Els glucòsids feniletanoides de Cistanche Tubulosa indueixen l'apoptosi a les cèl·lules Eca-109 mitjançant la via dependent dels mitocondris

Introducció

El càncer d'esòfag és un dels tipus de càncer més comuns amb l'11a taxa de morbiditat més alta i la 6a taxa de mortalitat més alta a nivell mundial, i va causar ~439,000 mortalitats el 2015. La incidència del càncer d'esòfag varia notablement entre les diferents regions, amb l'est Àsia i Àfrica oriental i meridional van presentar les taxes d'incidència més altes i Àfrica occidental les taxes més baixes el 2012. A la Xina, els casos i mortalitats estimades per càncer d'esòfag van ser de 477,000 i 375,000, respectivament , l'any 2015. Tot i que la taxa de morbiditat del càncer d'esòfag ha disminuït als països amb índex sociodemogràfic mitjà i mitjà-alt entre 2005 i 2015, la taxa de mortalitat continua sent alta a causa del mal pronòstic. La combinació de la resecció quirúrgica amb quimioteràpia o radioteràpia s'ha utilitzat per tractar el càncer d'esòfag, però, s'ha informat que entre el 2003 i el 2014 la taxa de supervivència 5-any es va mantenir.<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studydemostrat aixòGlucòsids feniletanoides de Cistanche tubulosa(CTPG) podria suprimir el creixement de cèl·lules B16-F10 de melanoma in vitro i in vivo (24). Tanmateix, la poca solubilitat en aigua del CTPG utilitzat anteriorment limita el desenvolupament del fàrmac. Per tant, es va utilitzar CTPG soluble en aigua (CTPG-W) i es va investigar l'efecte antitumoral sobre les cèl·lules canceroses d'esòfag (Eca-109). Es va determinar que CTPG-W podria inhibir de manera dependent de la dosi la viabilitat de les cèl·lules Eca-109 mitjançant la inducció de l'apoptosi mitjançant una via dependent dels mitocondris.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materials i mètodes

Animals.

Les femelles de ratolins C57BL/6 (6-8 setmanes, ~ 25 g) es van comprar al Centre d'Investigació d'Animals de Laboratori de Beijing (Beijing, Xina) i es van allotjar a la temperatura controlada (25˚C), amb cicle de llum (12/ 12) Instal·lació d'animals de la Universitat de Xinjiang (Urumqi, Xina). Tots els animals van rebre aigua i menjar lliures de patògens.

Línia cel·lular i cultiu.

La línia cel·lular de carcinoma d'esòfag humà (Eca-109) va ser conservada pel Laboratori clau de recursos biològics i enginyeria genètica de Xinjiang (Col·legi de Ciències de la Vida i Tecnologia, Universitat de Xinjiang, Urumqi, Xina) i es va cultivar a RPMI{{1} } mitjà (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA) complementat amb un 10% de sèrum fetal boví inactivat per calor (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Xina), 1% L -glutamina (100 mM), 100 U/ml de penicil·lina i 100 µg/ml d'estreptomicina a 37˚C en una atmosfera humidificada amb un 5% de CO2.

Cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC).

CTPG-W (núm. cat. SGJG20170410) es va comprar a Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Xangai, Xina). Els principals compostos de CTPG es van qualificar i quantificar per HPLC segons el nostre estudi anterior (24). Breument, es va realitzar HPLC en una columna ZORBAX SB-C18 (250x4,6 mm; 5 µm) a 30˚C i es va eluir amb una solució d'àcid fòrmic al 0,2% i un gradient de metanol a partir del 23%, ja que s'hi va afegir 1 ml cada min. durant 45 min fins a arribar al 31%. Es va injectar un total de 10 µl de mostra i es va detectar a 330 nm. L'estàndard d'echinacòsid es va comprar a Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Xangai, Xina) i l'estàndard d'acteòsid es va comprar a Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya). Els estàndards es van utilitzar per analitzar els components de CTPG-W.

assaig MTT.

