L'activitat del complement està regulada en la glomerulopatia C3 per proteïnes de fusió del factor H IgG amb i sense dominis d'orientació de propedines

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² i Matthew C. Pickering

'Centre for Inflammatory Disease, Imperial College London, Regne Unit; i²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, EUA

C3 glomerulopatiaEs caracteritza per l'acumulació de complement C3 dins dels glomèruls. Les causes inclouen, però no es limiten a, anomalies en el factor H, el principal regulador negatiu de la via alternativa del complement. Els ratolins amb deficiència de factor H (Cfh-/-) desenvolupen C3glomerulopatiajuntament amb una reducció dels nivells plasmàtics de C3. Utilitzant aquest model, vam avaluar l'eficàcia de dues proteïnes de fusió que contenien els dominis reguladors de la via alternativa del factor H (FH1-5)

enllaçat amb una immunoglobulina de ratolí no dirigida (IgG-FH1-5) o amb un anticòs anti-propedina de ratolí (Anti-P-FH1-5). Ambdues proteïnes van augmentar la C3 plasmàtica i van reduir la deposició glomerular de C3 en una mesura equivalent, cosa que suggereix que l'orientació de la properdina no era necessària perquè FH1-5 alterés l'activació de C3 ni al plasma ni als glomèruls. Després de l'administració d'IgG-FH1-5, els nivells plasmàtics de C3 es van correlacionar temporalment amb els canvis en els nivells de factor B, mentre que els nivells plasmàtics de C5 es van correlacionar amb els canvis en els nivells de properdina plasmàtica. En particular, els augments de plasma

Els nivells de C5 i properdina van persistir durant més temps que els augments de C3 i factor B. En ratolins Cfh-/-, IgG-FH1-5 va reduir la lesió renal durant la nefritis nefrotòxica sèrica accelerada. Així, les nostres dades demostren que la IgG-FH1-5 va restaurar l'activitat de la via alternativa circulant i va reduir la deposició glomerular de C3 en ratolins Cfh-/- i que els nivells de propedina plasmàtica són un marcador sensible de l'activitat de la C5 convertasa en la deficiència del factor H. La proteïna FH1-5 conjugada amb immunoglobulines, a través de la seva semivida plasmàtica relativament llarga, pot ser una teràpia potencial per a C3glomerulopatia.

Cistanche pot ajudar amb la glomerulopatia

Declaració translacional

C3 glomerulopatia(C3G) és una malaltia renal caracteritzada per una acumulació anormal de complement C3 dins dels glomèruls i dany glomerular. Es deu a l'activació incontrolada de la via alternativa del complement. Les proteïnes de fusió, formades per dominis funcionals del regulador de la via alternativa, el factor H (FH), vinculats a un anticòs, van restaurar la regulació del complement i la C3 glomerular reduïda en un model de ratolí C3G. La conjugació d'anticossos no dirigida va donar lloc a una semivida plasmàtica de proteïnes de fusió relativament llarga, i això, o mètodes de conjugació similars, es podrien utilitzar per augmentar la funció FH en la teràpia de C3G.

C3 glomerulopatia(C3G) és un trastorn renal mediat pel complement caracteritzat per quantitats anormals de C3 dins dels glomèruls.1 Pot avançar a insuficiència renal i no té tractament definitiu.2 C3G s'associa amb una activació anormal de la via alternativa del complement (AP). L'activació de l'AP dóna lloc a la producció de C3bBb (C3 convertasa), un enzim que escinda C3. Després de l'addició d'una altra molècula C3b, el complex C3bBbC3b resultant (C5 convertasa) pot escindir el complement C5. Incontrolada

L'activació de l'AP a C3G es pot associar amb una reducció de C3, C5, factor B (FB) i properdina circulants. Les causes de l'activació incontrolada de l'AP inclouen la pèrdua de canvis de funció en els reguladors del complement i el guany de canvis de funció en els activadors del complement.2 El regulador negatiu clau de l'AP és el factor H (FH), i la deficiència de FH en humans, porcs i ratolins s'associa amb C3G. 3 El factor nefrític C3, un anticòs que estabilitza l'AP C3 convertasa és freqüent en C3G.4 El factor nefrític C3 pot provocar una reducció de C3 sol (factor nefrític C3 independent de la pròpia) o una reducció tant de C3 com de C5 (properdin- factor nefrític C3 dependent).5,6

Tot i que la deficiència de properdina no va millorar els nivells plasmàtics de C3, els nivells de C5 van augmentar, cosa que suggereix que la properdina era necessària per a l'activitat de la C5 però no la C3 convertasa.8,9.

