits van desenvolupar una calcificació vascular medial més severa que els ratolins joves. La intervenció de Rb1 va inhibir substancialment aquests canvis. Aquest resultat va suggerir que l'administració de Rb1 va alleujar el grau de calcificació vascular relacionada amb l'edat in vivo. Hi ha proves suficients que han demostrat que la calcificació vascular implica una varietat de processos patobiològics més que una simple deposició de calci, entre els quals el canvi de VSMC a cèl·lules semblants als osteoblasts té un paper crític (Zhou et al. 2019b). Una limitació del nostre estudi és que, tot i revelar que la intervenció de Rb1 va inhibir significativament la calcificació vascular en l'aorta toràcica de ratolins envellits, els marcadors VSMC contràctils (com l'actina i la calponina del múscul llis A) i els marcadors VSMC osteogènics (com el factor de transcripció 2 relacionat amb runt). ) requereixen més exploració.

A més, en el present estudi, també vam observar una disminució dels nivells de col·lagen intersticial i una disminució de l'expressió de proteïnes relacionades en ratolins envellits tractats amb Rb1-en comparació amb ratolins envellits tractats amb vehicles, cosa que va suggerir que Rb1 podria tenir un efecte beneficiós sobre la funció vascular. en l'envelliment de l'aorta toràcica mitjançant la millora de la fibrosi vascular induïda per l'edat. Harvey et al. (2016) van informar que l'enduriment arterial causat per una fibrosi excessiva i l'augment de la deposició de col·lagen podria provocar un augment del to vasomotor i una alteració de la perfusió dels teixits. Es considera que els agents que atenuen la fibrosi protegeixen contra les malalties vasculars relacionades amb l'edat (Kim et al. 2018).

Es pot deduir quedeteriorament vascular relacionat amb l'edatés un procés complex que implica diversos canvis anormals, com ara inflamació, calcificació i fibrosi. Més important encara, vam trobar que Rb1 era capaç d'inhibir aquests canvis anormals coneguts a les aortes toràciques de ratolins envellits. No obstant això, encara es desconeix el mecanisme subjacent. Gas6 es va identificar com el lig i per a la família de receptors TAM, especialment els receptors de tirosina cinasa Axl (Rothlin et al. 2015). Un estudi anterior va demostrar el paper de Gas6/Axl en la regulació de múltiples funcions cel·lulars (Chen et al. 2019). Un estudi recent va suggerir que Gas6/Axl va tenir un paper crucial en la calcificació vascular (Son et al. 2010; Kaesler et al. 2016; Nanao-Hamai et al. 2019) i també pot estar implicat en la regulació a la baixa induïda pel tractament de la síntesi de col·lagen en VSMC i teixit cardíac envellit (Chen et al. 2016; 2019). A més, estudis anteriors van revelar que Rb1 va activar la transcripció de Gas6 al lloc específic ARE a la regió promotora (Son et al. 2010; Nanao-Hamai et al. 2019). Aquí, vam demostrar que l'expressió de la proteïna Gas6 estava regulada a la baixa en ratolins envellits, però es va revertir amb el tractament amb Rb1, cosa que indica que Gas6 pot participar en la regulació mediada per Rb{21}}de la deterioració arterial en ratolins vells. Tanmateix, els nostres resultats mostren que no hi va haver cap canvi en l'expressió de la proteïna Axl i l'ARNm, cosa que no era coherent amb un estudi anterior (Chen et al. 2019). La família de receptors TAM inclou Tyro3, ​​Axl i MerTK. Tot i que Gas6 mostra l'afinitat més forta per Axl entre els tres membres (Rothlin et al. 2015), Sun et al. (2019) van trobar que l'activació de Gas6 va atenuar la lesió inflamatòria i l'apoptosi en ratolins, però no es van produir canvis en l'activació d'Axl entre els grups experimentals. Altres investigacions van suggerir que l'expressió d'Axl, que inhibeix l'apoptosi i, per tant, la calcificació vascular, tampoc no es va alterar en els ratolins Gas6–/– (Kaesler et al. 2016). Els nostres resultats van indicar clarament que Rb1 va atenuar específicament la baixada de Gas6 relacionada amb l'edat, però no va tenir cap influència en l'expressió d'Axl, que es va informar que era el principal esdeveniment responsable de la calcificació vascular i la fibrosi, per millorar la inflamació vascular relacionada amb l'edat i la vasodilatació depenent de l'endoteli. . L'expressió estable d'Axl pot resultar d'una quantitat suficient abans de l'activació de Gas6 o indicar que Gas6 funciona a través d'altres receptors. Es necessiten més investigacions que explorin els efectes de Rb1 en altres TAM que també podrien ser activats per Gas6, com Tyro3 i MerTK.

Conclusions

En el present estudi, vam confirmar que Rb1 va inhibir la calcificació vascular i la fibrosi i va disminuir l'expressió de molècules d'adhesió cel·lular, tot això va millorar posteriorment la vasodilatació depenent de l'endoteli vascular relacionada amb l'edat, almenys en part, regulant l'expressió de Gas6 però no l'expressió Axl. Amb un envelliment incontrolable, trobar agents que puguin prevenir o tractar el deteriorament cel·lular vascular relacionat amb l'edat és de gran importància. El nostre estudi proporciona proves que validen els efectes de Rb1 sobre la millora de la lesió vascular en ratolins envellits.

