Olis essencials que contenen citral com a inhibidors potencials de la tirosinasa: un enfocament de fraccionament bioguiat

Contacte: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correu electrònic:audrey.hu@wecistanche.com

Resum:

La producció excessiva de melanina provoca greus afeccions dermatològiques així com problemes estètics menors (és a dir, pigues i lentigo solar). La regulació a la baixa de la tirosinasa és un enfocament molt estès per al tractament d'aquests trastorns, i els extractes de plantes sovint han demostrat ser valuoses fonts detirosinasainhibidors. Citral (una barreja de neral i gerani) és un ingredient important de la fragància que ha demostrat potencial anti-tirosinasa. Està altament concentrat en els olis essencials (OE) de Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. i Verbenaofficinalis L. No obstant això, només L. cubeba EO s'ha investigat per utilitzar com a agent potencial per blanquejar la pell. Aquest treball avalua la in vitrotirosinasal'activitat inhibidora d'aquests EO i estudis, utilitzant el fraccionament orientat a bioassaig, si les seves diferents composicions químiques influeixen en les activitats inhibidores globals de l'EO mitjançant possibles interaccions sinèrgiques, additives i/o competitives entre els components dels EO. L'activitat inhibidora de C. schoenanthus EO i la de M. officinalis EO, amb quantitats insignificants (plus) de citronel·la, estaven en línia amb el seu contingut de citral. D'altra banda, els EO de L. cubeba i V. officinalis van inhibirtirosinasaen una mesura considerablement més gran, ja que contenien -mircè, que va contribuir a les activitats globals d'EO. Es van fer observacions similars per a M. officinalis EO, que té un alt contingut (plus) de citronel·la que augmenta l'activitat citral.

Paraules clau:tirosinasainhibició; olis essencials; citral

cistanche té una funció blanquejadora

Introducció

Tirosinasaés l'enzim clau en la biosíntesi de pigments de melanina en diversos bacteris, fongs, plantes, animals i humans. En humans, la tirosinasa catalitza els passos que limiten la velocitat de la via biosintètica de la melanina. Aquesta biosíntesi es caracteritza per diverses reaccions enzimàtiques i químiques que condueixen a la formació de melanina a partir de l'aminoàcid L-tirosina, amb la tirosinasa que catalitza la seva hidroxilació a o-dopaquinona mitjançant les activitats de micofenolats i difenols. Tot i que hi ha altres enzims implicats en la melanogènesi, només les reaccions catalitzades per la tirosinasa no es poden produir de manera espontània, mentre que els passos restants poden continuar sense activitat enzimàtica a pH fisiològic [1]. la producció i l'ús d'inhibidors de la tirosinasa com a agents per blanquejar la pell ha demostrat una importància clínica i cosmètica important [2].

Al mercat de la UE, eltirosinasaEls inhibidors que s'utilitzen com a agents blanquejadors de la pell es poden agrupar en dues categories principals: els prohibits pel Reglament cosmètic de la UE 1223/2009 (és a dir, hidroquinona i monobenzil eter hidroquinona) a causa dels seus efectes secundaris greus, però que encara s'utilitzen per tractar la hiperpigmentació en condicions mèdiques. supervisió; i inhibidors de la tirosinasa que es permeten utilitzar-los en productes cosmètics (és a dir, arbutina, aloesina, àcid cògic) [2,3]. Aquest segon grup, però, encara es caracteritza per efectes secundaris potencialment significatius; Els estudis clínics sobre l'àcid cògic han posat de manifest casos d'eritema, sensacions de picor i èczema de contacte després de l'aplicació. De la mateixa manera, el Comitè Científic Europeu de Seguretat del Consumidor ha plantejat preocupacions sobre l'ús d'arbutinas, un ingredient cosmètic [2], a causa de la possible hidròlisi del seu enllaç glicosídic que allibera hidroquinona. Per tant, hi ha una necessitat de noves plantilles de molècules i/o barreges de compostos bioactius per tractar la hiperpigmentació.

Les plantes han estat fonts valuoses d'agents per blanquejar la pell, i tres de cada cinc dels agents més utilitzats, tant mèdicament com cosmèticament, han estat metabòlits especialitzats en plantes (és a dir, hidroquinona, -arbutina, aloesina). Fins ara, els compostos fenòlics s'han investigat principalment com a potencialstirosinasainhibidors, i aquests inclouen flavonoides (per exemple, quercetina [4]), estilbens (per exemple, resveratrol [1]), fenilpropanoides (per exemple, cinamaldehid [5] i eugenol [6]) i àcids fenòlics (per exemple, àcid anísic i àcid benzoic [7]). L'interès dels forterpenoides ha estat considerablement menor i han estat relativament poc investigats com a agents antitirosinases.

