Extracte de Cistanche Deserticola augmenta la formació òssia en osteoblasts - Part I

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^unet a

Abstracte
Objectius Hem investigat l'efecte deCistanchedeserticolaMa. (CD) enosformacióosteoblasts cultivats. Mètodes L'assaig de formació de nòduls mineralitzats es va utilitzar per examinar els efectes in vitro del CD(Cistanchedeserticola)sobreosformació. La fosfatasa alcalina (ALP), les proteïnes morfogenètiques òssies (BMP)-2 i l'expressió d'ARNm d'osteopontina (OPN) van ser analitzades mitjançant la reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real. El mecanisme d'acció del CD(Cistanchedeserticola)l'extracte es va investigar utilitzant western blotting. L'efecte anti-osteopomàtic in vivo del CD(Cistanchedeserticola)l'extracte es va avaluar en ratolins ovariectomitzats.
Resultats clau

CD(Cistanchedeserticola)L'extracte no va tenir cap efecte sobre la proliferació, migració o cicatrització de ferides d'osteoblasts cultivats, però va augmentar l'ALP, BMP-2 i l'ARNm OPN i la mineralització òssia. Inhibidors de la proteïna quinasa activada per mitogen (MAPK) o factor nuclear (NF)-kB(Cistanchedeserticola)induït per l'extracteformació òssiai l'expressió ALP, BMP-2 i OPN. No obstant això, el CD(Cistanchedeserticola)l'extracte no va afectar l'osteoclastogènesi. A més, el CD(Cistanchedeserticola)extracte evitava la pèrdua òssia induïda per l'ovariectomia in vivo.
Conclusions

CD(Cistanchedeserticola)Pot ser una novel·laformació òssiaAgent per al tractament de l'osteoporosi.

Paraules clauformació òssia;Cistanchedeserticola; Herba xinesa; osteoblasts

Cistanche deserticolaés bo performació òssia

Introducció

L'os és un teixit complex compost per diversos tipus cel·lulars que se sotmeten a un procés continu de renovació i reparació anomenat "remodelació òssia". Dos tipus cel·lulars principals responsables de la remodelació òssia són els osteoclasts, que reorbeixen l'os, i els osteoblasts, que formen un nou os. La remodelació òssia està regulada per diverses hormones sistèmiques (per exemple, hormona paratiroïdal, 1, 25-dihidroxi vitamina D3, hormones sexuals i calcitonina) i factors locals (per exemple, òxid nítric, prostaglandines, factors de creixement i citocines). [1] L'osteoporosi resulta quan la reorció i la formació de l'os estan descoordinats i l'excés de ruptura òssia supera la construcció òssia. [2] Els tractaments actuals per a l'osteoporosi inclouen bisfosfonats, calcitonina i estrògens, que són inhibidors de la reorpció òssia que mantenen la massa òssia inhibint l'activitat osteoclast. [3] No obstant això, l'efecte d'aquests fàrmacs en l'augment o recuperació de la massa òssia és relativament petit, certament no més del 2% per any. [3] Per tant, hi ha una necessitat d'agents de construcció d'ossos, com la teriparatida, que estimulin novesosformaciói corregir el canvi en la microarquitectura trabecular que és característic de l'osteoporosi establerta. [4,5] Perquèosformacióés principalment una funció de l'osteoblast, agents que actuen augmentant la proliferació de cèl·lules del llinatge osteoblastic o induint la diferenciació dels osteoblasts pot millorar la formació òssia. [5,6]
Tot i que els mecanismes de l'osteoporosi encara no estan clars, és probable que estiguin relacionats amb la disminució de la disponibilitat o els efectes dels factors de creixement ossi, com les proteïnes morfogenètiques òssies (PMC). [7] Els BMPs, que estan estructuralment relacionats amb la superfamília transformant del factor de creixement b, es van identificar originalment per la seva capacitat d'induir ectòpics.os formacióen rosegadors. [8] Els BMPs juguen un paper important enosformaciói diferenciació cel·lular òssia estimulant l'activitat de la fosfatasa alcalina (ALP), així com la síntesi de proteoglicans, col·lagen i osteopontina (OPN). [9] Un estudi recent va trobar un vincle entre l'osteoporosi i els polimorfismes específics en els gens BMP-2, ALP i OPN, el que suggereix que estan associats amb el desenvolupament de l'osteoporosi. [10]