L'administració de ratolí10 o FH11,12 humà a ratolins Cfh–/– va reduir la tinció glomerular de C3 i va augmentar els nivells circulants de C3. Les construccions que només contenen els dominis reguladors i d'orientació de FH (molècules mini-FH) també són eficaços en aquest model.13 Altres enfocaments inclouen proteïnes que s'orienten als llocs d'activació del complement. Aquests inclouen TT30,14 una proteïna que conté els dominis reguladors del complement de FH (FH1-5) vinculats als dominis d'unió al complement del receptor 2 del complement i molècules homodimèriques de FH,15 molècules mini-FH que contenen dominis d'unió al complement. de la proteïna 1 relacionada amb el factor H.

Com que la utilitat terapèutica d'inhibir l'activació del complement C3 s'està investigant en C3G,2 és important entendre la cinètica de la deposició de C3 glomerular i la seva relació amb l'activació de l'AP tant dins dels glomèruls com de la circulació. En models de glomerulonefritis mediada per complexos immunitaris, la C3c glomerular es va eliminar en les 24 hores posteriors a la prevenció de l'activació del complement, mentre que la C3d glomerular va persistir durant setmanes. , mentre que el C3d glomerular es manté sense canvis.11

En aquest estudi, es va investigar l'eficàcia de 2 noves proteïnes de fusió amb activitat reguladora del complement en el model de ratolí Cfh–/– de C3G. Les proteïnes contenien els dominis reguladors de l'FH del ratolí (FH1-5), que es va conjugar amb la Ig del ratolí per allargar la semivida biològica. Una de les proteïnes de fusió, anomenada IgG-FH1-5, es va conjugar amb un anticòs monoclonal de ratolí no dirigit. L'altre, anomenat anti-P-FH1-5, es va conjugar amb un anticòs monoclonal contra la properdina del ratolí. Això es va fer per provar la hipòtesi que dirigir aquesta proteïna de fusió als llocs d'activació del complement, mitjançant la interacció amb la deposició de properdina, milloraria la regulació del complement tissular. Les nostres dades demostren que tant les proteïnes no orientades (IgG-FH1-5) com les dirigides a la properdina (anti-P-FH1-5) van restaurar la regulació plasmàtica i glomerular de C3 en ratolins Cfh–/–. Els estudis cronològics van demostrar que la restauració dels nivells de C3 i FB reflectia els nivells de proteïnes de fusió a la circulació. En canvi, els augments de C5 plasmàtic van persistir després que les proteïnes de fusió s'havien esborrat de la circulació. Mostrem que IgG-FH1-5 va millorar la lesió glomerular durant la nefritis nefrotòxica sèrica accelerada en ratolins Cfh–/–.

