La combinació de la infusió de cèl·lules NK adoptives amb un pèptid alliberador de dopamina redueix les cèl·lules senescents en ratolins envellits

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

INTRODUCCIÓ

L'envelliment és un dels principals factors de risc de moltes malalties [1], i el desenvolupament de mètodes per intervenir en l'envelliment reduirà significativament el risc d'una sèrie de malalties relacionades amb l'edat com les malalties cardiovasculars i cerebrovasculars [2, 3], el càncer. [4] i la malaltia d'Alzheimer [5]. Les cèl·lules senescents (SNC) s'acumulen gradualment als teixits durant el procés d'envelliment i es consideren la principal causa de malalties relacionades amb l'edat [6-8]. S'ha demostrat que l'eliminació de SNC en models de ratolí prevé o retarda la disfunció dels teixits i allarga la vida útil [9, 10]. En canvi, el trasplantament de petites quantitats de SNC provoca una disfunció fisiològica en ratolins joves [1]. Aquests estudis han obert les portes per al desenvolupament de mètodes dirigits a l'eliminació de SNC per millorar les malalties cròniques relacionades amb l'edat.

Feu clic aquí per saber-ne més

L'aclaració dirigida de SNC, anomenada "senolítics", va ser la primera quimioteràpia provada amb èxit en un model preclínic in vivo, i actualment existeixen diversos agents senolítics [12]. Molts d'aquests fàrmacs es dirigeixen a vies anti-apoptòtiques regulades a les SNC per netejar selectivament certs tipus de SNC i han demostrat el potencial d'allargar la vida útil i millorar les funcions corporals [13, 14].Extracte de Cistanche Anti RadiacióMalgrat la reversió reeixida de la patologia relacionada amb l'edat en models animals, pot haver-hi alguns obstacles per utilitzar fàrmacs senolítics en humans a causa de l'heterogeneïtat dels SNC i l'alt risc de toxicitat [15]. Per tant, s'hauria d'explorar un mètode alternatiu que pugui eliminar amb seguretat una àmplia gamma de SNC en humans.

Els SNP poden ser reconeguts i eliminats pel sistema immunitari [16]. Estudis anteriors han demostrat que les SNC activen les cèl·lules assassines naturals (NK) mitjançant la regulació del lligand activador de la proteïna A i B relacionada amb la cadena de classe I d'histocompatibilitat principal [17]. No obstant això, amb l'edat, l'eficiència del sistema immunitari disminueix, cosa que pot provocar l'escapada immune de les SNC [18]. En la teràpia del càncer s'han explorat mètodes per superar l'escapada immune causada per la disminució de la funció immune [19]. S'han fet avenços recents en la transferència adoptiva de cèl·lules NK per eliminar tumors, cosa que ha demostrat una certa eficàcia [20]; per tant, era raonable suposar que la infusió adoptiva de cèl·lules NK podria produir citotoxicitat en SNC.

Els sistemes nerviós i immunitari són els dos sistemes adaptatius més importants del cos. Diversos estudis han demostrat que la dopamina (DA) com a regulador immune és una clau per a la comunicació neuroimmune [21]. DA realitza les seves funcions biològiques mitjançant la interacció i l'activació dels receptors de dopamina (DR), que es divideixen en 2 subgrups, D1-like (D1 i D5) i D2-like (D2, D3, i D4). Pel que fa a les seves diferents funcions, la participació de D1-com la DR estimula la producció d'AMPc, mentre que la participació de la D2-com la DR inhibeix la producció de cAMP [22]. Estudis anteriors han demostrat que l'estimulació DR com D1-millora la citotoxicitat de les cèl·lules NK tant in vitro [23] com in vivo [24]. Tanmateix, els nivells de DA disminueixen a mesura que augmenta l'edat humana [25]. Així, vam plantejar la hipòtesi que els fàrmacs dopaminèrgics podrien millorar la citotoxicitat de la infusió adoptiva de cèl·lules NK.