CistanchedeserticolaMa. (Orobanchaceae; abreujat com CD)(Cistanchedeserticola)És una herba nativa de la Xina i s'utilitza àmpliament en medicina tradicional com a agent terapèutic a causa de les seves propietats sedants, analgèsiques i immunoestimuladores. [11] Estudis farmacològics moderns han demostrat que el CD(Cistanchedeserticola)els extractes poden estimular la immunitat,[12] eliminar els radicals lliures[13], i augmentar l'activitat de la superòxid dismutasa. [14] Els agents antiinflamatoris i antioxidants tenen el potencial de tractar l'osteoporosi augmentantos formaciói/o supressió de la reorció òssia. [15,16] No obstant això, l'efecte del CD(Cistanchedeserticola)la funció cel·lular òssia encara no s'ha determinat. A continuació us informem que el CD(Cistanchedeserticola)L'extracte no va afectar la proliferació, migració o activitat de curació de ferides dels osteoblasts cultivats, però va augmentar l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN i la mineralització òssia. A més, demostrem que les vies de senyalització de la proteïna quinasa activada per mitogen (MAPK) i el factor nuclear (NF) -kB poden estar involucrades en l'augment mediat per CD en l'expressió gènica i la mineralització òssia. En canvi, el CD(Cistanchedeserticola)l'extracte no va suprimir l'osteoclastogènesi in vitro. Cal destacar el tractament de ratolins amb CD(Cistanchedeserticola)extracte evitat pèrdua òssia induïda per ovariectomia in vivo. Les nostres dades, per tant, suggereixen que el CD(Cistanchedeserticola)Es pot utilitzar per estimularosformacióPer al tractament de l'osteoporosi.

Cistanche deserticolaAugmentar la immunitat

Materials i mètodes

Extracte i materials de Cistanche deserticola

CD(Cistanchedeserticola)L'extracte va ser comprat a la Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Extracció i aïllament de CD(Cistanchedeserticola)es van seguir com es descriuen anteriorment (sobre la base de dades espectrals que han identificat la composició química incloent beta-sitosterol, daucosterol, àcid succínic, triacontanol, acteòdid, betaïna i polisacàrid). [17] Anticossos policlonals de conill específics per a quinases regulades per senyals p-extracel·lulars (ERK), ERK, p-p38, p38, p-c-Jun N-terminal kinases (JNK), JNK, p-p65 i p65 es van comprar a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, EUA). El kit ELISA d'osteocalcina va ser adquirit a Biosource Technology (Nivelles, Bèlgica). Els telopèptids C-terminals del kit ELISA de col·lagen tipus I es van obtenir de Cross Laps (Herlev, Dinamarca). El mutant p38 dominant negatiu va ser proporcionat pel Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, EUA). El mutant dominant negatiu JNK va ser proporcionat pel Dr. M. Karin (Universitat de Califòrnia, San Diego, EUA). El mutant dominant negatiu ERK2 va ser proporcionat pel Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Tots els altres reactius van ser obtinguts de Sigma-Aldrich (St Louis, EUA).

Cultiu cel·lular

La línia cel·lular d'osteoblast murina MC3T3-E1 va ser comprada a American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Estats Units). Les cèl·lules es van cultivar en un 95% d'aire, un 5% de CO2 amb un MEM que es va complementar amb HEPES de 20 mm i un 10% de sèrum de panxell fetal inactivat per calor, 2 mm-glutamina, penicil·lina (100 U /ml) i estreptomicina (100 mg /ml).

Mesura de la formació de nòduls mineralitzats

La formació de nòduls mineralitzats va ser avaluada com es descriu. [18] En resum, els osteoblasts es cultivaven en un medi que contenia vitamina C (50 mg / ml) i b-glicerofosfat (10 mm) durant dues setmanes, i el medi es canviava cada tres dies. Després de la incubació amb CD(Cistanchedeserticola)extracte durant 12 dies, les cèl·lules es van rentar dues vegades amb salina tris-amortimentada de 20 mm que conté 0,15 m NaCl (pH 7,4), fixada en gel fred 75% (v / v) etanol durant 30 min, i assecat a l'aire. La deposició de calci es va determinar utilitzant tinció vermella-S d'alizarina. Breument, les cèl·lules fixes d'etanol i la matriu es van tenyir durant 1 h amb alizarina vermell-S de 40 mm (pH 4,2) i es van esbandir àmpliament amb aigua. La taca lligada es va eludir amb un 10% (w / v) clorur de cetylpíridini i alizarina vermell-S en les mostres es va quantificar mesurant l'absorbància a 550 nm i en comparació amb una corba estàndard. Un mol d'alizarina vermell-S s'uneix selectivament a aproximadament dos mols de calci.