cistanche pot tractar la malaltia renal millorar la funció renal

RESULTATS

Generació de proteïnes de fusió i avaluació in vitro i in vivo de l'activitat Les proteïnes de fusió es van crear enllaçant els 5 primers dominis de repetició de consens curt (SCR) de FH de ratolí (FH1-5) amb un anticòs antipropedina de ratolí (anti -P-FH1-5) o un anticòs amb un domini Ig no dirigit (IgG-FH1- 5, figura suplementària S1). L'activitat de les proteïnes es va avaluar mitjançant un assaig hemolític específic d'AP (figura 1a). L'anti-P-FH1-5 i la IgG-FH1-5 van inhibir l'hemòlisi d'una manera dependent de la dosi amb una potència més gran per a l'anti-P-FH1-5. L'antiproperdina (anti-P) també va reduir l'hemòlisi de manera dependent de la dosi, però el control d'IgG no va tenir cap efecte. Després de les injeccions equimolars de les proteïnes als ratolins Cfh–/–, la proteïna IgG-FH1-5 es va detectar fins a 11 dies després de la injecció, mentre que l'anti-P-FH1-5 es va detectar fins a 4 dies després. injecció (figura suplementària S2). Per determinar si IgG-FH1-5 i anti-P-FH1-5 podrien restaurar la regulació de l'AP plasmàtica en ratolins Cfh–/–, primer vam mesurar els nivells plasmàtics de C3 després de la injecció de les proteïnes de fusió (figura 1b) . L'administració d'IgG-FH1-5 o anti-P-FH1-5 va augmentar significativament la C3 plasmàtica a les 24 hores i, en menor mesura, a les 96 hores després de la injecció (figura 1b). Aquestes dades van demostrar que tant l'IgG-FH1-5 com l'anti-P-FH{1-5 podrien restaurar temporalment la regulació de l'AP plasmàtica en ratolins Cfh–/–. A continuació, vam realitzar una anàlisi detallada d'aquests canvis caracteritzant el curs temporal dels canvis no només en el plasma C3, sinó també en el plasma C5 i les proteïnes de la via alternativa FB i properdina. Els augments dels nivells circulants de C5 i properdina persisteixen més temps que els augments de C3 i FB després de l'administració d'IgG-FH1-5 i anti-P-FH1-5 en ratolins Cfh–/–

Hem comparat la cinètica dels canvis en C3, C5, FB i properdina mesurant proteïnes a intervals de fins a 27 dies després d'una única injecció d'IgG-FH1-5 o anti-P-FH1-5 ( Figura 2). Després de l'administració d'IgG-FH1-5, l'augment màxim de C3, C5, FB i properdina es va produir el dia 1 després de la injecció. El temps perquè aquests canvis caiguin als nivells previs al tractament va ser diferent. El retorn als nivells de pretractament es va produir entre els dies 1 i 4 per a FB, entre els dies 7 i 11 per a C3 i entre els dies 14 i 21 per a la properdina i la C5 (figura 2a, c, e i g). Després de l'administració d'anti-P-FH 1-5, els nivells màxims de C3 es van produir el dia 1, però van caure als nivells de pretractament entre els dies 4 i 7 (figura 2b). Els nivells màxims de C5 es van produir el dia 4 i van tornar als nivells de pretractament entre els dies 7 i 11 (figura 2d). L'augment màxim de FB es va produir el dia 1 i va caure als nivells de pretractament entre els dies 1 i 4 (figura 2f). Com era d'esperar, la properdina de plasma lliure es va esgotar després de la injecció d'anti-P-FH 1-5 o anti-P (figura 2h). Els nivells de properdina en plasma lliure es van mantenir baixos fins a 7 dies després de l'anti-P-FH1-5 i fins a 14 dies després de l'anti-P (figura 2h). Tot i que ambdues proteïnes de fusió van restaurar temporalment la regulació de l'AP plasmàtica, la durada de la millora dels nivells de C3, FB i C5 va reflectir la durada de la seva detecció al plasma, que va ser més curta per a l'anti-P-FH 1-5 (figura suplementària S2) . En resum, els canvis en els nivells de C3 i FB després de la injecció de qualsevol proteïna van ser més curts que els de C5 i properdina. Aquestes dades suggereixen que el plasma FB és un marcador sensible de l'activitat de la convertasa C3 en aquest entorn, mentre que la properdina és un marcador de l'activitat de la convertasa C5. En particular, després de la injecció anti-P, hi va haver un augment de C5 a les 24 i 96 hores i el dia 7