El citral es troba entre el nombre limitat de derivats terpenoides amb propietats anti-tirosinasa que s'han estudiat. És una barreja de dos isòmers, cis- i trans-3,7-dimetil-2,6-octadienal (és a dir, neral i geranial), que s'ha demostrat que bloqueja l'activitat enzimàtica in vitro dels boletstirosinasa[8]. A més de la seva importància com a ingredient olorós en begudes, aliments i cosmètics, el citral ha mostrat activitats biològiques prometedores in vitro que inclouen efectes antifúngics, antibacterians, antioxidants i antiinflamatoris [9-11]. va destacar que el citral té un significat terapèutic potencial com a relaxant muscular llis i anestèsic local, ja que promou la relaxació dels músculs llisos traqueals, uterins i aòrtics i inhibeix l'excitabilitat nerviosa en models animals [12-15].

Citral s'obté dels olis essencials (EO) de diverses espècies botàniques, incloent Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L., i Verbena officinalis L. Al millor dels autors coneixement, només L. cubeba EO ha estat investigat per la sevatirosinasaactivitat inhibidora [16]. Per tant, aquest estudi pretén avaluar les activitats inhibidores de la tirosinasa dels OE de C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis i V.officinalis, mitjançant un assaig colorimètric in vitro, per avaluar si les diferents composicions químiques influeixen en les activitats inhibidores globals de l'EO mitjançant qualsevol possibles interaccions sinèrgiques, additives i/o competitives entre els seus components. Aquest estudi utilitza un enfocament de fraccionament guiat per abioassaig per avaluar de manera exhaustiva els components d'EO i els seus enantiòmers, quan són quirals, que contribueixen a l'activitat inhibidora de l'EO contra una font de tirosinasa de bolets, que és un bon sistema model per a la detecció preliminar detirosinasainhibidors [17].

2. Resultats i discussió

2.1. Composició química i contingut cítric de l'oli essencial investigat

En el nostre intent de caracteritzar de manera exhaustiva tots els components potencials d'EO que contribueixen a l'activitat biològica considerada, els EO investigats van ser analitzats per GC, amb detecció de FID i MS. Es van determinar les abundàncies percentuals relatives normalitzades (calculades a partir de les àrees absolutes normalitzades a l'estàndard intern C13 mitjançant l'ús de factors de resposta [18, 19]) de tots els compostos detectats i es van utilitzar per comparar composicions d'EO. La figura 1 informa del perfil GC-MS dels EO investigats analitzats amb una columna convencional. La taula 1 enumera, per a cada EO investigat, els compostos que van mostrar un percentatge d'abundància normalitzat per sobre de 0.1, mentre que les composicions químiques completes de l'EO es mostren als materials suplementaris (taules S1-S5).

Tots els EO investigats són rics en nerals (cis{{0}},{7-dimetil-2,6-octadienal) i geranials (trans{-3,{ {5}}dimetil-2,6-octadienal), que són els compostos més abundants. La relació general/geranial va ser molt similar a tots els EO investigats i corresponia a 0,74 ± 0,05. Els OE de C. schoenanthus i L. cubeba presenten el contingut neural i geranial més alt, que representa, de mitjana, el 60 per cent de les seves composicions completes d'EO, i que és 1.5-vegades més gran que en V. officinalis EO i en els tres OE de M. officinalis (és a dir, la mostra 1, 2 i 3). Els compostos oxigenats addicionals que són comuns a tots els EO són ​​el 6-metil-5-hepten-1-one, el linalol i la citronel·la. Aquest últim és significativament més abundant en el M. officinalis EO 1 que en els altres EO investigats, inclosos els M. officinalis EO2 i 3.

L'abundància de la fracció d'hidrocarburs varia significativament en els diferents EO.M. officinalis EO 1 només conté trans- -cariofil·lè i -humulè com a hidrocarburs sesquiterpènics, que representen el 2,7% i el 0,13% de l'EO total, respectivament. El C.schoenanthus EO presenta una fracció d'hidrocarburs lleugerament més rica que M. officinalis EO 1 (és a dir, un 7,0 per cent ), que conté ambdós monoterpens (és a dir, canfen, cis{{1{{20). }}}}ocimè, limonè, -pinè, trans- -ocimè, -tujene) i sesquiterpens (és a dir, trans- -cariofil·lè, -cadinè, δ-cadinè, germacre D, -elemen) en moderada quantitats. En els OE de L. cubeba i V.officinalis, la fracció d'hidrocarburs representa el 20 per cent de l'EO total i el limonè és el compost més abundant (és a dir, el 15,0 i el 10,9 per cent, respectivament), seguit de -pinene, pinè , sabinè, trans- -cariofil·lè, -mircè, campè i -copen. Finalment, M.officinalis EO 2 i 3 es caracteritzen pel contingut de fracció d'hidrocarburs més alt (38,8 per cent i 31,8 per cent de l'EO total, respectivament). En ambdues mostres, la fracció d'hidrocarburs conté principalment sesquiterpens, és a dir, trans- -cariofil·lè (27,8 per cent i 20,0 per cent, respectivament) i -humulè (3,0 per cent i 2,6 per cent), i una fracció de monoterpès reduïda que es caracteritza principalment pel limonè ( 4,2 per cent i 3,2 per cent, respectivament).