Cistanche deserticolaés bo performació òssia

Reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real

L'ARN total es va extreure d'osteoblasts utilitzant un kit TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). La transcripció inversa es va realitzar utilitzant 2 mg d'ARN total i una imprimació oligo(dT). [19,20] La reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real (qPCR) es va dur a terme utilitzant TaqMan® Master Mix de PCR d'un sol pas (Applied Biosystems, Carlsbad, EUA). Es va afegir cDNA total (100 ng per reacció de 25 ml) amb imprimacions específiques de seqüència i sondes Taqman®. Totes les imprimacions i sondes de gens diana es van comprar comercialment, inclosa la b-actina com a control intern (Applied Biosystems). Els assays qPCR es van dur a terme per triplicat en un sistema de detecció de seqüències StepOnePlus (Applied Biosystems). Les condicions de ciclisme van ser d'activació de la polimerasa de 10 min a 95 °C seguida de 40 cicles de 95 °C per 15 s i 60 °C per 60 s. El llindar es va establir per sobre del fons de control sense plantilla i dins de la fase lineal d'amplificació de gens diana per calcular el nombre de cicle en què es va detectar la transcripció (denotat CT).

Anàlisi de blot occidental

Les lisats cel·lulars es van preparar com s'ha descrit anteriorment. Les proteïnes van ser resoltes per SDS-PAGE i transferides a membranes de difluorurs de polivinil Immobilon (Millipore, Billerica, EUA). Les taques es van bloquejar amb albúmina sèrica bovina del 4% durant 1 h a temperatura ambient i després es van sondejar amb anticossos antihumans de conill contra p-65, o p-p65 (1: 1000) durant 1 h a temperatura ambient. Després de tres rentats, les taques es van incubar amb anticòs secundari anti-conill conjugat amb peroxidasa (1: 1000) durant 1 h a temperatura ambient. Les taques van ser visualitzades per quimioluminescència millorada utilitzant pel·lícula X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, EUA).

Osteoporosi induïda per ovariectomia

Per a aquest estudi es van utilitzar ratolins femelles d'ICR, de quatre setmanes d'edat, 22 ~ 28 g. Els ratolins van ser ovariectomitzats bilateralment sota l'anestèsia de tricloroacetaldehid (100 mg / kg) i els ratolins de control van ser operats per farsa (Sham) per a la comparació. La densitat mineral òssia i el contingut mineral ossi es van mesurar després de l'administració oral de diverses concentracions de CD(Cistanchedeserticola)Extreure cada dos dies durant quatre setmanes. La densitat mineral òssia total del cos i el contingut mineral ossi van ser determinats per un absorptiòmetre de raigs X de doble energia (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, EUA) utilitzant un mode per a temes petits com s'ha descrit anteriorment. [18,23] Tots els protocols van complir amb les directrius institucionals i van ser aprovats pel Comitè d'Atenció Animal de la Universitat Mèdica de la Xina.

Anàlisi estadística

L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant Prism 4.01software. (GraphPad Software Inc., San Diego, ESTATS UNITS). Els valors donats són mitjans SEM. L'anàlisi estadística entre dues mostres s'ha realitzat mitjançant la prova t de l'Estudiant. Les comparacions estadístiques de més de dos grups es van realitzar utilitzant una anàlisi uníver de la variància amb la prova posthoc de Bonferroni. En tots els casos, P< 0.05="" was="" considered="">