Figura 1| ( a ) Complementar l'assaig d'hemòlisi depenent de la via alternativa. Els anticossos es van valorar en 2-dilucions de vegades des de 60 nM fins a 0,5 nM. Els reactius IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 i anti-P van reduir l'hemòlisi dels eritròcits de conill de manera dependent de la dosi. No es va utilitzar cap inhibició de la proteïna de control d'IgG. Les barres horitzontals denoten valors mitjans i les barres d'error representen SD. ( b ) Complement plasmàtic C3 en ratolins Cfh–/– després de la injecció de proteïnes de fusió. El plasma C3 es va mesurar abans i 24 hores i 96 hores després de l'administració d'IgG-FH1-5 (triangles vermells, n ¼ 5) Anti-P-FH1-5 (triangles morats, n ¼ 6), Anti -P (punts verds, n ¼ 5) i control IgG (punts blaus, n ¼ 5). Les barres horitzontals denoten valors mitjans i els bigotis denoten SD. ***P # 0,001 versus valor de pretractament i derivat de 2-via ANOVA amb la prova de comparacions múltiples de Bonferroni. FH, factor H; P, properdin.

(Figura 2d). Tal com es va informar,8,9 indica que la convertasa C5 depèn de la properdina en els ratolins Cfh–/–.

IgG-FH1-5 i anti-P-FH1-5 van reduir la C3c glomerular però no van alterar la tinció de C3d en ratolins Cfh–/–

A continuació, vam avaluar la influència de la IgG-FH1-5 i l'anti-P-FH1-5 en les proteïnes glomerulars C3b/iC3b/C3c, C3d, properdina i relacionades amb FH (FHR). A les 96 hores després de la injecció d'IgG-FH1-5, la tinció glomerular C3b/iC3b/C3c es va reduir, però la tinció glomerular C3d (figura 3a) i la tinció FHR (figura 3b) no. C3b/iC3b/C3c glomerular es va mantenir sense canvis amb control d'IgG o anti-P. El patró lineal anormal de tinció de propedina glomerular en ratolins Cfh–/– no tractats9 es va mantenir 96 hores després del control d'IgG. En els ratolins Cfh–/– injectats amb anti-P o IgG-FH1-5, el nivell de properdina glomerular era gairebé indetectable a les 96 hores (figura 3b). De manera inesperada, la injecció anti-P-FH1-5 va donar lloc a un patró de tinció glomerular granular mitjançant anticossos anti-properdina, anti-FH/FHR i anti-IgG (figura 3b). Aquesta troballa va suggerir que la proteïna anti-P-FH1-5 s'estava dipositant als glomèruls. La injecció de proteïna anti-P-FH1-5 en ratolins de tipus salvatge va donar lloc a una tinció glomerular amb anticossos anti-properdina, anti-FH/FHR i anti-IgG a les 96 hores (figura suplementària S3), cosa que indica que això El reactiu interacciona amb els glomèruls normals. Tanmateix, vam especular que la proteïna anti-P-FH1-5 també podria interactuar amb la properdina glomerular preexistent en ratolins Cfh–/–. Quan vam injectar el reactiu en ratolins Cfh–/– que havien estat pretractats amb anti-P per eliminar la properdina glomerular, es va produir una reducció dels patrons de tinció granular mitjançant anticossos anti-properdina, anti-FH/FHR i anti-IgG ( Figura suplementària S4). Aquestes observacions indiquen que la interacció glomerular de la proteïna anti-P-FH1-5 en ratolins Cfh–/– depèn en part de la properdina glomerular.

IgG-FH1-5 va millorar la lesió renal durant la nefritis nefrotòxica sèrica accelerada en ratolins Cfh–/–

En pacients amb C3G, es pot desenvolupar una lesió renal aguda en el context d'infeccions intercurrents. Per exemple, la pèrdua de funció renal en la nefropatia FHR5 s'associa amb episodis d'hematúria macroscòpica sinfaringítica.17 La desregulació de C3 subjacent en pacients amb C3G probablement produeixi una lesió renal mediada pel complement millorada després d'un desencadenant que produeixi una inflamació renal. Per modelar-ho, vam induir una nefritis nefrotòxica sèrica accelerada, un complex immune

