Clonació gènica, identificació funcional, anàlisi estructural i d'expressió de la sacarosa sintasa de Cistanche Tubulosa Ⅱ

Resultats i anàlisi

1 Extracció i clonació de gens de sacarosa sintasa a Cistanche tubulosa

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>part aèria.

Per tant, els valors FPKM del nivell d'expressió dels dos gens candidats de sacarosa sintasa obtinguts en el cribratge inicial a les dades del transcriptoma de diferents parts de Cistanche tubulosa es van normalitzar mitjançant Z-Score i es va realitzar una anàlisi diferencial (figura 1A). Els resultats van mostrar que el gen CtSus tenia el nivell d'expressió més alt a l'haustori, i el nivell d'expressió a la part subterrània era superior al de la part aèria, la qual cosa era coherent amb el patró d'acumulació de compostos glicòsids a diferents parts de Cistanche tubulosa. mentre que el nivell d'expressió del gen CtSus1 a l'haustori era baix. Per tant, a partir dels resultats anteriors, es va seleccionar el gen CtSus per a la posterior amplificació de la seqüència, expressió exògena i identificació funcional. Utilitzant l'ADNc de Cistanche tubulosa com a plantilla, es va obtenir un producte de banda única a ~ 2500 pb després de l'amplificació per PCR (figura 1B). El producte de PCR es va recuperar del gel i es va lligar al vector de clonació i es va obtenir la regió codificant de longitud completa del gen objectiu mitjançant la seqüenciació. La longitud de la seqüència CtSus era de 2418 pb.

Figura 1 Exploració i clonació de gens de CtSus de C. tubulosa i anàlisi bioinformàtica de la seva proteïna codificada. R: Nivells d'expressió dels gens CtSus i CtSus1 en diferents parts de C. tubulosa normalitzats com a puntuacions Z en funció dels seus valors FPKM; B: Amplificació gènica de CtSus; M: marcador d'ADN; C: domini conservador de la proteïna CtSus predit per SMART; D: Alineació de múltiples seqüències de CtSus i sacarosa sintasis identificades d'altres plantes, com ara Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum i Albuca bracteata. El domini de síntesi de sacarosa i el domini de transferència de sucre estan representats per caixes vermelles i blaves, respectivament; E: Anàlisi filogenètica de CtSus i sucrosinsintases d'altres plantes; F: Anàlisi SDS-PAGE de l'expressió heteròloga de CtSus mitjançant el vector pCold™ I a E. coli. Carril 1: marcador de proteïnes; Carril 2: fracció sobrenedant; Carril 3: Fracció precipitada. La fletxa vermella mostra la proteïna CtSus. G: PCR de colònies d'un sol clon que conté dos plasmidis recombinants. M: marcador d'ADN; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVA BAESES COL·LABORA AMB LA UNIVERSITAT DE PEKING

Servei de suport de Wecistanche: el major exportador de cistanche a la Xina:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

FEU CLIC PER A MÉS DETALLS

2 Anàlisi bioinformàtica del gen CtSus i la seva proteïna codificada

2.1 Anàlisi de les propietats fisicoquímiques del CtSus i predicció de l'estructura del domini transmembrana

Les propietats fisicoquímiques de la proteïna codificada CtSus es van analitzar mitjançant el programari en línia ProtParam. La proteïna conté 805 aminoàcids, amb una fórmula molecular de C4189H6548N1104O1187S28 i una massa molecular relativa de 92266,44; el punt isoelèctric teòric és 6.00; el coeficient d'inestabilitat II és de 35,45, que és una proteïna estable; la hidrofilicitat mitjana global (GRAVY) és de -0,187, que és una proteïna hidròfila. Es va utilitzar MHMM 2.0 per predir el domini transmembrana de la sacarosa sintasa CtSus, i els resultats van mostrar que la proteïna codificada per aquest gen no té domini transmembrana.

HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVA BAESES COL·LABORA AMB LA UNIVERSITAT DE PEKING

2.2 Predicció de l'estructura conservadora de CtSus i l'alineació de seqüències

El programari en línia SMART es va utilitzar per predir els dominis conservadors de la proteïna CtSus (figura 1C). La proteïna conté dos dominis conservadors. L'extrem N-terminal (aminoàcids del 8 al 553) és el domini de la sacarosa sintasa, que pot catalitzar la reacció reversible de l'UDP i la sacarosa per generar UDP-glucosa i D-fructosa; l'extrem C-terminal (aminoàcids 557 a 739) pertany al domini de la glicosiltransferasa (figura 1D). Es va utilitzar el programari DNAMAN per alinear la seqüència de proteïnes CtSus amb la seqüència d'aminoàcids de sacarosa sintasa a la base de dades NCBI (taula 2). Els resultats van mostrar que la seqüència d'aminoàcids CtSus mostrava una gran similitud amb les seqüències de sacarosa sintasa d'altres plantes. La similitud més alta entre CtSus i la seqüència de sacarosa sintasa del sèsam (Sesamum indicum) va ser del 94,78%, i la similitud amb les seqüències de sacarosa sintasa d'altres plantes també va ser superior al 65%, cosa que indica que la sacarosa sintasa de les plantes té un alt grau de seqüència. conservació.

Taula 2 Similituds de seqüències d'aminoàcids entre CtSus i sacarosa sintases identificades d'una altra planta

2.3 Anàlisi filogenètica

L'arbre filogenètic construït pel programari MEGA es va utilitzar per analitzar la relació filogenètica entre la sacarosa sintasa CtSus de Cistanche tubulosa i les sacarosa sintases d'altres plantes. Els resultats es mostren a la figura 1E. Les sacarosa sintases de les plantes mostren diferents branques evolutives en dicotiledones (regions I i II) i monocotiledones (regió III). CtSus es troba a la branca dicotiledónea, i les seqüències que estan estretament relacionades amb CtSus són totes de plantes de Lamiaceae (Cistanche tubulosa és una planta de Lamiaceae Orobanchaceae), mentre que l'altra branca està composta principalment per plantes Solanales, cosa que indica a més l'alta conservació i homologia. dels gens de sacarosa sintasa derivats de les plantes en l'evolució de les plantes en el mateix ordre. Entre ells, la sacarosa sintasa PrSus (AEN79500.1) de Phelipanche ramosa de la planta Orobanchaceae és la més propera a CtSus.

3 Anàlisi de l'expressió i activitat exògena de CtSus

3.1 Expressió exògena del gen CtSus

Els plasmidis pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus i pCold™ I-CtSus verificats mitjançant seqüenciació es van transferir a l'expressió competent E. coli Transetta (DE3) i es van seleccionar els clons positius. mitjançant PCR de colònies per a la verificació de la seqüenciació. Les soques d'expressió recombinants obtingudes es van induir per IPTG a baixa temperatura per a l'expressió de proteïnes i els bacteris es van recollir per centrifugació. Es va afegir el tampó de lisi per trencar els bacteris per obtenir el sobrenedant i precipitar, i es va realitzar SDS-PAGE per a la detecció. Els resultats van mostrar que quan es feien servir pET-28a i pET-24b com a vectors d'expressió, CtSus no s'expressava a E. coli, mentre que quan es feia servir pCold™ I com a vector d'expressió, un CtSus clar Es va detectar una banda de proteïnes recombinants a la regió de ~ 100 kDa, que era coherent amb la seva massa molecular relativa teòricament prevista de 92, 2 kDa (figura 1F).

HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVA BAESES COL·LABORA AMB LA UNIVERSITAT DE PEKING

3.2 Transformació cel·lular sencera

Per tal de verificar preliminarment la funció catalítica de CtSus, es va construir una soca de coexpressió de CtSus i el gen de la glicosiltransferasa UGT71BD1. UGT71BD1 es va clonar i es va identificar a partir de Cistanche tubulosa i és una UDP-glucosiltransferasa que pot acceptar àmpliament compostos aromàtics com ara glicòsids feniletanoides, diferents tipus de flavonoides, estilbè i cumarina com a receptors i catalitzar la reacció de glucosilació del substrat fenòlic mitjançant el grup hidroxil UDP. com a donant de sucre[18]. La introducció de CtSus pot proporcionar teòricament un donant de glicosil UDP-glucosa més suficient per a la reacció de glucosilació catalitzada per UGT71BD1, afavorint així l'equilibri de la reacció per avançar cap a la formació de productes de glicosilació, augmentant així el rendiment de productes de glicosilació. El plasmidi pCold™ I-CtSus i el plasmidi pET-28a-UGT71BD1 es van transformar simultàniament en l'expressió competent E. coli Transetta (DE3). Els clons únics que contenien ambdós plasmidis recombinants es van examinar mitjançant PCR de colònies i es van obtenir soques d'expressió recombinant positiva mitjançant la verificació de seqüenciació (figura 1G). La coexpressió gènica dual es va induir in vitro i la soca d'expressió gènica única pET-28aUGT71BD1 es va utilitzar com a grup control. L'activitat de CtSus en la catalització de la generació de donant de glucosa UDP es va verificar preliminarment mitjançant la transformació de cèl·lules senceres. Els resultats de l'HPLC i l'espectrometria de masses d'alta resolució van mostrar que quan es va dur a terme la reacció de transformació cel·lular sencera amb aesculetina 1 i resveratrol 2 com a substrats, es va detectar la generació de productes de glicosilació evidents després de 24 h de transformació, tal com es mostra a la figura 2.

Figura 2 Biotransformació de cèl·lules senceres del substrat 1 o 2 per soca recombinant que alberga UGT71BD1 o soca recombinant que alberga UGT71BD1 acoblada amb CtSus, respectivament. R: Cromatogrames HPLC de la biotransformació cel·lular sencera del substrat 1. La longitud d'ona de detecció era de 360 ​​nm; B: espectres HRESI-MS i MS2 del producte 1a; C: cromatogrames HPLC de la biotransformació cel·lular sencera del substrat 2; La longitud d'ona de detecció va ser de 330 nm. D: Espectres HRESI-MS dels productes 2a i 2b

Quan es va utilitzar 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, fórmula molecular C9H6O4) com a substrat, el pic cromatogràfic del producte 1a (m/z 41.087 2 [M+H] +, fórmula molecular prevista C15H16O9) es va detectar als 5, 39 min, que era coherent amb l'absorció UV del substrat i del producte de control. Al mateix temps, es va detectar el pic del fragment de m/z 179.033 4 [M+H]+ a l'espectre MS2 de 1a, que es va produir quan 1a va perdre una molècula de glucosa (162 Da), cosa que indica que 1a era el producte del substrat 1 connectat a una molècula de glucosa. La taxa de conversió es va calcular integrant l'àrea màxima. Es va trobar que la taxa de conversió de cèl·lules senceres UGT71BD1 que catalitzen el substrat 1 per generar el producte glicosilat 1a va ser del 71, 87%, mentre que l'addició de CtSus va augmentar la taxa de conversió de la reacció al 95, 84%, que va ser 1, 3 vegades la del grup control. Quan el substrat era el compost 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, fórmula molecular C14H12O3), el pic cromatogràfic del producte 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, molecular previst fórmula C20H22O8) i 2b (m/z 575. 175 9 [M+Na]+, fórmula molecular prevista 26H32O13) es van detectar a 10,32 i 6,52 min, respectivament, que eren coherents amb l'absorció UV característica del substrat i el producte de control. Es va detectar un pic de fragment a 227.071 3 [MH]-, que es va produir per la pèrdua d'una molècula de glucosa (162 Da), cosa que indica que 2a era el producte del substrat 2 connectat a una molècula de glucosa. En comparar les dades de la literatura [18] i la informació de predicció de l'espectrometria de masses, es va determinar que el producte 2b era el producte del substrat 2 connectat a dues molècules de glucosa. La taxa de conversió es va calcular utilitzant l'àrea de pic integrada. Es va trobar que l'addició de CtSus podria augmentar la taxa de conversió de la reacció de glicosilació del substrat 2 del 64,01% al 78,51%, entre els quals el rendiment del producte monosacàrid 2a va augmentar del 45,09% al 63,58% i el rendiment del producte disacàrid 2b. va canviar del 18,92% al 14,93%.