Es van investigar tres mostres de L. cubeba, V. officinalis i C. schoenanthus Eos produïdes en anys diferents, així com tres mostres d'EO de M. officinalis de diferents manufactures. Les anàlisis GC-MS de C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis i V. officinalis no van revelar diferències qualitatives i quantitatives significatives en la composició química de les tres mostres de diferents anys de producció. Això es pot atribuir a condicions òptimes d'emmagatzematge, és a dir, en un recipient de vidre ambre a 4 ◦ C a la foscor amb un espai de cap insignificant. D'altra banda, les anàlisis GC-MS van mostrar diferències significatives en l'abundància de citronel·la i trans{4 }}cariofil·lè en els tres EO de M. officinalis investigats. La citronel·la va ascendir al 19,6 per cent, 0,26 per cent i 0,31 per cent a M. officinalis EO 1, 2 i 3, respectivament. Per contra, com s'ha descrit anteriorment, el trans- -cariofil·lè és considerablement més abundant en els OE 2 i 3 de M. officinalis que en els OE 1 de M. officinalis. Aquests resultats estan d'acord amb les troballes informades per Seidler-Lozykawska et al., que va destacar diferències significatives en l'abundància de citral, citronel·la i trans- -cariofil·lè en els EO obtinguts a partir de 22 genotips seleccionats de M. officinalis originaris dels jardins botànics europeus [20].

Es va realitzar una quantificació real mitjançant la calibració estàndard externa per avaluar amb precisió l'abundància de possibles compostos especialitzats bioactius (és a dir, neral, geranial, limonè, -mircè i citronel·la. Les taules 2 i 3 informen dels ions de diagnòstic (m/z) utilitzats per a SIM- Quantificació MS dels compostos marcadors investigats juntament amb el rang de calibratge, l'equació de la corba de calibratge, els valors de correlació i l'error estàndard de regressió de cada analit i els resultats de quantificació, respectivament.

2.2. Activitat inhibidora in vitro dels olis essencials investigats contra la tirosinasa de bolets

Com s'ha descrit anteriorment, els EO de C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba i V.officinalis presenten nivells elevats de citral, que es caracteritza per una activitat inhibidora no competitiva contra una font fúngica de tirosinasa [8,16,21] . Aquest estudi tenia com a objectiu examinar in vitrotirosinasaactivitats inhibitòries d'aquests EO per explorar si la seva activitat inhibitòria només es pot atribuir al seu contingut de citral, o si hi ha altres compostos bioactius que influeixen en els efectes inhibidors dels EO.

Bolettirosinasaes va adoptar aquí a causa de la seva alta homologia amb la humantirosinasa, el seu cost relativament baix i la seva fàcil disponibilitat, que el converteixen en un bon sistema model per al cribratge preliminar dels inhibidors de la tirosinasa [17]. La precisió de l'in vitrotirosinasaLa prova d'inhibició es va avaluar en termes de repetibilitat (realitzant l'assaig d'inhibició enzimàtica cinc vegades en el mateix dia) i precisió intermèdia (repetint l'assaig d'inhibició enzimàtica cinc vegades cada quatre setmanes durant un període de sis mesos). La taula 4 informa del coeficient de variació (CV) per a les proves d'inhibició realitzades amb àcid cògic, que es va utilitzar com a control positiu, i amb L. cubeba EO. Els resultats van ser satisfactoris, ja que el CV mai va superar el 7% per a la repetibilitat i el 10% per a la precisió intermèdia. La taula 4 informa del coeficient de variació per a les proves d'inhibició realitzades amb àcid còmic, utilitzat com a control positiu, i amb L. cubeba EO. Es van obtenir valors de precisió similars per a tots els EO provats.

La corba concentració-resposta de citral es va estudiar representant l'activitat inhibitòria observada en funció de la seva concentració a la barreja de reacció. Tots els EO es van provar a una concentració de 166,7 µg/mL, que va proporcionar, independentment de l'EO, una concentració de citral resultant dins del seu rang de linealitat de la corba de concentració-resposta (y=0.3956x més 1.8094,R{{7} },9951, error de regressió: 2,08448, rang de linealitat: 6,7–166,7 µg/mL) i no va generar problemes de solubilitat a la barreja de reacció.