Figura 2| Curs temporal del perfil del complement de plasma en ratolins Cfh–/– injectats amb IgG-FH1-5 i anti-P-FH1-5. Plasma C3 (a, b), C5 (c, d), FB (e, f) i properdina (P; g, h) des de l'inici experimental fins als 27 dies després de la injecció única d'IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; triangles vermells, n ¼ 5) o anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; triangles morats, n ¼ 6). Els controls incloïen anti-P (punts verds, n ¼ 5) i un anticòs monoclonal coincident amb isotips (control IgG; punts blaus, n ¼ 5). Les barres horitzontals denoten valors mitjans i els bigotis denoten SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 versus valor de pretractament i derivat de l'anàlisi 2-modal de la variància amb la prova de comparacions múltiples de Bonferroni. FB, factor B; FH, factor H.

Model de glomerulonefritis que implica vies mediades pel receptor del complement i Fc,18,19 en els ratolins Cfh–/–. Abans vam demostrar que els ratolins Cfh–/– són hipersensibles a la lesió renal en aquest entorn7 i vam plantejar la hipòtesi que la proteïna FH1-5, millorant la regulació AP, podria millorar la lesió renal mediada pel complement en aquest model. Com que les nostres dades indicaven que la proteïna anti-P-FH1-5 es va dipositar als glomèruls normals, vam utilitzar IgG-FH1-5 durant la nefritis nefrotòxica sèrica accelerada. Vint-i-quatre hores abans de la injecció de sèrum nefrotòxic d'ovella, els ratolins van rebre una injecció ip de control IgG (n ¼ 7) o IgG-FH 1-5 (n ¼ 8). El protocol experimental es mostra a la figura 4a. Els ratolins van ser sacrificats 6 dies després de l'administració de sèrum nefrotòxic d'ovella. Les 3 mesures histològiques de la patologia glomerular (puntuació de gravetat, nombre total de cèl·lules i nombre de macròfags) eren significativament inferiors al grup IgG-FH1-5 (figura 4b). La lesió tubulointersticial també va ser menor al grup IgG-FH 1-5 (figura 4b). La urea sèrica es va elevar significativament

Figura 3| Immunocoloració del complement glomerular en ratolins Cfh–/– 96 hores després de la injecció d'IgG-FH1-5 o anti-P-FH1-5. ( a ) Imatges representatives juntament amb quantificació de C3b/iC3b/C3c i C3d glomerulars en els 4 grups experimentals: IgG-FH1-5 (triangles vermells, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (triangles morats, n ¼ 6), anti-P (punts verds, n ¼ 5) i control d'IgG (punts blaus, n ¼ 5). El nivell de plasmaC3 es mostra a la figura 1. (b) Els punts de dades representen valors mitjans i els bigotis denoten un rang interquartil. Valors de P derivats de la prova de Kruskal-Wallis amb la prova de comparacions múltiples de Dunn. (b)Imatges representatives d'IgG glomerular, FHR i tinció en els 4 grups experimentals. Barra ¼ 100 mm.AFU, unitats fluorescents arbitràries; FH, factor H; P, properdin. Per optimitzar la visualització d'aquesta imatge, consulteu la versió en línia d'aquest article awww.kidney-international.org.

el grup de control d'IgG, però els canvis en l'albúmina sèrica i la proporció d'albúmina d'orina i creatinina no van diferir (figura 4b). Com era d'esperar, la C3b/iC3b/C3c glomerular es va reduir significativament al grup IgG-FH1-5 (figura 4b), però la IgG glomerular de ratolí (figura 4b) i la IgG d'ovella (dades no mostrades) no difereixen entre els grups. .

Figura 4| El pretractament amb IgG-FH1-5 va millorar la lesió renal durant la nefritis nefrotòxica sèrica accelerada en ratolins Cfh–/–. ( a ) Esquema del protocol de nefritis nefrotòxica sèrica accelerada. Els ratolins preimmunitzats amb IgG d'ovella van rebre IgG-FH1-5 (grup de tractament, n ¼ 8) o control IgG (grup control, n ¼ 7) 24 hores abans de l'administració del sèrum nefrotòxic d'ovella. ( b ) Funció renal i histologia 6 dies després de la inducció de nefritis nefrotòxica sèrica accelerada en ratolins tractats amb IgG-FH 1-5 (tractament; triangles vermells, n ¼ 8) o control IgG (control; cercles blaus, n ¼ 7). Les barres horitzontals denoten valors mitjans i els bigotis denoten un rang interquartil. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 versus control i derivat de la prova de Mann-Whitney. FH, factor H; P, properdin.