La proliferació cel·lular es va mesurar amb un assaig MTT. Les cèl·lules Eca{{0}} es van inocular en 96-plaques de pous a una densitat de 5x1{03 cèl·lules en 1{00 µl de RPMI{{5 }} mitjà/pou i cultivat a 37˚C durant 24 h, després tractat amb diferents concentracions (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) de CTPG-W o 0,4% de sulfòxid de dimetil (DMSO) durant 24, 48 i 72 h. Es va utilitzar DMSO com a control de dissolvent (800 µg/ml CTPG-W que contenia 0,4% de DMSO). Es va utilitzar cisplatina (20 µg/ml) com a control positiu. Posteriorment, el sobrenedant es va descartar després de la centrifugació a 225 xg durant 5 min a temperatura ambient i es va afegir 100 µl de solució MTT (0, 5 mg/ml en medi RPMI-1640 sense FBS) a cada pou i es va incubar a 37ºC durant 3 h. Els cristalls de formazà formats es van dissoldre en 200 µl de DMSO. Els valors de densitat òptica (DO) es van mesurar a una longitud d'ona de 490 nm mitjançant un lector de microplaques 96-pous (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). La viabilitat cel·lular relativa es va calcular d'acord amb la fórmula: viabilitat cel·lular (%)=(tractat amb OD/no tractat)x100%. La morfologia de les cèl·lules Eca-109 es va observar amb un microscopi de fluorescència invertida (ampliació, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tòquio, Japó).

Per a la proliferació d'esplenòcits, es van sacrificar ratolins C57BL/6 per luxació cervical i es van aïllar les melses. Es va fer la suspensió unicel·lular i es van sembrar esplenòcits en 96-plaques de pou a una densitat de 1x105 cèl·lules/pou en 100 µl de medi RPMI-1640 i després es van tractar amb diferents concentracions (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) de CTPG-W durant 24, 48 i 72 h a 37˚C amb un 5% de CO2. La proliferació d'esplenòcits es va mesurar mitjançant un assaig MTT, segons el protocol esmentat. Índex estimulant=O tractat/O no tractat.

Mesura de l'apoptosi i el cicle cel·lular. Les cèl·lules Eca{{{0}} es van cultivar en plats de 6{0 mm a una densitat de 2,5x1{05 cèl·lules/plat durant 24 h i es van tractar amb diferents concentracions ({{31} }, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) de CTPG-W o 0,4% de DMSO durant 24 h a 37˚C amb un 5% de CO2. Les cèl·lules es van recollir i es van tacar amb un kit de detecció d'apoptosi d'isotiocianat de fluoresceïna Annexin V (FITC)/iodur de propidi (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Xangai, Xina), segons els protocols del fabricant. Les mostres es van recollir mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) i es van analitzar per FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EUA). Per analitzar l'efecte de CTPG-W en el cicle cel·lular, es van sembrar cèl·lules Eca-109 2,5x105 en plats de cultiu de 60 mm i es van tractar amb CTPG-W (0, 100, 200 i 400 µg/ml) o 0,4. % DMSO durant 24 h a 37˚C amb un 5% de CO2. Totes les cèl·lules es van collir i es van rentar dues vegades amb PBS gelat (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), després es van fixar en etanol fred al 70% a 4 °C durant 30 min. Després de rentar-se dues vegades amb PBS gelat, les cèl·lules es van tornar a suspendre en 300 µl de tampó de tinció PI/RNasa (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) durant 10 min a temperatura ambient. La distribució del cicle cel·lular es va analitzar amb el programari ModFit LT 3.0 mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur).

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHEAntifatigaProtegir el fetge PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Anàlisi del potencial de membrana mitocondrial (Δψm) i espècies reactives d'oxigen (ROS).Per analitzar el Δψm, les cèl·lules Eca{{0}} es van tractar amb CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) o DMSO al 0,4% per a 24 h a 37˚C amb un 5% de CO2, i tenyida amb el kit d'assaig de potencial de membrana mitocondrial amb JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Xangai, Xina), segons el protocol del fabricant, durant 20 min a 37˚ C. Després de rentar dues vegades amb tampó de rentat JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology), les mostres es van tornar a suspendre amb 300 µl de tampó de rentat JC-1 i es van analitzar mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur). La fluorescència del colorant JC-1 a les cèl·lules Eca-109 també es va observar amb un microscopi de fluorescència invertida (ampliació, x200; Nikon Eclipse Ti-E). Per a l'anàlisi de ROS, les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) durant 2, 4, 6, 12 i 24 h i es van tacar amb l'assaig d'espècies d'oxigen reactiu. kit (Beyotime Institute of Biotechnology), segons el protocol del fabricant, durant 20 min a 37˚C. Després del rentat tres vegades amb PBS gelat, es van recollir mostres mitjançant citometria de flux (BD FACSCalibur) i es van analitzar amb el programari FlowJo 7.6.