El diagrama de caixa que es mostra a la figura 2 presenta el percentatge detirosinasainhibició per a cada EO. Per als EO de L. cubeba, V. officinalis i C. schoenanthus, els resultats reportats a la figura 2 corresponen a l'activitat inhibidora de la tirosinasa dels bolets dels EO de 2020 perquè l'anàlisi de la variància no va revelar diferències estadísticament significatives entre els EO de diferents anys de producció (p > 0,05). Pel que fa als OE de L. cubeba i C. schoenanthus, aquests resultats estan d'acord amb els resultats obtinguts de les anàlisis quantitatives de GCMS que van revelar una quantitat de citral gairebé idèntica en els OE de diferents anys de producció. El lot 2020 de V. officinalis EO conté una quantitat de citral lleugerament superior a la dels lots de 2019 i 2018. Tanmateix, segons la concentració de citral-corba de resposta, l'excés de citral del lot 2020 no és suficient per determinar un percentatge estadísticament significatiu més alt d'inhibició enzimàtica tenint en compte l'atzar. error associat a les mesures. Per obtenir més detalls, vegeu la figura S1 al material suplementari. D'altra banda, l'anàlisi de la variància (ANOVA) seguida del test post-hoctest de Tukey-Kramer va revelar que els tres EO de M. officinalis provats, proporcionats per diferents fabricants, van inhibir bolets.tirosinasaen diferents graus, que es descriuen amb més detall en els paràgrafs següents. Les activitats inhibidores més grans es van observar per als EO de L.cubeba, M. officinalis 1 i V. officinalis, que van inhibir el 59 ± 6 per cent, el 55 ± 7 per cent i el 52 ± 6 per cent detirosinasaactivitat, respectivament, quan es prova a una concentració de 166,7 µg/mL. Es van observar activitats més baixes estadísticament significatives (p <0.05) per="" als="" eo="" de="" c.="" schoenanthus="" i="" m.officinalis="" 2="" i="" 3,="" l'activitat="" inhibidora="" de="" l'enzim="" va="" ser="" del="" 42="" ±="" 5="" per="" cent,="" 40="" ±="" 5="" per="" cent="" i="" 38="" ±="" 6="" per="" cent.="" percentatge,="" respectivament.="" la="" taula="" 5="" proporciona="" la="" concentració="" d'inhibidors="" que="" va="" reduir="" a="" la="" meitat="" l'activitat="" de="" l'enzim="" en="" les="" condicions="" experimentals="" donades="" (ic50)="" per="" a="" cada="" inhibidor="" investigat="" (és="" a="" dir,="" eo,="" compostos="" únics="" i="" àcid="" cògic).="" tots="" els="" eo="" van="" inhibir="" eficaçment="" la="" tirosinasa="" dels="" bolets="" i="" van="" mostrar="" una="" activitat="" inhibidora="" que="" era,="" de="" mitjana,="" 100-vegades="" inferior="" a="" la="" del="" kojicacid,="" que="" es="" va="" utilitzar="" com="" a="" control="">

2.3. Identificació de components bioactius addicionals, a més de Citral, per fraccionament guiat per bioassaig. L'histograma que s'informa a la figura 3 compara el percentatge d'inhibicions enzimàtiques mesurades experimentalment amb els valors que s'esperarien si el neural i el geranial (considerat com a suma, és a dir, citral) fossin els només compostos actius en els EO investigats. Aquests valors es van mesurar mitjançant la interpolació a partir de la corba concentració-resposta de citral. Com es pot observar, C. schoenanthus, M. officinalis 2 i M. officinalis 3 van mostrar activitats inhibidores que estaven en línia amb el seu contingut en citral, mentre que L. cubeba, M. officinalis 1 i V. officinalis EO van inhibir els bolets. tirosinasa en major mesura del que s'esperava. Es va adoptar un enfocament bioguiat per identificar els compostos addicionals que contribueixen a l'activitat citral. Les fraccions oxigenades i d'hidrocarburs dels OE de L. cubeba, M. officinalis 1 i V. officinalis es van aïllar mitjançant cromatografia flash i es van provar individualment el seu bolettirosinasaactivitats inhibidores. Les fraccions fitohèmiques van provar les seves activitats inhibidores de la tirosinasa dels bolets. Les fraccions fitohèmiques es van provar a la mateixa concentració que la seva concentració resultant quan es van provar 166,7 µg/mL de l'EO respectiu (vegeu la secció Materials i mètodes a la secció 3.2). i -mircè a les fraccions oxigenades i hidrocarburs dels EO fraccionats.