Cistanche pot anti-envelliment

Aquí, proposem l'ús de l'aceïna nonapeptídica, que va interactuar amb un enzim convertidor d'angiotensina (ACE I) per induir la secreció de DA [26], en combinació amb la teràpia sistèmica de cèl·lules NK per eliminar els SNC. Els resultats in vitro van mostrar que les cèl·lules NK eliminaven els SNC, independentment dels inductors de senescència i dels tipus de cèl·lules.cistanche herbaEn un model de ratolí envellit, la teràpia amb cèl·lules NK en combinació amb aceïna va reduir significativament el nombre de cèl·lules positives -galactosidasa (SA- -gal) associades a la senescència en diversos teixits, va disminuir l'expressió dels gens associats a la senescència als òrgans principals. i fenotips secretors associats a la senescència (SSP). Els resultats d'aquest estudi proporcionen informació sobre la possible restauració de la vigilància immune de les SNC cròniques mitjançant la teràpia amb cèl·lules NK en combinació amb Ace.

RESULTATS

La infusió adoptiva de cèl·lules NK redueix les cèl·lules CD3 més T senescents a la sang perifèrica

Per a l'estudi es van reclutar vint-i-sis voluntaris que van rebre infusió de cèl·lules NK. Les característiques i les propietats de les cèl·lules NK dels voluntaris es presenten a la taula 1. L'interval de temps per a la recollida de sang després de la transfusió de cèl·lules NK va ser d'uns 37 (25-57) dies. La proporció (Fig.1A) i el nombre absolut (Fig.1B) de cèl·lules NK a la sang perifèrica estaven inversament relacionades amb l'edat dels voluntaris. Sorprenentment, la puresa del producte de cèl·lules NK reinfusa a cada individu també es va correlacionar inversament amb l'edat dels voluntaris (Fig. 1C).creixement del penis de cistancheAixò pot ser degut a la disminució gradual del nombre de cèl·lules NK amb l'edat. Per tal de reflectir l'efecte anti-envelliment de l'administració de cèl·lules NK, es van detectar múltiples marcadors senescents a les cèl·lules CD3 més T de sang perifèrica, que reflecteixen en gran mesura el fenotip relacionat amb l'edat del cos [27], abans i després de la infusió de cèl·lules NK. En comparació amb els marcadors de senescència i el factor SASP de les cèl·lules T CD3 més a la sang perifèrica abans i després de la infusió de cèl·lules NK autòlogues, la proporció de cèl·lules T positives SA - -gal va disminuir significativament després de la infusió (Fig. 1D). Els nivells d'ARNm de P16, P21 i l'inhibidor de l'activador del plasminogen 1 (Pai1) es van reduir significativament, mentre que els canvis en els nivells d'ARNm de proteïna quimioatraient monòcits-1 (MCP{-1) i IL-6 no eren significatius (Fig. 1E). No hi va haver cap diferència significativa en els índexs bioquímics (taula suplementària 1) a la sang perifèrica.

Les cèl·lules NK humanes redueixen els marcadors de senescència del teixit adipós i la secreció de citocines proinflamatòries

Es va recollir teixit adipós de tres individus obesos, ja que l'obesitat tendeix a provocar una acumulació de SNC [28]. A més, el teixit adipós es va cultivar en un medi condicionat a partir de SNC per induir encara més la senescència del teixit adipós. El teixit adipós cultivat en un medi condicionat a partir de no SNC es va considerar com a control. L'expressió de perforina (Fig. 2A) i CD69 (Fig. 2B) a les cèl·lules NK es va regular significativament després de la co-incubació amb teixit adipós senescent en comparació amb la co-incubació amb teixit adipós control. L'expressió dels marcadors senescents p16 i p21 in

el teixit adipós senescent es va reduir significativament després del tractament amb cèl·lules NK (Fig. 2C, Fig. 1A, B suplementària). També vam trobar que el component clau de SASP en el medi condicionat després de la co-incubació amb cèl·lules NK del grup senescent es va reduir significativament (Fig. 2D). Aquests resultats van suggerir que les cèl·lules NK podrien eliminar els SNC del teixit adipós i reduir el fenotip SASP.