Figura 1. El control qualificat de CTPG-W. Els components de CTPG-W es van analitzar qualitativament i quantitativament mitjançant cromatografia líquida d'alt rendiment i es van comparar amb els estàndards d'echinacòsid i acteòside. CTPG-W, glucòsids feniletanoides solubles en aiguaC. tubulosa.

Activitat d'eliminació de radicals 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). L'activitat d'eliminació de radicals lliures de CTPG-W es va determinar amb un assaig de radicals lliures DPPH segons el protocol publicat amb una modificació menor, ja que el metanol es va substituir per etanol per dissoldre DPPH (25, 26). Per a mesures en estat estacionari, es van barrejar 150 µl de DPPH (100 mmol/l) en etanol amb diferents concentracions de CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 i 600 µg/ml) en 50 µl de PBS i es va incubar a la foscor durant 30 min a temperatura ambient. L'absorbància a 517 nm es va detectar en presència i absència de CTPG-W. Es va utilitzar un total de 50 µl de vitamina C com a control positiu. L'activitat d'eliminació de radicals DPPH es va calcular mitjançant la fórmula: Scavenging (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, on Ablank és l'absorbància del control (sense DPPH), Asample és l'absorbància de la mostra i A0 és l'absorbància de PBS amb DPPH.

Anàlisi Western blot. Les cèl·lules Eca{{0}} es van tractar amb CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) o DMSO al 0,4% durant 24 h a 37˚C amb un 5% de CO2. El següent rentat dues vegades amb PBS, cèl·lules 

Figura 2. L'efecte de CTPG-W sobre el creixement de cèl·lules i esplenòcits Eca-109. (A) Les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG-W durant 24, 48 i 72 h, i després es va detectar la viabilitat cel·lular amb un assaig MTT. (B) Els canvis morfològics de les cèl·lules Eca-109 després del tractament CTPG-W a les 24 h. ( C ) Els esplenòcits de ratolins C57BL / 6 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG-W durant 24, 48 i 72 h, i després es va analitzar la proliferació amb un assaig MTT.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulosa.

es van lisar al tampó de lisi d'assaig de radioimmunoprecipitació (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Xina) durant 20 minuts sobre gel. Després de la centrifugació a 10,000 xg durant 10 min a 4˚C, es van recollir els sobrenedants i es van detectar les concentracions de proteïnes amb un kit d'àcid bicinconínic (Thermo Fisher Scientific, Inc.) segons els protocols del fabricant. L'anàlisi de Western blot es va realitzar segons la nostra descripció anterior (24). Els anticossos contra caspasa-7 (núm. cat. D120077), caspasa-8 (núm. cat. D155240), caspasa-9 (núm. cat. D220078), limfoma de cèl·lules B{{ {13}} (Bcl-2) associat a X (Bax) (núm. cat. D220073) i Bcl-2 (núm. cat. D260117) i peroxidasa de rave picant anti-IgG (HRP) ) (núm. cat. D111050) i IgG-HRP anti-conill (núm. cat. D110058) es van comprar a BBI Life Sciences (Xangai, Xina). Els anticossos contra la caspasa-3 (núm. cat. E-AB-10050) i la caspasa activa-3 (núm. cat. E-AB{-22115) es van comprar a Elabscience ( Wuhan, Xina). Altres anticossos contra la caspasa-7 (cat. núm. 9492), poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) (cat. núm. 9542), citocrom c (cat. núm. AC909), c-Jun NH{ {37}}La quinasa terminal (JNK) (núm. cat. 9252S) i l'actina (núm. cat. 58169) es van obtenir de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EUA). Tots els anticossos primaris i secundaris es van diluir a 1:1,000. Els anticossos primaris es van incubar a 4 °C durant la nit i els anticossos secundaris es van incubar a 37 °C durant 1 h.

Figura 3. L'apoptosi de cèl·lules Eca-109 induïda per CTPG-W. Les cèl·lules es van tractar amb diferents concentracions de CTPG-W durant 24 h. (A) Les cèl·lules Eca-109 apoptòtiques i necròtiques es van analitzar mitjançant citometria de flux. El tauler superior representa els diagrames de punts individuals i el panell inferior representa les dades de resum. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulosa.

Les proteïnes diana es van detectar mitjançant un kit d'assaig de quimioluminescència millorat (Beyotime Institute of Biotechnology), segons el protocol del fabricant.