Pel que fa als EO de L. cubeba i V. officinalis, tant la fracció oxigenada com la d'hidrocarburs van inhibir la tirosinasa dels bolets, encara que en diferents graus. Les activitats de les fraccions oxigenades (53 ± 3 per cent i 44 ± 5, respectivament) representen la majoria dels EOsanti-tirosinasapotencial i estaven en línia amb el contingut de citral respectiu, cosa que suggereix que els compostos que contribueixen a l'activitat citral pertanyen a les fraccions d'hidrocarburs. Les fraccions d'hidrocarburs dels OE de L. cubeba i V. officinalis presenten composicions químiques força semblants. Limonè (68,4 i 50,3 per cent, respectivament), trans{- -cariofil·lè (12,0 i 7,8 per cent, respectivament), -pinene (1,7 i 7,5 per cent, respectivament), -pinè (2,5 i 12,9 per cent, respectivament), sabinè (2,7 i 3,8, respectivament) i -mircè (2,0 i 2,4 per cent, respectivament) són els compostos més abundants en ambdues fraccions i estan presents en quantitats força similars, excepte en -pinene i -pinene, que predominen en la fracció hidrocarboni de V. officinalis EO.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 per cent en ambdós EO), limonè (97 i 94 per cent en L. cubeba i V. officinalis EO, respectivament) i sabinen (87 per cent en ambdós EO), mentre que es van observar diferents excessos enantiomèrics per a -pinene ((-)- enantiòmer: 38 per cent en L. cubebaEO i 73 per cent en V. officinalis EO) i -pinene ((-)-enantiòmer: 67 per cent en L. cubeba EO i 88 per cent en V. officinalis EO). En ambdós EO, (-)-limonè representa més del 50 per cent de la fracció sencera. Tanmateix, tot i que estudis anteriors han informat d'una activitat inhibidora contra la tirosinasa dels bolets a causa de la seva gran abundància [22, 23], (-)-limonè aquí no va mostrar una activitat inhibidora de la tirosinasa. Es van obtenir resultats similars per a (+)-limonè, la mescla racèmica i els compostos (-)-trans- -cariofil·lè, (±)- -pinè i (±)- -pinè . Sabinene no es va provar, ja que ja s'havia demostrat que tenia bolets insignificantstirosinasaefectes inhibidors [8]. D'acord amb les troballes anteriors [8], el mircè va reduir l'activitat de la tirosinasa dels bolets. Quan es va provar a la concentració observada en 166,7 µg/mL d'OE de L. cubeba i V. officinalis, l'activitat del mircè va superar la bretxa entre els efectes inhibidors esperats dels OE si el citral era l'únic compost actiu i els resultats experimentals. Contràriament a les observacions de Matsuura et al. [8], -myrcène va demostrar ser un inhibidor de la tirosinasa de bolets més potent que el citral, ja que la seva IC50 era gairebé deu vegades més baixa (13,3 µg/mL enfront de 121,8 µg/mL). Aquesta diferència es pot atribuir als diferents substrats utilitzats; Matsuura et al. només va investigar l'activitat de la tirosinasa de la difenolasa dels bolets, ja que utilitzaven L-DOPA com a substrat, mentre que, en aquest estudi, es va utilitzar L-tirosina. Les troballes actuals suggereixen que el mircè pot ser més eficaç per inhibir l'activitat de la monofenolasa de la tirosinasa dels bolets que la de la difenolasa.

El M. officinalis EO 1 mostra una petita fracció d'hidrocarburs que representa menys del 3 per cent del total i no té activitat inhibidora de la tirosinasa. No obstant això, la fracció oxigenada de M. officinalisEO 1 va inhibir la tirosinasa dels bolets en una mesura més gran del que s'esperaria pel seu contingut en citral (figura 3). Aquesta fracció conté quantitats significatives de citronel·la a més de neral i geranial i l'anàlisi quiral va revelar una puresa alta enantiomèrica de citronel·la a favor de l'enantiòmer (+) (98,3 per cent). Quan es va provar de manera independent, a una concentració de 166,7 µg/mL, (a més)-citronel·la va inhibir la tirosinasa de bolets en una mesura insignificant, tot i que la seva activitat es va millorar significativament quan es va provar en combinació amb citral. Aquests resultats poden explicar les diferències observades en els percentatges de boletstirosinasainhibició en els diferents EO de M. officinalis. M.officinalis EO 2 i 3 presenten continguts de citronel·la molt baixos, fet que pot ser el motiu pel qual les seves activitats inhibidores siguin significativament inferiors a les de M. officinalis EO 1.