DISCUSSIÓ

Tant IgG-FH1-5 com anti-P-FH1-5 van normalitzar els nivells de C3, FB i C5 en ratolins Cfh–/–. Aquesta troballa és coherent amb el fet que els dominis reguladors del complement de l'FH del ratolí es troben dins dels dominis SCR de l'1 al 5 (un lloc d'unió a C3b i l'activitat del cofactor per a la divisió de C3b mediada pel factor I).20 Dominis de reconeixement de superfície, que influeixen la unió a l'heparina i les cèl·lules endotelials i inclouen un segon lloc d'unió a C3b, estan presents dins dels dominis SCR 18 a través

20 (FH18-20) i, per tant, no estan presents a les proteïnes de fusió.20 No obstant això, ambdues proteïnes van reduir iC3b/C3b/C3c glomerular, cosa que indica que FH18-20 no era necessària en aquest entorn. Aquesta troballa és coherent amb dades anteriors que mostren que els ratolins Cfh–/– que expressaven una proteïna FH mutant que consisteix en dominis SCR 1 a 15 (Cfh–/– .FHD16-20) no van desenvolupar una deposició glomerular C3 anormal.21,22. Tanmateix, els animals Cfh–/–.FH D16-20 no van poder regular l'activació de C3 al llarg de l'endoteli renal i van desenvolupar microangiopatia trombòtica. És possible que, a causa de la manca dels dominis FH18-20 orientats a la superfície, l'administració de proteïnes de fusió que contenen FH1-5 en la deficiència de FH pugui provocar una susceptibilitat a la microangiopatia trombòtica. També és possible que l'augment de l'avidesa per a la unió de C3b, sota l'estructura dimèrica de les proteïnes de fusió, sigui suficient per compensar l'absència dels dominis FH18-20 orientats a la superfície. Tanmateix, el reconeixement superficial de C3b també està influenciat pels canvis conformacionals en FH.23 Una proteïna d'unió a FH de Streptococcus pneumoniae (PspCN, que s'uneix al domini SCR 9), desencadena un canvi conformacional de FH, i el complex FH-PspCN havia augmentat la unió de C3b i Augment de l'activitat acceleradora de la decadència. El lloc d'unió a FH20 C3d no està exposat a FH, sinó que queda exposat al complex FH-PspCN. Això podria explicar per què FH19-20 interacciona amb la superfície C3d, però FH no.24,25 Especulem que els nostres agents, mitjançant canvis conformacionals, poden interactuar de manera eficaç tant amb la fase fluida com amb la superfície C3b. En particular, tant IgG-FH1-5 com anti-P-FH1-5 van protegir els eritròcits de la lisi en un assaig d'hemòlisi dependent de l'AP.

Cap proteïna de fusió va reduir la tinció glomerular de C3d, potser a causa de la naturalesa persistent de la C3d glomerular. En la nefritis del complex immune experimental, la C3c glomerular es va resoldre en les 24 hores posteriors al cessament de l'activació del complement, però la C3d va persistir durant setmanes.16 A més, la C3d glomerular és persistent en la nefritis lúpica.26 Això probablement reflecteix la seva interacció covalent amb les superfícies glomerulars. Les injeccions repetides de FH humana en ratolins Cfh–/– van mostrar una reducció de la C3d glomerular durant 10 dies.11 És probable que la dosi repetida d'IgG-FH1-5 pugui reduir la C3d glomerular en aquest model. Tampoc hi va haver cap canvi en la tinció glomerular de FHR. Se sap poc sobre les funcions de les proteïnes FHR del ratolí, però poden interactuar tant amb C3b27,28 com amb C3d.27 De fet, l'aparent afinitat de FHR-A i FHR-B per C3d és més forta que la de FH.27 Especulem que és probable que les proteïnes glomerulars FHR només s'eliminin dels glomèruls quan s'ha eliminat C3d. En aquest context, cal destacar que en la C3G humana, la proteïna 5 relacionada amb el factor H s'associa amb la C3d glomerular.29