Cistanche deserticolaés bo performació òssia

Resultats

Cistanche deserticolaextracte augmenta la mineralització òssia per osteoblasts Addició del CD(Cistanchedeserticola)l'extracte per 24 o 48 h no va afectar la proliferació de cèl·lules MC3T3-E1 d'osteoblast de ratolí en un assaig MTT (dades no mostrades). Com que la diferenciació d'osteoblasts és un procés complex que implica la proliferació i migració cel·lular, també vam provar la capacitat migratòria de les cèl·lules MC3T3-E1 després del tractament amb CD.(Cistanchedeserticola)extreure. Utilitzant Transwell i assays de curació de ferides, vam trobar que CD(Cistanchedeserticola)l'extracte no ha afectat la migració d'osteoblasts (no es mostren dades). La formació de nòduls mineralitzats és un dels marcadors de maduració dels osteoblasts. La tinció vermella d'alizarina va mostrar que els nòduls mineralitzats es van formar quan els osteoblasts es cultivaven durant dues setmanes en un medi que contenia vitamina C (50 μg / ml) i β-glicerofosfat (10 mm), la forma dependent de la concentració mitjançant l'addició de CD(Cistanchedeserticola)(Figura 1a). Per tant, el CD(Cistanchedeserticola)Extreure la formació induïda de nòduls ossis per osteoblasts cultivats, però no la seva proliferació o migració. També vam analitzar el paper del CD(Cistanchedeserticola)extracte en osteoclastogènesi induïda per RANKL, però no va trobar cap efecte (dades no mostrades).

L'extracte de Cistanche deserticola augmenta la fosfatasa alcalina, la proteïna morfogenètica òssia-2 i l'expressió d'osteopontina en osteoblasts cultivats

Els osteoblasts diferenciats presenten una activitat ALP elevada, que es correlaciona amb alts nivells d'expressió enzimàtica. [18] Hem trobat aquest tractament amb CD(Cistanchedeserticola)extracte per 72 h significativament augment de l'activitat d'Osteoblast ALP (Figura 1b). Tenint en compte el paper crucial de BMP-2, ALP i OPN en la diferenciació d'osteoblasts, vam provar si el CD(Cistanchedeserticola)L'extracte exerceix el seu efecte sobre la diferenciació d'osteoblasts mitjançant la regulació de l'expressió de BMP-2, ALP i OPN. Tractament de cèl·lules amb CD(Cistanchedeserticola)extractes va augmentar l'expressió d'ARNm d'ALP, BMP-2 i OPN d'una manera dependent de la concentració (Figura 1c), demostrant que el CD(Cistanchedeserticola)Extreure la diferenciació induïda d'osteoblasts mitjançant la regularització de l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN.

L'extracte de Cistanche deserticola augmenta la formació de nòduls ossis a través de la via de la proteïna quinasa activada per mitogen

S'ha informat que MAPK té un paper important enosformació[24,25] així que a continuació vam examinar si aquesta via de senyalització està involucrada en CD(Cistanchedeserticola)mineralització òssia induïda per extractes. Pretractament de cèl·lules amb inhibidor de L'ERK U0126, inhibidor de p38 SB203580, o inhibidor JNK SP600125 CD reduït(Cistanchedeserticola)mineralització òssia augmentada per extractes (Figures 2a, 3a i 4a). A més, els inhibidors també van bloquejar el CD(Cistanchedeserticola)expressió ALP, BMP-2 i OPN induïda per extractes (Figures 2b–4c). Transfecció de cèl·lules amb CD reduït mutant ERK2, p38 o JNK(Cistanchedeserticola)extract-augment en l'expressió d'ARNm ALP, BMP-2 i OPN (Figures 2c, 3c i 4c). A continuació, vam examinar directament l'activació ERK, p38 i JNK després del CD(Cistanchedeserticola)tractament d'extracte. Incubació de cèl·lules amb CD(Cistanchedeserticola)extracte induït ERK, p38, i fosforilació JNK (Figures 2d, 3d i 4d). Per tant, ERK, p38 i JNK mitjancen en l'augmentosformacióInduït pel CD(Cistanchedeserticola)Tractament d'osteoblasts.

L'extracte de Cistanche deserticola augmenta la formació de nòduls ossis a través de la via factor-kB nuclear

Com s'ha esmentat anteriorment, l'activació NF-kB és necessària perosformació. [26,27] A continuació, vam tractar osteoblasts amb inhibidors de la PIRROLIDINA dithiocarbamat (PDTC) i N-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK) es van comprar a Calbiochem (Darmstadt, Alemanya) per determinar si l'activació de NF-kB està involucrada en CD(Cistanchedeserticola)mineralització òssia induïda per extractes. La figura 5a mostra que el pretractament d'osteoblasts amb PDTC o TPCK va inhibir el CD(Cistanchedeserticola)formació de nòduls ossis induïts per extracte, i també va reduir l'augment de l'expressió d'ALP, BMP-2 i OPN (Figura 5b i 5c). La fosforilació de la subunitat NF-kB p65 és un indicador de l'activació NF-kB; [28] d'acord amb això, trobem que el CD(Cistanchedeserticola)extracte augmentat la fosforilació p65 en els osteoblasts (Figura 5d). Aquests resultats van indicar que l'activació de NF-kB és important per a l'alp induïda per l'extracte de CD, l'expressió de BMP-2 i OPN i la formació de nòduls ossis.