Les cèl·lules NK del ratolí es poden activar contra els SNC i exercir citotoxicitat

Primer vam induir la senescència de cèl·lules progenitores adiposes del ratolí per irradiació o adriamicina, tal com es va descriure anteriorment [29]. Per determinar si les cèl·lules NK estaven activades específicament per SNC, es van co-incubar cèl·lules de control no irradiades o SNC irradiades amb cèl·lules NK durant 24 h. La citometria de flux va demostrar que els nivells d'expressió de CD69 (Fig. 3A) i IFN-y (Fig. 3B) a les cèl·lules NK estaven significativament regulats a les cèl·lules diana SNC en comparació amb les cèl·lules diana de control. Mentrestant, després de la co-incubació amb cèl·lules NK, el nivell apoptòtic de les SNC era significativament superior al de les cèl·lules de control (Fig. 3C). A continuació, vam detectar l'expressió de lligands inhibidors i activadors de cèl·lules NK a les SNC. Els resultats de qPCR van mostrar que el nivell d'expressió dels lligands activadors a les cèl·lules NK es va regular significativament en comparació amb les cèl·lules de control, i el nivell d'expressió d'alguns lligands inhibidors, com la microglobulina beta 2 (2m), es va reduir en comparació amb les cèl·lules de control (Fig. .3D). També hem examinat la capacitat de les cèl·lules NK per eliminar els SNC in vivo.Beneficis de salsa cistancheLes cèl·lules de control marcades amb DiR i les SNC marcades amb DiR es van trasplantar a la cavitat abdominal dels ratolins i es van administrar cèl·lules NK a través de la vena de la cua. Els resultats d'imatge in vivo van mostrar que la intensitat de fluorescència en ratolins trasplantats amb SNC després del tractament amb cèl·lules NK era significativament més feble que la dels ratolins trasplantats amb cèl·lules control (Fig. 3E). Això va indicar que la capacitat de les cèl·lules NK per matar els SNC era significativament superior a la de les SNC in vivo. A continuació, vam determinar si la citotoxicitat de les cèl·lules NK contra els SNC era depenent de la dosi i específica de la cèl·lula. Al mateix temps, també vam utilitzar la senescència induïda per la doxorubicina per determinar si la citotoxicitat de les cèl·lules NK contra les SNC es limitava a la inducció de radiació. Els resultats van mostrar que les cèl·lules NK tenien una activitat citotòxica significativa contra les SNC de manera dependent de la dosi, però poca citotoxicitat contra les cèl·lules control. Els diferents mètodes d'estimulació de la senescència no van tenir cap efecte sobre la capacitat de les cèl·lules NK per matar els SNC (Fig. 3F). Aquests resultats van suggerir que les cèl·lules NK podrien ser activades específicament per les SNC i produir una citotoxicitat significativa contra les SNC in vitro i in vivo.

DA millora la citotoxicitat de les cèl·lules NK del ratolí contra els SNC mitjançant receptors tipus D1-

A la vista de la important funció de comunicació neuroimmune de DA [30], vam avaluar si DA podria millorar la citotoxicitat de les cèl·lules NK del ratolí contra les SNC. Les cèl·lules NK es van co-incubar amb SNC induïdes per radiació i es van afegir diferents concentracions de DA al medi. Els resultats van mostrar que el DA podria millorar la citotoxicitat de les cèl·lules NK contra les SNC (Fig. 4A, B). Per caracteritzar la via de senyalització per la qual DA va millorar l'efecte de destrucció de les cèl·lules NK a les SNC, es van avaluar els canvis en l'expressió DR, el contingut d'AMPc i la fosforilació de la proteïna d'unió a l'element de resposta (CREB) de cAMP a les cèl·lules NK. A les cèl·lules NK co-incubades amb SNC juntament amb DA, el contingut de cAMP (Fig. 4C) i el nivell de fosforilació de CREB (Fig. 4D, Fig. 2A suplementària) es van augmentar significativament, en comparació amb les cèl·lules NK i la co-incubació de SNC. sense DA. Per aclarir per què DA millora l'activitat de destrucció de les cèl·lules NK contra les SNC, vam comparar els canvis de DR a les cèl·lules NK després que les cèl·lules NK fossin co-incubades amb SNC o cèl·lules de control. Els resultats van mostrar que el nivell d'expressió DR D1 i D5 es va regular significativament després que les cèl·lules NK fossin co-incubades amb SNC en comparació amb les cèl·lules control (Fig. 4E). A continuació, antagonistes de receptors semblants a DA i D1-o com a D2-