Declaració de divulgació

Els autors no van informar de possibles conflictes d'interessos.

Finançament Aquest treball va comptar amb el suport de subvencions de la Fundació Nacional de Ciències Naturals de la Xina [81370447], el Projecte de planificació científica i tecnològica de la província de Guangdong de la Xina [2016A050502014], el Fons de construcció de disciplina mèdica clau de Shenzhen [SZXK002] i la investigació científica mèdica. Fundació de la província de Guangdong de la Xina [A2019079].

Declaració de disponibilitat de dades

Les dades i els materials estan disponibles a petició a l'autor corresponent.

Aportacions dels autors

SYK, DHL i XXQ van contribuir a la concepció i disseny d'aquesta obra. LW, GYS i MW van contribuir a l'anàlisi de dades. SYK, LW i JMZ van escriure el manuscrit. Tots els autors van llegir i van aprovar la versió final.

Referències

Acosta JC, O'Loghlen A, Banito A, Guijarro MV, Augert A, Raguz S, Fumagalli M, Da Costa M, Brown C, Popov N, et al. 2008. La senyalització de quimiocines mitjançant el receptor CXCR2 reforça la senescència. Cèl·lula. 133(6): 1006–1018.

Brandes RP, Fleming I, Busse R. 2005. Envelliment endotelial. Cardiovasc Res. 66(2):286–294.

Chen FF, Song FQ, Chen YQ, Wang ZH, Li YH, Liu MH, Li Y, Song M, Zhang W, Zhao J, et al. 2019. La testosterona exògena alleuja la fibrosi cardíaca i l'apoptosi mitjançant la via Gas6/Axl en ratolins senescents. Exp Gerontol. 119:128–137.

Chen YQ, Zhao J, Jin CW, Li YH, Tang MX, Wang ZH, Zhang W, Zhang Y, Li L, Zhong M. 2016. La testosterona retarda la senescència de les cèl·lules musculars llises vasculars i inhibeix la síntesi de col·lagen mitjançant la via de senyalització Gas6/Axl . Edat. 38(3):60.

Fridell YW, Villa J, Attar EC, Liu ET. 1998. GAS6 indueix quimiotaxi mediada per Axl de cèl·lules musculars llises vasculars. J Biol Chem. 273(12): 7123–7126.

Gong X, Ma Y, Ruan Y, Fu G, Wu S. 2014. L'atorvastatina a llarg termini millora la disfunció endotelial relacionada amb l'edat millorant l'estrès oxidatiu i normalitzant el desequilibri eNOS/iNOS a l'aorta de rata. Exp Gerontol. 52:9–17.

Harvey A, Montezano AC, Lopes RA, Rios F, Touyz RM. 2016. Fibrosi vascular en l'envelliment i la hipertensió: mecanismes moleculars i implicacions clíniques. Can J Cardiol. 32(5):659–668.

Herrera MD, Mingorance C, Rodríguez-Rodriguez R, Alvarez de Sotomayor M. 2010. Endothelial dysfunction and aging: an update. Aging Res Rev. 9(2):142–152.

Hsu JJ, Lu J, Umar S, Lee JT, Kulkarni RP, Ding Y, Chang CC, Hsiai TK, Hokugo A, Gkouveris I, Tetradis S, et al. 2018. Efectes de la teriparatida sobre la morfologia de la calcificació aòrtica en ratolins hiperlipidèmics envellits. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 314(6):H1203–H1213.

Hurtado B, Abasolo N, Munoz X, Garcia N, Benavente Y, Rubio F, Garcia de Frutos P, Krupinski J, Sala N. 2010. Association study between polymorphims in GAS6-TAM genes and carotid atherosclerosis. Tromb Haemost. 104(3):592–598.

Intengan HD, Thibault G, Li JS, Schiffrin EL. 1999. Mecànica de l'artèria de resistència, estructura i components extracel·lulars en rates espontàniament hipertenses: efectes de l'antagonisme del receptor d'angiotensina i inhibició de l'enzim convertidor. Circulació. 100(22):2267–2275.

Iyemere VP, Proudfoot D, Weissberg PL, Shanahan CM. 2006. Plasticitat fenotípica de cèl·lules musculars llises vasculars i la regulació de la calcificació vascular. J Intern Med. 260(3):192–210.

Kaesler N, Immendorf S, Ouyang C, Herfs M, Drummen N, Carmeliet P, Vermeer C, Floege J, Kruger T, Schlieper G. 2016. Gas6 protein: its role in cardiovascular calcification. BMC Nephrol. 17(1):52. Kim EN, Kim MY, Lim JH, Kim Y, Shin SJ, Park CW, Kim YS, Chang YS, Yoon HE, Choi BS. 2018. L'efecte protector del resveratrol sobre l'envelliment vascular mitjançant la modulació del sistema renina-angiotensina. Aterosclerosi. 270: 123–131. Korshunov VA, Mohan AM, Georger MA, Berk BC. 2006. Axl, un receptor de tirosina quinasa, media la remodelació vascular induïda pel flux. Circ Res. 98(11):1446–1452.