Figura 4 Implicació de c-Jun N-terminal quinases (JNK) enCistanchedeserticola(CD) mineralització òssia induïda per extractes en osteoblasts. Les cèl·lules es van xapar en plaques de 24 pous i es van cultivar en un medi que conté vitamina C (50 mg / ml) i b-glicerofosfat (10 mM) durant dues setmanes. Les cèl·lules van ser tractades de forma concomitant amb CD(Cistanchedeserticola)extracte (26 mg / ml) més SP600125 (3 mM). La formació de nòduls mineralitzats es va avaluar mitjançant tinció d'alizarina vermella-S (n = 5). b, c) Les cèl·lules van ser pretractades amb SP600125 durant 30 min o transfectades amb mutant JNK o 24 h seguides d'estimulació amb extracte de CD, i activitat alcalina fosfatasa (ALP) i ALP, proteïna morfogenètica òssia (BMP) -2 i expressió d'ARNm d'osteopontina (OPN) es va mesurar mitjançant kit ALP i reacció quantitativa en cadena de polimerasa en temps real. (d) Les cèl·lules van ser tractades amb extracte de CD per a intervals de temps indicats, i l'expressió p-JNK va ser examinada per Western blotting. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)grup d'extracció tractada.

Inhibició de la pèrdua òssia per extracte de Cistanche deserticola en ratolins ovariectomitzats

Per examinar l'efecte del CD(Cistanchedeserticola)extracte de la pèrdua òssia, l'osteoporosi va ser induïda en ratolins femella per ovariectomia. Com era d'esperar, els ratolins ovariectomitzats van mostrar una disminució de la densitat mineral òssia total del cos i el contingut mineral ossi (Figura 6a i 6b). Tractament amb CD(Cistanchedeserticola)extracte durant quatre setmanes va inhibir la pèrdua de densitat mineral òssia i contingut mineral ossi d'una manera dependent de la dosi (Figura 6a i 6b). Les concentracions sanguínies d'ALP poden reflectir l'activitat osteoblastica. [29] Tal com es mostra a la figura 6c, CD(Cistanchedeserticola)extracte va inhibir la disminució de l'activitat sèrica ALP induïda per l'ovariectomia. A més, el CD(Cistanchedeserticola)l'extracte també va augmentar el nivell d'osteocalcina, un marcador deosformació, i va reduir el nivell de telopèptids C-terminal de col·lagen tipus I, un marcador de reorció òssia (Figura 6d i 6e). Aquestes troballes donen suport així a la potència i eficàcia del CD(Cistanchedeserticola)extracte en la prevenció de la pèrdua òssia in vivo.

Figura 6 Inhibició de l'ovariectomia induïda per la disminució de la densitat mineral òssia i el contingut mineral ossi perCistanchedeserticola(CD) extracte. A les femelles de l'ICR se'ls va administrar una operació farsa o van ser ovariitzats. Els ratolins ovariectomitzats van ser tractats amb les concentracions indicades de CD(Cistanchedeserticola)Extracte per alimentació oral. Densitat mineral òssia total del cos (a), contingut mineral ossi (b), activitat de fosfatasa alcalina sèrica (ALP) (c), osteocalcina sèrica (d) i telopèptids terminals Sèrics de col·lagen tipus I (e), es van determinar quatre setmanes després de la cirurgia. Les dades es presenten com a mitjana SE, n = 8-10 ratolins / grup. *P< 0.05,="" compared="" with="" sham;="" #p="">< 0.05,="" compared="" with="" ovariectomized="">

DISCUSSIÓ

Feu clic aquí per obtenir informació sobre la part II (Discussió i conclusió) d'aquest article.

Des de: 'Cistanchedeserticolaaugmenta l'extracteosformacióen osteoblasts' perTe-Mao Li^unet al

---© 2012 Els autors. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Revista de Farmàcia i Farmacologia,64, pàg.