Els antagonistes dels receptors es van afegir al sistema de co-incubació de cèl·lules NK i SNC. En comparació amb l'addició de DA només, el nivell d'apoptosi dels SNC es va reduir amb l'addició de DA més SCH -23300 (antagonista del receptor semblant a D1-) (Fig. 4F, G). Mentrestant, es va reduir el contingut d'AMPc (Fig. 4H) i el nivell de fosforilació de CREB (Fig. 4l, Fig. 2B suplementària) a les cèl·lules NK. Per contra, l'addició de DA més haloperidol (antagonista del receptor D2) no va canviar significativament el nivell d'apoptosi dels SNC, el contingut d'AMPc i la fosforilació CREB a les cèl·lules NK, en comparació amb l'addició de DA sola. Aquests resultats van demostrar que DA va millorar l'activitat de destrucció de les cèl·lules NK del ratolí contra SNC mitjançant D1-com els Drs.

Ace combinat amb cèl·lules NK de ratolí millora significativament l'eliminació de SNC in vivo

Un estudi anterior ha demostrat que la dopamina disminueix amb l'edat en humans [22]. Primer vam mesurar el nivell de dopamina perifèrica en ratolins joves i grans. Els resultats van indicar que els nivells de dopamina plasmàtica dels ratolins vells eren inferiors als dels ratolins joves (Fig. 5A). A continuació, es va explorar l'alliberament perifèric de dopamina després de la injecció intraperitoneal d'aceïna en ratolins vells. Vam trobar que els nivells de dopamina plasmàtica van augmentar significativament després d'una injecció d'Aceïna de 10 mg/kg (Fig.5B, Fig.3 suplementària). En vista d'això, vam realitzar cèl·lules NK de ratolí combinades amb aceïna per tractar ratolins envellits. Vam detectar l'estat de les cèl·lules NK a la sang perifèrica dels ratolins després del tractament i vam trobar que el nombre de cèl·lules NK a la sang perifèrica d'infusió de cèl·lules NK soles o de cèl·lules NK combinades amb Aceïna era significativament superior al del grup tractat amb Ace i Grup PBS, mentre que el nombre de cèl·lules NK no va ser significativament diferent entre el grup tractat amb cèl·lules NK i les cèl·lules NK combinades amb el grup tractat amb Aceïna (Fig. 5C, D).dosificació de cistanche tubulosa redditUna detecció addicional del nivell d'activació de les cèl·lules NK va mostrar que el nivell d'expressió de CD69 a les cèl·lules NK de sang perifèrica del grup tractat combinat es va regular significativament en comparació amb el grup tractat de cèl·lules NK (Fig. 5E). A continuació, vam avaluar els SNC al teixit. Vam trobar que la infusió de cèl·lules NK només reduïa l'expressió d'alguns marcadors senescents en comparació amb el grup PBS i el grup tractat amb Aceïna, mentre que la infusió de cèl·lules NK combinades amb Aceïna reduïa significativament les cèl·lules SA- -gal positives (Fig. 5F). ), així com els nivells d'expressió de P16 i P21 (Fig. 5G, Fig. 4A, B suplementària) al teixit adipós, en comparació amb el tractament de cèl·lules NK només. El nombre de Ki67BrdUcells al teixit adipós també es va incrementar significativament (Fig. 5H), demostrant encara més que el contingut de SNC al teixit adipós era menor en el grup tractat combinat. La tinció de SA- -gal de les seccions de fetge, pulmó, ronyó i greix també va mostrar el nivell més baix de SNC en el grup tractat combinat (figura suplementària 5A-D). Aquests resultats van mostrar que les cèl·lules NK combinades amb la teràpia amb aceïna van millorar el nivell d'activació de les cèl·lules NK en ratolins i van provocar una eliminació significativa de les SNC in vivo.