3. Materials i Mètodes

3.1. Reactius

Dimetil sulfòxid (DMSO), tirosinasa de bolets d'Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach, L-tirosina, àcid cògic, citral, citronel·lal, -mircè, (a més)-limonè, (-)-limonè, (±)-limonè, ( ±)-, i pinè es van comprar a Merck Life Science Srl (Milà, Itàlia). Litsea cubeba, Verbena officinalis i Cymbopogon schoenanthus EO van ser subministrats per Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Itàlia). Es van provar tres lots d'anys diferents (és a dir, 2020, 2019, 2018) per a cadascun. Es van investigar tres mostres de Melissa officinalis EO; una va ser proporcionada per Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), una per ErboristeriaMagentina Srl, mentre que l'última es va comprar a una botiga local i era de SpecchiasolS.rl (Bussolengo, Itàlia). En el text, els autors es refereixen als diferents OE de Melissaofficinalis com M. officinalis OE 1, 2 i 3, respectivament. Els EO proporcionats es van obtenir seguint els procediments descrits a la Farmacopea Europea [24]. Els OE de Melissa officinalis i Verbena officinalis es van produir per hidrodestil·lació a partir de les fulles i les parts aèries de les plantes, respectivament; de la mateixa manera, els EO de Litsea cubeba i Cymbopogon schoenanthus es van obtenir per destil·lació al vapor de les fruites fresques i les parts aèries fresques, respectivament. Cada EO va ser analitzat individualment per GC-MS tan bon punt va ser comprat/proporcionat pel fabricant corresponent, cada any d'emmagatzematge i just abans de l'estudi de la seva activitat inhibidora de la tirosinasa de bolets.

3.2. Assaig inhibidor de la tirosinasa in vitro

EltirosinasaLes activitats inhibidores dels EO i els compostos aïllats es van investigar in vitro mitjançant un assaig enzimàtic basat en la lectura colorimètrica optimitzat per Zengh et al. [25], amb lleugeres modificacions. Les activitats inhibidores de la tirosinasa dels EO, així com les seves respectives fraccions d'hidrocarburs i oxigenats i compostos purs es van investigar in vitro utilitzant un assaig enzimàtic basat en la lectura colorimètrica que va ser optimitzat per Zengh et al. [25], amb lleugeres modificacions: l'assaig es va realitzar a temperatura ambient itirosinasaLa inhibició es va mesurar tenint en compte el control i l'absorbància de la mostra després de 6 min d'incubació, en lloc de després de 20 min, per tal d'operar sota la part lineal de la reacció enzimàtica, que proporciona resultats d'inhibició més precisos [26,27]. Per a aquest estudi es va seleccionar tirosina de bolets d'Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach. La L-tirosina es va utilitzar com a substrat, el que significa que es va investigar l'activitat inhibidora general de la tirosinasa sense distingir entre l'activitat tirosinasa monofenolasa i la difenolasa. Les mesures fotomètriques a 475 nm es van realitzar en un Thermo spectronic Genesys6 i l'àcid cògic es va utilitzar com a inhibidor de control positiu. Les solucions dels inhibidors potencials investigats (EO, fraccions aïllades d'EO, compostos individuals d'EO i kojicacid) es van preparar en DMSO. La taula 7 informa de les concentracions provades per a cada inhibidor potencial investigat. El bolettirosinasaLa solució 200 U/mL (27,9 µg/mL) es va preparar en tampó de fosfat sòdic (pH 6,8) i es van emmagatzemar alíquotes de 9 mL a -18 ◦C i es van descongelar just abans dels experiments. Es va preparar una solució de tirosina 0,1 mg/mL en tampó de fosfat sòdic (pH 6,8) i es va renovar diàriament. Els components de la barreja de reacció es van col·locar al vial en l'ordre següent: 1 mL de tirosinasa de bolets de solució 200 U/mL; 1 ml de solució tampó de fosfat sòdic; 10 µL de solució EO/composat únic/àcid cògic; i, finalment, 1 mL de solució de tirosina 0,1 mg/mL. El percentatge final de DMSO a la barreja de reacció va ser del 0,3 per cent. L'assaig es va realitzar en un vial de 4 ml segellat per evitar la pèrdua de qualsevol component d'EO a l'entorn i minimitzar el seu alliberament a l'espai del cap per sobre de la barreja de reacció. La mescla de reacció es va incubar en un bany d'aigua termostàtic a 25 ◦ C durant 6 min. Posteriorment, es va registrar l'absorbància a 475 nm, ja que aquesta longitud d'ona permet la identificació del dopacrom. L'absorbància corresponent al 100 per cent de l'activitat de la tirosinasa es va mesurar substituint la solució EO/compost individual/àcid cògic per 10 µL de DMSO pur. Les solucions en blanc es van preparar de la següent manera: 2 mL de solució tampó de fosfat de sodi, 10 µL d'EO/compost individual /solució d'àcid cògic/DMSO i 1 mL de solució de tirosina 0,1 mg/mL. El percentatge d'inhibició de la tirosinasa es va mesurar segons l'equació següent: percentatge d'inhibició=∆A (control) − ∆A (mostra) / ∆A (control) × 100, ∆A (control) o (mostra) {{ 33}} A475 (Control) o (Mostra) − A475 (Control en blanc) o (Mostra en blanc).

