Clonació, identificació funcional i anàlisi d'expressió de la Chalcone Syntase de Cistanche Tubulosa

Resum: Objectiu

Estudiar la funció decalcone sintasa de Cistanche tubulosai el patró d'expressió del gen CtCHS en flors blanques, vermelles i morades.

MètodesEl gen CtCHS es va clonar mitjançant RT-PCR i es va realitzar una anàlisi bioinformàtica. El plasmidi pET-28a-CtCHS es va transferir a Escherichia coli per induir l'expressió de proteïnes per IPTG. La proteïna recombinant CtCHS es va incubar amb els substrats p-cumaroil CoA i malonil CoA, i els productes es van detectar per HPLC i MS. El plasmidi pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS es va transferir al protoplast d'Arabidopsis thaliana per observar la localització subcel·lular de la proteïna CtCHS. El patró d'expressió del gen CtCHS a les flors de C. tubulosa amb tres colors es va detectar mitjançant qRT-PCR.

ResultatsEs va clonar un gen CtCHS. La longitud del marc de lectura obert (ORF) era de 1173 pb, que codificava 390 aminoàcids, i el pes molecular de la proteïna era 42 8000.

EXTRACTE DE CISTANX ORGANIC AMB 30% ECHINACOSIDE I 12% ACTEOSIDE

CtCHS contenia els residus catalítics Cys164, His303, Asn336, que es van conservar en la calcone sintasa. La proteïna CtCHS es va expressar en E. coli i es va purificar per obtenir la proteïna recombinant. La proteïna CtCHS podria catalitzar p-cumaroil CoA i malonil CoA per produir naringenina calcona. La proteïna CtCHS es va localitzar principalment al citoplasma. El gen CtCHS es va expressar molt en flors morades i vermelles, i els nivells d'expressió relatius eren 8,44 i 3,21 vegades més alts que els de les flors blanques, respectivament.

Conclusió Es va clonar un gen CtCHS a partir de la flor de C. tubulosa i es va expressar proteïna. La proteïna CtCHS té funció de la calcona sintasa, i l'expressió del gen CtCHS és més alta en flors més fosques, cosa que indica que el gen CtCHS pot regular el color de la flor de C. tubulosa, la qual cosa posa les bases per a més investigacions sobre el mecanisme de regulació del color de la flor de C. . tubulosa.

Paraules clau: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; calcona sintasa; anàlisi de l'activitat enzimàtica; localització subcel·lular; anàlisi de l'expressió

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT és el gènere de planta Pyreal, que es distribueix de manera natural al sud de Xinjiang [1] a la zona Hetian de Xinjiang [2]. Les flors de pipa tenen un alt valor medicinal. Les seves tiges de carn són una de les fonts de la versió 2020 de "Farmacopea xinesa". [3] La investigació sobre les tiges de carn de cordonus de flors de pipa ha augmentat, però hi ha relativament poques investigacions biològiques sobre les seves flors. El període de floració de les flors de pipa és d'abril a maig [4], principalment Hi ha tres colors de blanc. , vermell i violeta Les flors de la pipa són riques en color, però no s'ha informat del seu mecanisme de regulació del color de les flors. i factors genètics [5] El pigment de les flors de les plantes inclou principalment tres categories: flavonoides, carotès i beetina, la gamma de color més àmplia [7], els tipus i el contingut de flavonoides afecten el color de moltes plantes com les tres varietats de Paeonia Lactiflora Pall.

Apareix com a blanc, i el color principal del color conté el color del vermell i la bella competència fa que les flors es presenten com a vermell morat [8]. El color floral és una característica important de moltes plantes ornamentals, i també és el factor clau que atrau els insectes rosats [9]. Els estudis han demostrat que es transmet. La freqüència més alta de visites d'insectes és la planta de cistanche morat profund [10]. Per a la investigació biològica sobre la investigació genètica sintètica dels cistanoides a les flors del cistanosaurus de la flor del tub, és propici per aclarir el mecanisme de control de la coloració del cordó de la flor del tub, proporcionant una base teòrica per millorar el color de la tecnologia d'enginyeria genètica, promoure els seus colors més rics, augmentar la visualització, ampliant l'abast de les aplicacions.