Anàlisi estadística. La significació estadística es va calcular mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància amb la prova post hoc de Tukey i els resultats es van analitzar mitjançant el programari GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA) entre els grups de tractament i control. Totes les dades es van presentar com a mitjana ± desviació estàndard. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

EXTRACTE DE CISTANCHE TUBULOSA PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ RENOL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Resultats

CTPG-W suprimeix el creixement de cèl·lules Eca-109.

Els components de CTPG-W es van qualificar i quantificar per HPLC (Fig. 1), que es van comparar amb els estàndards d'equinacòsid i acteòsid. Segons els temps de retenció màxims i les àrees màximes, CTPG-W contenia un 39,16% d'echinacòsid i un 2,44% d'acteòsid. En primer lloc, es va determinar l'efecte de CTPG-W sobre la viabilitat de les cèl·lules Eca-109 amb un assaig MTT. CTPG-W es va dissoldre en DMSO a 200 mg/ml i es va diluir amb un medi RPMI-1640 que contenia un 10% de FBS inactivat per calor fins a les concentracions indicades. Les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb CTPG-W i es va analitzar la viabilitat cel·lular amb un assaig MTT en els punts de temps indicats. El tractament amb CTPG-W va reduir significativament la viabilitat de les cèl·lules Eca-109 de manera dependent de la dosi i del temps (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Figura 4. L'efecte de CTPG-W sobre la distribució del cicle cel·lular a les cèl·lules Eca-109. Es van utilitzar diferents concentracions de CTPG-W per tractar cèl·lules Eca-109 durant 24 hores i es va analitzar la distribució del cicle cel·lular mitjançant citometria de flux. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Tubulosa.

CTPG-W indueix apoptosi a les cèl·lules Eca-109. Per investigar si CTPG-W va suprimir el creixement de cèl·lules Eca-109 mitjançant la inducció d'apoptosi o necrosi, les cèl·lules es van tractar amb diferents concentracions de CTPG-W. Després de 24 h, es van detectar l'apoptosi i la necrosi de les cèl·lules Eca-109 amb la tinció d'Annexina V/PI. Tal com es mostra a la figura 3A, les cèl·lules de l'annexina V-/PI+ estaven tancades com a cèl·lules necròtiques, i les cèl·lules de l'annexina V+/PI+ i l'annexina V+/PI- com a cèl·lules apoptòtiques. CTPG-W va induir principalment l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109 de manera dependent de la dosi, tot i que les cèl·lules Eca-109 necròtiques també van augmentar significativament amb el tractament de 600 i 800 µg/ml de CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W indueix l'aturada del cicle cel·lular a la fase S a les cèl·lules Eca-109. La alteració del cicle cel·lular del càncer suprimirà el creixement cel·lular i promourà l'apoptosi (27). La distribució del cicle cel·lular a les cèl·lules Eca-109 es va detectar amb una tinció de PI després del tractament CTPG-W durant 24 h. Es va observar que les cèl·lules en la fase S van augmentar i les cèl·lules en les fases G0/G1 van indicar una disminució significativa general amb el tractament CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W disminueix Δψm i indueix l'alliberament del citocrom c. L'apoptosi es pot induir per una via dependent dels mitocondris (28,29). Els membres pro i antiapoptòtics de la família de proteïnes BCL-2 tenen un paper important en la regulació de la integritat de la membrana mitocondrial (30,31). Després del tractament CTPG-W durant 24 h, es va avaluar el Δψm mitjançant la tinció JC-1. L'agregat JC-1 (fluorescència vermella detectada a FL-2) es desintegrarà en monòmer (fluorescència verda detectada a FL-1) quan Δψm es redueix (32). Tal com es mostra a la figura 5A, les freqüències de les cèl·lules FL-1+ FL{-2-/+ van augmentar significativament de manera dependent de la dosi, cosa que indica que el Δψm de les cèl·lules Eca-109 va disminuir. Els canvis de fluorescència a les cèl·lules Eca-109 també es van observar amb un microscopi de fluorescència invertida (Fig. 5B). Amb l'augment de les concentracions de CTPG-W, la fluorescència vermella va disminuir i la fluorescència verda va augmentar, cosa que és coherent amb les dades de la citometria de flux. També es va observar que el nivell de citocrom c al citosol va augmentar notablement (Fig. 5C), que és el resultat d'una reducció de Δψm. Això reforça la conclusió extreta de l'augment del recompte de cèl·lules FL-1+ FL{-2-/+ que Δψm va disminuir com a resultat del tractament CTPG-W. S'ha informat que la JNK pot regular l'activació de la família de proteïnes BCL-2 provocant l'alliberament del citocrom c (33-35). També es va determinar que el nivell de JNK es va augmentar notablement després del tractament amb CTPG-W (Fig. 5C). Els resultats van indicar que CTPG-W pot induir l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109 a través d'una via dependent dels mitocondris.