Ace combinat amb cèl·lules NK redueix els fenotips relacionats amb l'edat en ratolins vells

Per confirmar encara més els fenotips relacionats amb l'edat en ratolins, es van recollir teixits hepàtics, pulmonars, renals, greixos i oculars per detectar una varietat de marcadors senescents, inclosos els factors P16, P21 i SASP. Aquestes mostres es van escollir perquè aquests teixits tenen més probabilitats de patir senescència amb l'edat [31]. A cada teixit, només després de la infusió de cèl·lules NK, els nivells d'ARNm dels factors P16, P21 i SASP eren significativament inferiors als del grup control, mentre que els nivells de marcadors de senescència al fetge, greix i teixits de la vespra en els teixits tractats combinats. El grup es va reduir encara més en comparació amb el grup tractat només amb infusió de cèl·lules NK (Fig. 6A). De la mateixa manera, també hem detectat el principal factor SASP en el sèrum de ratolins, i els resultats van ser coherents amb els resultats en teixits (Fig.6B). A més, també hem examinat els nivells de NAD al fetge i al teixit adipós, que estan relacionats amb l'envelliment [32]. Vam trobar que la infusió de cèl·lules NK soles o en teràpia combinada augmentava significativament el contingut de NAD al fetge i al teixit adipós, sent el nivell de millora significativament més elevat en el grup de teràpia combinada (Fig. 6C). Alguns índexs bioquímics sèrics com ALT, AST, CREA, UA, CHOL i BUN estan associats amb els nivells d'envelliment [33]. Hem trobat que només la UA es va reduir significativament en el sèrum de ratolins del grup tractat amb combinació, mentre que els altres índexs bioquímics clau no ho van fer.

MATERIAL I MÈTODES Infusió de cèl·lules NK humanes

La infusió de cèl·lules NK autòlogues va ser realitzada per l'Hospital de Càncer de Xangai Mengchao (Xangai, Xina) i tots els protocols van ser aprovats pel seu comitè d'ètica (núm. 05,2020, Comitè d'Ètica Mèdica de l'Hospital de Càncer de Xangai Mengchao). Tots els voluntaris van proporcionar un consentiment informat signat per obtenir sang perifèrica. Breument, es van extreure 50 ml de sang perifèrica de cada individu, després de la qual cosa es van aïllar cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) i es van transferir a un matràs T75 amb ExCellerate" Human NK Expansion Media (R&D Systems, EUA) que contenia 1 × Cloudz CD2/NKp46. , IL-2(27ng/mL) humana recombinant, L-12 humana recombinant (10 ng/mL), IL-18 humana recombinant (10 ng/mL i L{{ humana recombinant) 13}}(10 ng/mL) (R+D Systems, EUA) durant 48 h, i després substituït per medi activat (270 ng/mL IL humana recombinant-2, IL humana recombinant 20 ng/mL-12 , 20 ng/ml de IL humana recombinant-18 i 20 ng/ml de IL humana recombinant{-21) per a més cultiu. La densitat cel·lular es va mantenir a 1 × 10 graus cèl·lules/ml. El dia 28 de cultiu , es va recollir un petit nombre de cèl·lules NK autòlogues per al control de qualitat i es van reinjectar per via intravenosa juntament amb cèl·lules NK autòlogues a una densitat de 4,15 × 10 graus (3.76-5.87 × 10) cèl·lules, amb un temps d'infusió de 30 minuts. El procés experimental es va dur a terme d'acord nce amb la Bona Pràctica Clínica. L'interval de temps per a la segona recollida de sang va ser d'uns 37 (25-57) dies.

Aïllament de cèl·lules T i cèl·lules NK de sang perifèrica humana Es va obtenir sang fresca de voluntaris sans després de donar-se el consentiment informat i el protocol va ser aprovat pel comitè de revisió institucional de la Universitat Farmacèutica de la Xina (número de permís: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Canadà) es va utilitzar per aïllar PBMC humans. Les cèl·lules CD3 més T humanes es van obtenir a partir de PBMC mitjançant perles magnètiques de classificació de cèl·lules T CD3 humanes (Miltenyi Biotec, Alemanya) d'acord amb el protocol del fabricant. Les cèl·lules NK es van aïllar de la sang perifèrica mitjançant el còctel d'enriquiment de cèl·lules NK humanes RosetteSep (STEMCELL Technologies) segons el protocol del fabricant.