La proteïna anti-P-FH1-5 va esgotar els nivells de properdina en plasma lliure com s'esperava perquè la part antiproperdina d'aquesta proteïna de fusió pot bloquejar l'activitat AP (a causa de l'esgotament de la properdina) durant 8 dies després d'una sola injecció.30 No obstant això, les nostres dades van mostrar que l'eficàcia de FH1-5 per augmentar els nivells plasmàtics de C3 i reduir la tinció glomerular de C3b/iC3b/C3c era comparable entre les dues proteïnes de fusió (és a dir, era independent de l'orientació de la properdina). A més, la tinció anormal de properdina glomerular es va reduir significativament després de l'administració d'anti-P o IgG-FH1-5. Evidentment, a diferència de les proteïnes C3d i FHR, la properdina glomerular s'elimina fàcilment després de la restauració de la regulació C3. La properdina glomerular va canviar de patró després de l'administració de la proteïna anti-P-FH1-5, però això es va complicar per l'observació que vam detectar la deposició d'aquesta proteïna de fusió tant en Cfh–/– com en glomèruls de tipus salvatge. Això es va deure en part a una interacció amb la properdina glomerular, però la deposició en glomèruls de tipus salvatge va indicar que també depenia totalment del complement glomerular i probablement estava relacionada amb les propietats fisicoquímiques de la proteïna de fusió.

Les nostres dades cinètiques van demostrar noves troballes sobre els canvis temporals en FB, C5 i properdina que acompanyen els augments de C3 en ratolins Cfh–/– després de la injecció de les proteïnes de fusió. Els nivells de FB van augmentar ràpidament després de la injecció

i va tornar als nivells basals en un moment en què els nivells de C5 i de properdina es van mantenir elevats. Els nivells de properdina en ratolins Cfh–/– es van reduir a la línia de base i van augmentar fins a nivells normals (20 mg/ml30) després de la injecció d'IgG-FH1-5 i es van mantenir en aquests nivells durant almenys 14 dies. Es va observar un curs temporal similar per a l'augment dels nivells plasmàtics de C5. Sorprenentment, IgG-FH1-5 va estar majoritàriament absent de la circulació als 11 dies, cosa que indica que la formació de la C5 convertasa en els ratolins Cfh–/– és més lenta que la de la C3 convertasa (perquè els nivells de C3 van tornar a la línia de base entre 7 i 11 dies). El plasma C5 va augmentar després del tractament anti-P i va augmentar encara més amb la proteïna anti-P-FH1-5. Per tant, tant l'orientació de la properdina com els efectes de FH1-5 estaven contribuint a l'augment dels nivells de C5 i indiquen que la convertasa C5 depèn parcialment de la properdina en els ratolins Cfh–/–. Aquesta troballa és coherent amb la millora de la desregulació de C5 en ratolins amb deficiència combinada de FH i properdina.8,9 Els nivells de properdina circulant es poden reduir en C3G i sembla que es correlacionen amb l'activitat de la convertasa C5 de superfície en contrast amb C5 plasmàtic o C5b soluble. {30}}.31,32 Les nostres dades donen suport a un vincle íntim entre els nivells de properdina i l'activitat de la convertasa C5 i donen suport a l'ús dels nivells de properdina com a biomarcador de l'activació glomerular C5 en curs.