Figura 5. La reducció de Δψm i la regulació positiva del citocrom c i JNK. Les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG-W durant 24 h. (A) Es va detectar Δψm mitjançant la tinció JC-1 i les mostres es van analitzar mitjançant citometria de flux. Els diagrames de punts individuals representen els canvis en la fluorescència JC-1. Les freqüències de les cel·les FL-1+ FL{-2-/+ es mostren al panell inferior. ***Pàg<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Figura 6. Els nivells de ROS a les cèl·lules Eca-109 després del tractament amb CTPG-W i l'activitat antioxidant de CTPG-W. (A) Les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG-W i es van analitzar els nivells de ROS mitjançant citometria de flux en els punts de temps indicats. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

L'efecte de CTPG-W sobre la generació intracel·lular de ROS.ROS podria reduir Δψm per induir l'apoptosi (36). Per investigar si CTPG-W pot augmentar la producció de ROS, les cèl·lules Eca-109 es van tractar amb diferents concentracions de CTPG-W. Les cèl·lules es van recollir als punts de temps indicats i es van tacar amb DCFH-DA. La producció de ROS intracel·lular a les cèl·lules Eca-109 es va determinar mitjançant citometria de flux. Tal com es mostra a la figura 6A, 800 µg/ml de CTPG-W van augmentar significativament la producció de ROS a partir de 2-6 h i va disminuir a partir de 12-24 h. A més, 400 µg/ml de CTPG-W van augmentar significativament la producció de ROS a partir de 12-24 h. A més, 200 µg/ml de CTPG-W no van alterar notablement la producció de ROS. Els canvis dinàmics en la producció de ROS poden estar associats amb l'apoptosi de cèl·lules Eca-109. També es va determinar que CTPG-W tenia activitat d'eliminació de radicals lliures (Fig. 6B), que pot estar associada amb la disminució de la producció de ROS a les cèl·lules Eca-109 tractades amb 800 µg/ml de CTPG-W després de 12 h.

Figura 7. Els nivells de cleaved-caspases i cleaved-PARP després del tractament CTPG-W. Les proteïnes es van aïllar de cèl·lules Eca-109 tractades amb CTPG-W durant 24 hores i es van detectar els nivells de caspases escindides i de PARP escindits amb l'anàlisi de western blot. DMSO, sulfòxid de dimetil; CTPG-W, glucòsids feniletanoides solubles en aiguaC. Tubulosa; PARP, poli (ADP-ribosa) polimerasa.

CTPG-W regula l'activitat de la caspasa-3, la caspasa-7, la caspasa-9 i el PARP. L'alliberament del citocrom c a causa de la reducció de Δψm podria activar les proteases de la caspasa per induir l'apoptosi (29,30,37). Després del tractament amb CTPG-W durant 24 hores, es va detectar l'activació de la caspasa -3, 7, 8, 9 i PARP mitjançant l'anàlisi de western blot. En comparació amb el control, els nivells de caspasa clivada-9, caspasa clivada-7, caspasa clivada-3 i PARP clivada, però no els nivells de caspasa clivada{{20} }}, van ser regulats pel tractament amb CTPG de manera dependent de la dosi (Fig. 7). Aquests resultats van indicar que CTPG-W va reduir Δψm i va promoure l'alliberament del citocrom c per activar les caspases que indueixen l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109.