La via biosintètica deflavonoidescomença amb elvia dels fenilpropanoides. La fenilalanina es converteix primer en àcid cinàmic sota l'acció de la fenilalanina amonialiasa (PAL) i l'àcid cinàmic es 4-hidroxilat per l'àcid cinàmic. L'enzim (àcid cinàmic-4-hidroxilasa, C4H) i 4-cumarat coenzim A lligasa (4-cumarat coenzim A lligasa, 4CL) catalitzen la reacció per generar 4-cumaroil-CoA [11]. Una molècula de 4-cumaroil-CoA i tres molècules de malonil-CoA són catalitzades per la calcona sintasa (CHS) per generar naringenina calcona, que técompostos flavonoides.L'esquelet bàsic de la calcone isomerasa, flavanona-3-hidroxilasa, dihidroflavonol 4-reductasa, etc. genera una varietat de flavonoides com isoflavones, flavonols, antocianines, etc. [12]. Com a enzim clau en la via biosintètica dels flavonoides, el CHS regula el contingut de flavonoides a les plantes i també té un paper important en la regulació del color de la flor de les plantes [13]. Per exemple, el silenciament gènic post-transcripcional de Gentiana scabra Bunge CHS pot inhibir la biosíntesi d'antocians i provocar un blanquejament específic dels lòbuls de la corol·la [14]. Silenciment del gen CHS d'Actinidia eriantha Benth. CHS redueix el contingut d'antocianina en els pètals i provoca que el color dels pètals vermells es torni més clar [15]. Per tant, en aquest estudi, es va clonar un gen CtCHS de flors de Cistanche deserticola i es van realitzar anàlisis bioinformàtiques, expressió i purificació procariotes, anàlisi de l'activitat enzimàtica, anàlisi de localització subcel·lular i anàlisi d'expressió en tres colors de flors per explorar la funció de CtCHS. La proteïna i el patró d'expressió del gen CtCHS es van utilitzar per explorar preliminarment la relació entre CtCHS i el color de la flor de Cistanche deserticola, que va establir les bases per a l'estudi del mecanisme regulador del color de la flor de Cistanche deserticola.

1 Materials i instruments

1.1 Materials

Les flors de Cistanche tuberosa es van recollir al comtat de Yutian, prefectura de Hotan, Xinjiang el maig de 2018. Durant el mostreig es va seguir el principi aleatori i es van seleccionar flors de Cistanche tuberosa amb un bon estat fisiològic i una alçada constant de la planta. El professor Tu Pengfei de l'Escola de Farmàcia de la Universitat de Pequín va prendre tres soques de Cistanche deserticola amb tres colors de flors de blanc, vermell i morat i les va identificar com a Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Es van congelar ràpidament en nitrogen líquid, es van emmagatzemar en gel sec i es van transportar a Pequín. Es van comprar cèl·lules químicament competents d'E. coli DH5 a Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., i es van comprar cèl·lules químicament competents d'E. coli BL21 (DE3) a Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP El vector es va comprar a Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA es va comprar a Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenina -la calcona es va comprar a Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., i la naringenina es va comprar a Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instruments

espectrofotòmetre Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, EUA); instrument de gradient PCR (Eppendorf Company, Alemanya); Instrument PCR quantitatiu de fluorescència CFX 96, imatge de gel UVP, instrument d'electroforesi en gel, instrument d'electroforesi de proteïnes (BioRad Company, EUA); EnSpire

Lector de microplaques (PerkinElmer Company, EUA); incubadora de temperatura constant (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Oscil·lador de temperatura completa de gran capacitat DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Un oscil·lador de temperatura constant en bany d'aigua (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Banc de treball ultra net d'AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); esterilitzador de vapor d'alta pressió (TOMY Company, Japó); Instrument d'aigua pura Milli Q (Millipore, Estats Units); LC-20Un cromatògraf de fase líquida d'alta eficiència (Shimadzu Company, Japó); espectrometria de masses d'alta resolució UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, EUA); Microscopi confocal làser FV1200 (Olympus Company, Japó).

2 Mètodes experimentals

2.1 Extracció d'ARN i síntesi d'ADNc. Les flors de Cistanche deserticola es van triturar en nitrogen líquid i després es van sotmetre a un assaig d'extracció d'ARN.

L'ARN total es va extreure mitjançant un kit (Norgen, Cat 17200), la concentració i la qualitat de l'ARN es van detectar mitjançant NanoDrop 2000C i es van seleccionar mostres d'ARN amb una relació A260/A280 entre 1,8 i 2,1 per a la síntesi de transcripció inversa d'ADNc. La transcriptasa inversa M-MLV (Promega, M170B) es va utilitzar per transcriure inversament l'ARN total qualificat a ADNc. Les operacions experimentals es van realitzar seguint les instruccions.

2.2 Clonació del gen CtCHS

A partir de les dades del transcriptoma de flors de Cistanche deserticola del nostre grup de recerca [16], es va seleccionar un CtCHS amb un marc de lectura obert complet i es va utilitzar el programari SnapGene per dissenyar primers específics basats en la seqüència del gen (taula 1). L'amplificació per PCR es va realitzar mitjançant l'ADNc de la flor de Cistanche deserticola com a plantilla. El sistema d'amplificació era 2 × Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, primers aigües amunt i aigües avall (10 μmol/L) 2 μL cadascun, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

ADN polimerasa 1 μL, ddH2O 17 μL. Les condicions de reacció van ser: pre-desnaturalització a 95 graus durant 3 min; 25 cicles de desnaturalització a 95 graus durant 15 s, recuit a 55 graus durant 15 s, i extensió a 72 graus durant 1 min; i extensió de la reacció a 72 graus durant 5 min. El producte de PCR es va detectar mitjançant electroforesi en gel d'agarosa a l'1% i es va utilitzar el kit de purificació d'ADN (Novizan, Cat DC301-01) per a la recuperació de gel, i després l'ADN recuperat es va purificar mitjançant un kit de clonació ràpida (Novizan, Cat). C601-01). El fragment d'ADN es va lligar amb el vector pCE2 TA/Blunt-Zero, es va transformar en cèl·lules competents d'Escherichia coli DH5 i, després de cultivar durant la nit a 37 graus, es van seleccionar soques de clons únics i es van enviar a l'empresa per a la seqüenciació.