3.3. Cromatografia de columna flash

El fraccionament EO es va dur a terme en un sistema de cromatografia en columna flash PuriFlash450 de Sepachrom (Rho, Milà, Itàlia), equipat amb detectors UV i ELSD. La quantitat d'EO fraccionat: 900,0 mg. Fase estacionària: partícules esfèriques de gel de sílice, 50 µm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) eren de Sepachrom; fase mòbil:petroleter (A) i acetat d'etil (B); cabal 25 ml/min. L'elució de gradient lineal es va adoptar del 100 per cent de A al 80 per cent d'A i el 20 per cent de B durant 20 min.

3.4. Condicions d'anàlisi

Les solucions d'EO i les de les seves respectives fraccions es van preparar en ciclohexà a una concentració de 5,0 mg/mL i es van analitzar per GC-MS. El citral, la citronel·la, el -mircè i el limonè es van quantificar en cada EO i les fraccions aïllades corresponents mitjançant el mètode de calibratge estàndard extern. Es van preparar nivells de calibratge adequats amb inciclohexà i es van analitzar per GC-MS. Tridecane (C13) 1. 0 mg/ml es va utilitzar com a estàndard intern per normalitzar els senyals de l'analit. La taula 2 resumeix l'interval de concentració considerat per a cada compost quantificat.

Les anàlisis GC-MS es van dur a terme mitjançant un mostreig multiús Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr, Alemanya) instal·lat en un GC Agilent 6890 N acoblat a un MSD 5975 i equipat amb una ChemStation versió E. 02.0Sistema de processament de dades 2.1431 (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, EUA). Condicions de GC: temperatura de l'injector: 250 ◦C; mode d'injecció: dividit; relació: 1/20; gas portador: heli; cabal constant: 1 mL/min; columnes: Mega5 (95 per cent de polidimetilsiloxà, 5 per cent de fenil) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, longitud 25 m, de MEGA (Legnano, Itàlia). Programa de temperatura: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C (5 min). Condicions MSD: MS funciona en mode EI (70 eV); rang d'exploració: 35 a 350 amu; temps de residència 40 ms; temperatura de la font d'ions: 230 ◦C; temperatura quadrupol: 150 ◦C; temperatura de la línia de transferència: 280 ◦C. Els marcadors EO es van identificar comparant tant els seus índexs de retenció lineal (IT), calculats amb una barreja d'hidrocarburs C9-C25, com els seus espectres de masses amb els de mostres autèntiques o de biblioteques d'espectres de masses disponibles comercialment (Adams, 2007). Les anàlisis quirals d'EO es van realitzar adoptant les mateixes condicions d'anàlisi en un 2,3-di-O-metil-6-Ot-butildimetilsilil- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, longitud 25 m des de MEGA. Programes de temperatura: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

Les anàlisis GC-FID es van realitzar amb el mateix instrument. Condicions de GC: temperatura de l'injector: 250 ◦C; mode d'injecció: dividit; relació: 1/20; gas portador: hidrogen; cabal: 1 ml/min. Programes de temperatura: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

4. Conclusions

Els propòsits d'aquesta investigació van ser (1) examinar exhaustivament el bolet in vitrotirosinasaactivitats inhibidores dels EO de Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis i Verbena officinalis i (2) per determinar si la seva activitat biològica s'atribueix només al seu contingut en citral o si hi ha monoterpens bioactius addicionals que contribueixen a l'activitat biològica investigada mitjançant l'ús d'un enfocament de fraccionament guiat per bioassaig. Aquest estudi ha identificat que en els OE de L. cubeba i V. officinalis, el -mircè contribueix a les activitats inhibidores dels OE malgrat la seva poca quantitat i s'ha demostrat que té un poder inhibidor més gran del citral. La segona troballa important va ser que (a més)-citronel·la millora el bolet citraltirosinasapoder inhibidor, interacció potencialment via sinèrgica, ja que no mostrava cap activitat per si sola. Aquesta darrera troballa va explicar per què en els OE de M. officinalis que contenen quantitats insignificants (més) de citronel·la, les activitats inhibidores estaven en línia amb el seu contingut de citral, mentre que el contrari era cert per a l'EO de M. officinalis amb una abundància de citronel·la relativament alta (més). tot i que encara es necessiten estudis addicionals per definir amb precisió el tipus d'interaccions que es produeixen entre -mircè i citral i entre citronel·la i citral, i per avaluar les activitats inhibidores d'aquests EO i compostos individuals en humans.tirosinasa, els resultats d'aquest estudi poden ajudar a dissenyar racionalment barreges d'EO o enriquits que millorin la seva eficàcia biològica i augmenten el seu potencial com a adjuvants en el tractament de la hiperpigmentació.