Discussió

La CHM tradicional podria induir l'apoptosi de les cèl·lules canceroses d'esòfag a través de diferents vies, inclòs el receptor extrínsec de la mort i les vies d'estrès intrínseques del reticle mitocondrial i endoplasmàtic (29). El nostre estudi anterior va demostrar que el CTPG, com a component principal de C. tubulosa, va inhibir el creixement de cèl·lules B16-F1{0 de melanoma mitjançant la inducció de l'apoptosi mitjançant una via dependent dels mitocondris (24). En el present estudi, es va investigar l'efecte antitumoral de CTPG-W a les cèl·lules Eca-109 i es va determinar que CTPG-W va suprimir el creixement de les cèl·lules Eca{-109, va induir l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular, va reduir Δψm, va augmentar l'alliberament del citocrom c i va activar les caspases. CTPG i CTPG-W podrien induir l'apoptosi i l'aturada del cicle cel·lular a les cèl·lules canceroses. No obstant això, els mecanismes precisos són diferents a causa dels diferents components de CTPG (26,64% equinacòsid, 10,19% acteòsid i 1,71% isoacteòsid) i CTPG-W (39,16% equinacòsid i 2,44% acteòsid). CTPG va detenir cèl·lules B16-F10 a les fases G0/G1, però CTPG-W va detenir cèl·lules Eca{-109 a la fase S (24). La producció de ROS va augmentar en funció de la dosi per CTPG, però va indicar un canvi de manera dependent del temps per una dosi elevada de CTPG-W, que va augmentar significativament al començament del tractament amb CTPG-W (2-6 h) i va disminuir significativament després de 12 h, en comparació amb el control. Una possible raó és que el component principal de CTPG-W és l'echinacòsid. Diversos estudis van informar que l'equinacòsid podria inhibir la producció de ROS i l'apoptosi induïda per ROS per exercir els seus efectes neuroprotectors i anti-envelliment (38-40). De la mateixa manera, en el present estudi es va observar l'activitat d'eliminació de radicals lliures. Per tant, es va especular que alguns components, inclosos el verbascòsid, iso-verbascòsid i salidroside en una dosi elevada de CTPG-W podrien induir immediatament la generació de ROS per provocar l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109 (41, 42), i després ROS va ser eliminada per echinacòsid. Una altra possible raó de les diferències en la producció de ROS per CTPG i CTPG-W és que es van utilitzar diferents línies cel·lulars en aquest estudi i en l'estudi anterior (24). Dong et al (43) van informar que l'echinacòsid podria induir l'apoptosi de les cèl·lules de càncer colorectal humans SW480 mitjançant la generació de danys oxidatius a l'ADN sense augmentar els nivells de ROS.

El tractament amb CTPG-W va reduir Δψm i va provocar l'alliberament del citocrom c, que afavoreix la divisió de la caspasa -9 (28). De manera consistent, els nivells de caspasa escindida-9 es van regular amb el tractament CTPG-W. Posteriorment, la caspasa activa-9 pot activar la caspasa-3 per induir l'apoptosi (44). Els nivells de caspasa escindida-3 també es van regular amb el tractament CTPG-W. Tanmateix, la caspasa -8 no va ser activada per CTPG-W, cosa que indica que la via extrínseca del receptor de la mort no estava implicada en l'apoptosi induïda per CTPG-W. Aquestes observacions indiquen que CTPG-W indueix l'apoptosi de les cèl·lules Eca-109 mitjançant l'activació d'una via dependent dels mitocondris.

PARP té un paper important en l'estabilitat genòmica i es pot escindir per les caspases actives, especialment la caspasa-3 i -7 (45). Es va determinar que el tractament amb CTPG-W activava la caspasa-3 i -7, que poden escindir PARP per inhibir la reparació de l'ADN i provocar l'apoptosi.

CTPG-W també suprimeix depenent de la dosi i del temps el creixement de cèl·lules BEL-7404 de carcinoma hepatocel·lular humà (dades no publicades). Tot i que CTPG-W inhibeix el creixement de cèl·lules Eca-109 i BEL{-7404, afavoreix la proliferació d'esplenòcits, que pot ser degut al contingut de polisacàrids (~50%) en CTPG-W (46). ). De la mateixa manera, diversos estudis han informat que els polisacàrids poden promoure la proliferació d'esplenòcits (46-49). En el model de ratolí, es va determinar que CTPG-W va augmentar significativament l'índex de melsa, en comparació amb el grup control, però no va afectar el pes corporal i els altres índexs d'òrgans, inclosos el cor, el fetge, el ronyó i el pulmó (dades no publicades), indicant que CTPG-W no té cap efecte citotòxic sobre les cèl·lules normals.

Col·lectivament, les dades van indicar que CTPG-W inhibeix el creixement de les cèl·lules Eca-109 mitjançant la inducció de l'apoptosi a través d'una via dependent dels mitocondris.

TUBULOSA NATURAL DE CISTANCHE PER A LA MILLORA DE LA FUNCIÓ SEXUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%