Separació i expansió de cèl·lules NK de ratolí in vitro

Les cèl·lules NK esplèniques del ratolí es van aïllar mitjançant el kit d'aïllament de cèl·lules NK (Miltenyi Biotec) segons les instruccions del fabricant. Breument, es van obtenir mels de ratolí, es van filtrar cèl·lules de melsa mitjançant un filtre de cèl·lules de 70 μm i es van obtenir limfòcits de melsa mitjançant centrifugació de gradient de densitat mitjançant un kit de separació de limfòcits de melsa de ratolí (Solarbio, Xina). Els limfòcits esplènics es van recollir per obtenir cèl·lules NK d'alta puresa mitjançant perles magnètiques per separar les cèl·lules NK del ratolí. Les cèl·lules NK esplèniques aïllades es van cultivar en un medi de manteniment RPMI-1640 complementat amb un 10% de sèrum fetal boví (FBS), 1% de L-glutamina, 1% de penicil·lina/estreptomicina, 1% de mitjà essencial mínim (MEM) no aminoàcid essencial, àcid piruvat sòdic a l'1 per cent i mercaptoetanol 50 uM (tots de Life Technologies, EUA). A més, es van afegir 200 UI/mL d'interleucina 2 recombinant (RL-2) (PeproTech, EUA) i 10 ng/mL de ratolí I{-15(ml{-15) (PeproTech) mitjà. A continuació, es van recollir cèl·lules NK de 10 graus i limfòcits esplènics irradiats a 10 graus i 5 ml de medi d'amplificació (medi de manteniment complementat amb 1000 UI/mL rlL-2, 10ng/mL ml{-15 i 30ng/mL anti -L'anticòs NKp46 (PA5-46986, Invitrogen, EUA)) era

Fig. 3 Els SNC activen les cèl·lules NK i van ser assassinats per cèl·lules NK. La citometria de flux per detectar l'expressió de (A) CD69 i (B) IFN-y es va realitzar després d'una co-incubació de 24 hores amb cèl·lules NK i preadipòcits de ratolí o preadipòcits induïts per irradiació. n =3. Les dades es presenten com a mitjanes ± SD. Les diferències es van avaluar mitjançant la prova t no paramètrica no aparellada de dues cues. **Pàg<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Extracció de preadipòcits i cèl·lules satèl·lits musculars

Els preadipòcits es van extreure tal com es va descriure anteriorment [11]. Breument, es va eliminar el greix humà o del ratolí en condicions estèrils i es va tallar en trossos de 1-2 mm, es va rentar dues vegades amb PBS i es va digerir amb col·lagenasa ll (Solarbio) a 37 graus durant 1 h. A continuació, es van filtrar les cèl·lules amb un filtre cel·lular de 100 μm, es van centrifugar a 300 g durant 5 min i es van recollir. Les cèl·lules adherides es van cultivar en a-MEM complementat amb un 20 per cent de FBS durant 12 h i es van digerir amb tripsina per recollir cèl·lules adherides. Les cèl·lules satèl·lits musculars es van aïllar tal com es va descriure anteriorment [34]. El múscul quàdriceps es va tallar en trossos de 1-2 mm i es van afegir 5 ml de col·lagenasa ll per a la digestió a 37 graus C durant 12 min. La barreja es va barrejar amb una pipeta i es va afegir un medi complet de 5 ml després d'una digestió addicional durant 12 min. Les cèl·lules es van filtrar amb un filtre cel·lular de 70 μm i es van centrifugar a 300 g durant 5 min. Llavors eren les cèl·lules

cultivat amb 5 ml de medi afegit diàriament durant 4 dies. Les cèl·lules adherides es van treure amb una pipeta i es van centrifugar a 2000 × g durant 5 min. Després de la digestió de tripsina a 37 graus durant 5 min, les cèl·lules es van centrifugar a 2000 × g durant 5 min i es van recollir. A continuació, es van afegir 5 ml de medi de pernil F-10 suplementat amb un 20% de FBS i 4 ng/ml de factor de creixement bàsic de fibroblasts (PeproTech).