Taula 1 Seqüències d'encebadors

2.3 Anàlisi bioinformàtica

Utilitzeu el programari en línia ProtParam per analitzar les propietats físiques i químiques de les proteïnes; utilitzar l'eina en línia Prot Scale per analitzar la hidrofilicitat/hidrofobicitat de proteïnes; utilitzar l'eina en línia SOPMA per predir l'estructura secundària de proteïnes; utilitzar el programari d'anàlisi en línia SWISS-MODEL per predir l'estructura terciària de proteïnes; utilitzar el programari en línia TMHMM Predir l'estructura transmembrana de la proteïna; utilitzar el programari DNAMAN per comparar l'homologia de CtCHS amb les seqüències d'aminoàcids CHS d'altres espècies; utilitzar el programari MEGA-X per construir un arbre filogenètic, utilitzant la unió de veïns (NJ) i la correcció de Poisson. La distància evolutiva es calcula mitjançant el mètode Bootstrap i el nombre de repeticions de Bootstrap és de 1000 vegades.

Es va utilitzar UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS per a una detecció posterior. Les condicions de la fase líquida eren la columna Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura de la columna 40 graus, naringenina , calcone i naringenina. El volum de càrrega de la substància de control és de 4 μL i el volum de càrrega del producte de reacció enzimàtica és de 7 μL. L'aigua (A)-acetonitril (B) s'utilitza com a fase mòbil. El gradient d'elució és: 0 a 5 min, 30% B; 5 a 15 min. , 30% ~ 60% B; 15~20 min, 60%~100% B; 20~25 min, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. El cabal volumètric és de 0,3 ml/min. Les condicions d'espectrometria de masses són font d'ions electrospray, nitrogen com a gas portador, pressió del gas de la funda 3,5 MPa, pressió del gas auxiliar 1,0 MPa, pressió de polvorització 3500 V, temperatura capil·lar 350 graus, temperatura d'escalfament del gas auxiliar 200 graus, modes d'ions positius i negatius, escaneig. El rang d'ions m/z és 100-1500, la resolució MS completa és 35 000, la resolució dd-MS2 és 17 500, (N)

CE / nce escalonat establert a 35, 60.

2.6 Localització subcel·lular de la proteïna CtCHS

A partir de la seqüència CtCHS i el principi de la clonació perfecta, es van dissenyar primers amb llocs de tall enzimàtic Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ i es van amplificar els fragments diana corresponents mitjançant PCR. El plasmidi pCAMBIA1300-35S-GFP es va digerir amb endonucleases de restricció Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, i el fragment objectiu i el vector es van connectar mitjançant el kit de clonació sense fissures (Novizan, Cat C115-01) i després es van transferir en cèl·lules competents de E. coli DH5. , seleccioneu les soques de clons únics per a la seqüenciació i extreu els plasmidis de les soques correctes. Els plasmidis pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS i pCAMBIA 1300-35S-GFP es van transformar en protoplasts d'Arabidopsis thaliana mitjançant PEG4000 i es van cultivar amb poca llum durant 8 a 10 h. La localització subcel·lular de la proteïna CtCHS es va observar sota un microscopi confocal làser.

2.7 Anàlisi de patrons d'expressió CtCHS

A partir de la seqüència CtCHS, DNAMAN es va utilitzar per dissenyar primers quantitatius de fluorescència en temps real, amb F-box com a gen de referència intern. Les seqüències d'imprimació es mostren a la taula 1. L'expressió relativa de CtCHS en flors de Cistanche deserticola de diferents colors es va detectar mitjançant PCR quantitativa de fluorescència en temps real. Utilitzeu TransStart Green qPCR SuperMix (or complet, AQ101-02) per mesurar amb el mètode de colorant fluorescent SYBR Green, sistema de reacció: 2 × TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, imprimadors aigües amunt i aigües avall (10

μmol/L) {{0}},2 μL cadascun, plantilla d'ADNc 0,5 μL, aigua lliure de nucleotidases 4,1 μL, es va utilitzar un mètode de dos passos per a la reacció i el procediment de reacció es va basar en el mètode de Dong Xianjuan et al. [18]. Cada mostra contenia 3 rèpliques biològiques i l'experiment es va repetir tres vegades. Les dades experimentals es van analitzar amb Excel a 2

L'expressió relativa de CtCHS es va calcular mitjançant el mètode -ΔΔCt i es va utilitzar GraphPad Prism 8 per realitzar anàlisis de significació i dibuixar histogrames.