Referències

1. Pillaiyar, T.; Manickam, M.; Namasivayam, V. Agents per blanquejar la pell: perspectiva de química medicinal dels inhibidors de la tirosinasa.J. Enzima. Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [Ref creuat]

2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Visió general dels agents per blanquejar la pell amb una visió del mercat il·legal de cosmètics a Europa. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Caracterització de cosmètics per blanquejar la pell sospitosos il·legals. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Flavonols de la flor de safrà: activitat inhibidora de la tirosinasa i mecanisme d'inhibició. J. Agric. Food Chem.1999, 47, 4121–4125. [Ref creuat]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Composició química i activitat inhibidora de la tirosinasa de l'oli essencial de Cinnamomum cassia. Bot. Semental. 2013, 54, 2–8. [Ref creuat]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Acció dels fenols onortosubstituïts de la tirosinasa: Possible influència en l'enrossament i la melanogènesi. J. Agric. Química dels Aliments. 2012, 60, 6447–6453. [Ref creuat]

7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Inhibidors de la tirosinasa del comí. J. Agric. Química dels Aliments. 1998, 46, 5338–5341. [Ref creuat]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Activitat inhibidora de la tirosinasa dels olis essencials de cítrics. J. Agric. Química dels Aliments. 2006,54, 2309–2313. [Ref creuat]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. Bioactivitats in vitro dels olis essencials utilitzats per al control de l'acne. Int. J. Aromather. 2006, 16, 43–49. [Ref creuat]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Propietats biològiques del citral i els seus efectes protectors potencials contra la citotoxicitat causada per l'aspirina a les cèl·lules IEC-6. Biomed. Pharmacother. 2017, 87, 653–660. [Ref creuat]

11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; No, YH; Yuk, DY; Hong, JT Efecte inhibidor del citral sobre la producció de NO mitjançant la supressió de l'expressió iNOS i l'activació de NF-κB a les cèl·lules RAW264.7. Arc. Farmàcia. Res. 2008, 31, 342–349. [Ref creuat]

12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA;Barbosa, R. Efecte de la Lippia alba (Mill.) NE Oli essencial marró i els seus principals constituents, citral i limonè, sobre el múscul llis traqueal de rates. Biotecnologia. Rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, Á.B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. Activitat tocolítica de l'oli essencial de Lippia alba i dels seus principals constituents, citral i limonè, sobre l'úter aïllat de rates. Chem. Biol. Interactuar. 2019, 297, 155–159. [Ref creuat]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, R. Efecte vasorelaxant de l'oli essencial de Lippia alba i el seu principal constituent, el citral, sobre la contractilitat de l'aorta aïllada. Biomed. Pharmacother. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, DG; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, R. L'oli essencial de Lippia alba i el seu principal constituent citral bloquegen l'excitabilitat dels nervis ciàtics de rata. Braz. J. Med.Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Aplicació cosmètica potencial d'oli essencial extret de fruites de Litsea cubeba de la Xina. J. Essent. Oli Res. 2013, 25, 112–119. [Ref creuat]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hassan Khan, MT; Muñoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Cànovas, F.; Saboury, AA Revisió exhaustiva dels inhibidors de la tirosinasa. J. Enzim. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [Ref creuat]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Costa, R.; Rubiolo, P. Anàlisi quantitativa dels olis essencials: una tasca complexa. Sabor Fragr. J. 2008, 23, 382–391. [Ref creuat]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Olis essencials i volàtils: Preparació i anàlisi de mostres. Una ressenya.Sabor Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [Ref creuat]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. L'avaluació de la variabilitat dels trets morfològics i químics d'aquests genotips seleccionats de melissa (Melissa officinalis L.). Cultius Ind. Prod. 2013, 49, 515–520. [Ref creuat]

21. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Activitat inhibidora de la tirosinasa dels compostos del sabor de l'oli d'oliva. J. Agric. Química dels Aliments. 1999, 47, 4574–4578.[CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Arena, MP; Benvenuti, S.; Gallone, A. Composició química i potencial anti-melanogènic dels diferents olis essencials. Sabor Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [Ref creuat]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Efecte inhibidor de l'oli essencial de llimona sobre l'activitat de la tirosinasa de bolets in vitro. Mod. FoodSci. Tecnol. 2015, 31, 97–105. [Ref creuat]

24. Consell d'Europa. Farmacopea Europea, 10a ed.; Consell d'Europa: Estrasburg, França, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Caracterització dels inhibidors de la tirosinasa a les branques de Cudrania tricuspidata i el seu estudi de relació estructura-activitat. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, JE Disseny d'assaig enzimàtic per a la detecció d'alt rendiment. En cribratge d'alt rendiment. Mètodes en Biologia Molecular (Mètodes i Protocols); Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press: Clifton, NJ, EUA, 2009; Volum 565, pp. 107–126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR Fonaments bàsics d'assaigs enzimàtics per a HTS. In Assay Guidance Manual; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds.; Eli Lilly & Company i el NationalCenter for Advancing Translational Sciences: Bethesda, MD, EUA, 2004