La citotoxicitat de les cèl·lules NK esplèniques del ratolí a les SNC es va detectar mitjançant l'assaig de lactat deshidrogenasa

Els SNC van ser induïts per 0.2 μM Adriamycin (MedChemExpress, EUA) durant 24 h o per cultiu continuat durant 20 dies després d'una radiació de raigs X de 10 Gy. A continuació, es van col·locar 5.000 SNC en una placa i es van afegir cèl·lules NK esplèniques (viabilitat cel·lular: 93, 5-97,1 per cent) amb proporcions efector a objectiu de 50:1,25:1,12,5:1, 6,25: 1,3.125:1 i 1.563:1. Els sobrenedants es van recollir després del co-cultiu a 37 graus C durant 24 hores, i es va utilitzar un kit de detecció de citotoxicitat de lactat deshidrogenasa (LDH) (Cayman Chemical, EUA) per a la detecció. La citotoxicitat es va calcular mitjançant la fórmula següent: citotoxicitat (percentatge) =(mescla de cèl·lules experiment-cèl·lula diana-cèl·lula efectora espontània espontània)/(cèl·lula diana màxima-cèl·lula diana espontània) × 100.

Imatge en directe

Es van comprar ratolins C57BL/6 de dotze 10-setmanes d'edat a Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Xina). A continuació, control marcat amb 1,1'-octadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina (DiR) (Invitrogen) d'1 × 10 graus

Els preadipòcits o preadipòcits senescents induïts per radiació es van tornar a suspendre en 200 uL de solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i es van injectar a la cavitat abdominal dels ratolins amb una agulla de calibre 22. Després de tres dies, es van injectar cèl·lules NK al·logèniques de 5 × 10 graus (viabilitat cel·lular: 93, 6-96,2 per cent) en 100 uL de PBS a través de la vena de la cua. El 10è dia, els ratolins van ser anestesiats amb isoflurà. La fluorescència es va detectar mitjançant el sistema d'imatge in vivo de la sèrie MS 100 (PerkinElmer, MA, EUA).

Citometria de flux

Per detectar l'apoptosi de les SNC co-incubades amb cèl·lules NK esplèniques marcades amb DiR (viabilitat cel·lular: 91, 8-93,2 per cent), es van digerir SNC d'1 × 10 graus amb precisió a 37 graus durant 10 minuts i després es van tacar. amb un kit de tinció d'apoptosi d'annexina V i iodur de propidi (PI) (Multisciences Biotech Co, Ltd., Xina) segons el protocol del fabricant. Els SNC estaven tancats en la posició negativa de DiR. Per provar l'activació de cèl·lules NK, es van recollir cèl·lules NK de ratolí i es van tacar amb mNK1.1-alloficocianina (APC) (S17016D) i amb un grup de diferenciació de ratolí 69-R-ficoeritrina-cianina7 (mCD{{{ 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, EUA) a 4 graus durant 30 minuts. A continuació, les cèl·lules es van processar amb el CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, EUA) i es van tenyir amb interferó gamma brillant violeta 421 de ratolí (mlFNy-BV421) (XMG1.2) a 4 graus durant 30 minuts. La tinció de perforina-APC (S16009A) de cèl·lules NK humanes es va realitzar mitjançant el mateix protocol que l'utilitzat per a la tinció extracel·lular (CD56-isotiocianat de fluoresceïna [FITC] (5.1H11), CD69-PE (FN50) ) i tinció intracel·lular (perforina-APC) (Biolegend).

Per detectar cèl·lules NK de sang perifèrica, es van recollir 100 uL de sang anticoagulant. Per a la sang perifèrica del ratolí, es van afegir CD3-FITC, NK1.1-APC i CD69-PE-Cy7. Per a la sang perifèrica humana, es van afegir CD3-BV421 (OKT3) i CD56-FITC i es van incubar durant 20 min a temperatura ambient.

A continuació, es van afegir 400 μL 1 × lisat d'eritròcits (BD Biosciences) i es van incubar durant 3 min, seguits de tres rentats amb PBS. Per detectar la proliferació cel·lular al teixit adipós, els ratolins van ser injectats per via intraperitoneal amb 200 μL de 10 mg/ml de bromodeoxiuridina （BrdU） 24 i 72 h abans de l'eutanàsia. Després de l'eutanàsia, es van eliminar els dipòsits de greix inguinal i es van tallar en fragments, es van digerir a 37ºC durant 30 min amb col·lagenasa II i DNasa i es van filtrar amb un filtre de cèl·lules de 100 um. Les cèl·lules es van processar amb el kit Cytofix/Cytoperm Plus i es van tacar amb BrdU-FITC (3D4) i Ki67-PE (16A8). La citometria de flux es va realitzar en un citòmetre de flux CytoFLEX. El kit de taques de cèl·lules mortes de violeta fixable LIVE/DEAD (Thermo Fisher Scientific, EUA) es va utilitzar per excloure les cèl·lules mortes en tots els experiments. Les dades es van analitzar mitjançant el programari FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, EUA).