3

HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVA BAESES COL·LABORA AMB LA UNIVERSITAT DE PEKING

3.3 CtSus

Purificació de proteïnes recombinants i identificació de l'activitat catalítica de l'enzim in vitro Els resultats de l'experiment de conversió cel·lular sencera van suggerir que CtSus té l'activitat de catalitzar la producció d'UDP-glucosa donant de glucosa activa. Per tal de verificar encara més l'activitat catalítica mitjançant catàlisi enzimàtica in vitro, la proteïna de fusió del gen CtSus en el sistema d'expressió pCold™ es va separar i purificar mitjançant cromatografia d'afinitat. Els resultats van mostrar que quan es va utilitzar pCold™ I com a vector d'expressió, la proteïna recombinant es va expressar en grans quantitats, però sobretot en el precipitat. Quan es va utilitzar pCold™ TF com a vector d'expressió, el gen CtSus es va expressar en grans quantitats a E. coli (figura 3A). La proteïna de fusió es va purificar mitjançant cromatografia d'afinitat HisTrap FF per a una reacció enzimàtica in vitro. Els resultats es mostren a la figura 3B. Quan es van utilitzar sacarosa i UDP com a substrats, en comparació amb el grup control negatiu, es va detectar un nou pic de producte als 10, 32 min. El seu temps de retenció i l'absorció UV eren coherents amb la glucosa UDP. Es va demostrar que el producte era UDP-glucosa en comparació amb l'estàndard. Tanmateix, com que la proteïna de fusió expressada pel vector d'expressió pCold™ TF conté una etiqueta soluble de gran factor desencadenant (la mida de la proteïna de l'etiqueta és de 48 kDa), tindrà un gran impacte en l'activitat catalítica de la proteïna. Per tant, l'etiqueta de la proteïna de fusió es va tallar encara més per l'enzim Factor Xa i es va purificar la proteïna CtSus sense etiquetes exògenes (figura 3A). La proteïna va ser sotmesa a catàlisi enzimàtica in vitro i els resultats van mostrar que el rendiment de glucosa UDP va augmentar del 3,53% al 10,66% (figura 3B). Els resultats anteriors van confirmar l'activitat de CtSus en la catalització de la producció de UDP-glucosa mitjançant catàlisi enzimàtica in vitro, i també van demostrar que la presència d'una gran etiqueta d'afinitat és favorable a l'expressió soluble de CtSus, però també afectarà significativament la in activitat catalítica in vitro de l'enzim.

Figura 3 Expressió heteròloga i identificació funcional de CtSus. R: Anàlisi SDS-PAGE de proteïnes CtSus. Carril 1: marcador de proteïnes; Carril 2: CtSus recombinant amb factor disparador; Carril 3: divisió de l'etiqueta del factor 13 activant utilitzant la proteasa Factor Xa per donar la proteïna CtSus marcada per la fletxa vermella. B: Assajos enzimàtics invitro que utilitzen proteïnes de fusió i proteïnes CtSus lliures de factor desencadenant per catalitzar la síntesi de UDP-glucosa en presència de sacarosa i UDP, respectivament, amb UDP-glucosa estàndard de referència. La proteïna bullida es va utilitzar com a grup control en les mateixes condicions. La longitud d'ona de detecció va ser de 260 nm