PCR quantitativa de transcripció inversa

L'ARN es va extreure mitjançant el reactiu Trizol i es va invertir i es va transcriure a ADNc mitjançant el kit de síntesi d'ADNc de Hair 1st Strand (Yepsen Biotechnology, Xina). La PCR quantitativa (qPCR) es va realitzar mitjançant la barreja de reacció de SYBR Green (Yepsen Biotechnology) al sistema de PCR en temps real ABC QuantStudio 3 (Applied Biosystems, EUA), amb GAPDH servint de control intern. Les dades es van analitzar mitjançant el mètode 2-△ACt. La llista de seqüències d'imprimació s'informa al material suplementari (taula 2-3).

Tinció de galactosidasa associada a la senescència

Per a la tinció cel·lular, les cèl·lules es van rentar una vegada amb PBS, es van fixar en una solució de -galactosidasa (SA- -gal) associada a la senescència (Cell Signaling Technology, EUA) a temperatura ambient durant 15 min, es van rentar tres vegades amb PBS i es van incubar. durant la nit en una solució de tinció SA- -gal a 37 graus C. La placa es va segellar amb parafilm per evitar l'evaporació del medi de tinció. Cèl · lules

es van rentar amb PBS i es van observar amb un microscopi. Per a la tinció de la secció congelada, les seccions es van assecar a 37 graus durant 30min i es van fixar a temperatura ambient en una solució de fixació SA- -gal durant 15 min. Les seccions es van rentar tres vegades amb PBS i es van incubar durant la nit en una solució de tinció SA- -gal a 37 graus C. Després es van tenyir amb eosina durant 1 min i es van esbandir amb aigua durant 2 min. Les dades de tinció de SA- -gal es van analitzar mitjançant el programari Image-Pro Plus 6.0.

Explants de teixit adipós humà

Es va obtenir teixit adipós de tres individus mitjançant liposucció. Un dels subjectes era un home i dos dones. La mitjana d'edat dels subjectes era de 57.0±7,6 anys (mitjana ± DE: rang, 50-65). L'IMC mitjà va ser de 40,5 ± 5,1 kg/m² (mitjana ± SD; rang, 36.7-46.2）. El comitè d'ètica de l'Hospital de Càncer de Xangai Mengchao (núm. 05, 2020, Comitè d'Ètica Mèdica de l'Hospital de Càncer de Xangai Mengchao) va aprovar l'esquema experimental. Es va obtenir el consentiment informat de tots els voluntaris. El teixit adipós es va tallar en trossos petits amb un diàmetre d'uns 2 mm. Es van col·locar cinc peces de teixit a cada pou d'una placa de 96-pous i 200 uL de preadipòcits o de medi condicionat de preadipòcits senescents induïts per radiació, complementats amb un 10% de sèrum AB humà, un 1% de L-glutamina, 1 per cent de penicil·lina/estreptomicina, 1 per cent d'aminoàcids no essencials MEM i 1 per cent d'àcid piruvat sòdic, es van afegir al cocultiu durant 24 h. A continuació, el medi es va substituir per un medi fresc que contenia cèl·lules NK autòlogues de 5 × 10 graus (viabilitat cel·lular: 92,{30}},7 per cent 6) i es va cultivar durant 48 h més, després de les quals es van recollir cèl·lules NK per a citometria de flux. El teixit adipós es va rentar cinc vegades amb PBS i es va afegir el mateix medi per a un cultiu més durant 48 h; el sobrenedant (100 uL) es va utilitzar per a la detecció multifactorial. Els preadipòcits o preadipòcits senescents induïts per radiació es van derivar del teixit adipós del mateix individu.

Aquest article està extret de Cell Death and Disease (2022) 13:305