En particular, la proteïna IgG-FH1-5 encara era detectable a la circulació fins a 11 dies després d'una única injecció. Això és molt més llarg del que vam informar anteriorment per a la proteïna FH1-5 no conjugada de ratolí, que es va eliminar de la circulació en 24 hores.14 Aquesta troballa indica que la vida mitjana plasmàtica més llarga de la IgG-FH{ La proteïna {9}} es deriva de la conjugació d'anticossos. La semivida plasmàtica de la proteïna IgG-FH1-5 també va ser més llarga que la que vam observar anteriorment per a FH de longitud completa.10,11 Per exemple, la FH humana es va eliminar de la circulació 96 hores després d'una sola injecció. en ratolins Cfh–/–.11 En combinació amb les nostres dades que demostren l'eficàcia de la proteïna IgG-FH1-5 en la regulació del complement, considerem que la conjugació de la proteïna FH{1-5 per allargar el seu perfil farmacocinètic té un potencial terapèutic. utilitat en C3G.

En resum, mostrem que, tot i no tenir dominis de reconeixement superficial, les proteïnes de fusió FH1-5 eren efectives per reduir l'activació glomerular de C3 i restaurar la regulació del complement plasmàtic en la deficiència de FH. No hi havia cap avantatge evident en conjugar els dominis FH1-5 amb antiproperdina, i la proteïna IgG-FH1-5 va reduir la lesió renal en la nefritis experimental. En contrast amb els reptes de produir preparats a gran escala de FH per a ús terapèutic, la producció a gran escala de teràpies basades en anticossos està ben establerta, cosa que fa que IgG-FH1-5 sigui un potencial terapèutic atractiu per a C3G.

MÈTODES

Proteïnes de fusió

IgG-FH1-5. Els 5 primers dominis FH SCR del ratolí (mFH1-5) enllaçats

a una Ig de ratolí IgG1 no dirigida (un anticòs antiidiotípic generat contra un anticòs monoclonal de ratolí).

Anti-P-FH1-5. Murine FH1-5 vinculat a un anticòs antiproperdina del ratolí (anti-P),30 proporcionat a Alexion per W. Song, Universitat de Pennsylvania).

Controls. Els controls eren Ig de ratolí no orientada a isotips (control IgG) i antiproperdina (anti-P) de ratolí (figura suplementària S1). Les proteïnes es van generar mitjançant vectors pVEK i cèl·lules Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), purificades amb proteïna A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

Assaig hemolític específic d'AP

El sèrum de ratolí normal del vint per cent titulat de 60 nM a 0,5 nM es va incubar amb eritròcits de conill (1.5 106 cèl·lules/ml) a 37 °C durant 30 minuts. L'alliberament d'hemo es va quantificar espectrofotomètricament (densitat òptica 415 nm); La lisi al 100% era sèrum sense inhibidor.

Plasma FB i FH

El plasma es va obtenir després de la centrifugació de la sang recollida en tubs que contenien àcid etilendiaminotetraacètic (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Alemanya). Les proteïnes es van mesurar mitjançant un immunoassaig d'electroforesi capil·lar (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Els anticossos utilitzats van ser anticossos policlonals anti-ratolí FH (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) i anticossos anti-ratolí FB (Abcam, Cambridge, Regne Unit); Es va utilitzar el mòdul de detecció anti-conill WES (ProteinSimple, San Jose, CA). Els senyals quimioluminiscents es van analitzar amb el programari Compass for SW (ProteinSimple, versió 5.0.1), es van quantificar com a àrees pics i es van normalitzar al control de l'assaig.

Els ratolins

Tots els ratolins es van allotjar en condicions específiques lliures de patògens; Els procediments es van realitzar d'acord amb les directrius institucionals i aprovats per l'Oficina d'Interior del Regne Unit. Els ratolins de tipus salvatge C57BL/6 es van comprar al Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) i es van generar ratolins Cfh–/– tal com es va descriure anteriorment.7 Els ratolins es van emparellar per edat i sexe; es van administrar dosis equimolars de proteïnes mitjançant injecció ip (1 mg per a antiproperdina i control d'IgG; 1,4 mg per a IgG-FH1-5 i anti-P-FH1-5). La nefritis nefrotòxica sèrica accelerada es va induir mitjançant la injecció iv de sèrum nefrotòxic d'ovella a ratolins preimmunitzats amb IgG d'ovella.7 L'administració de les proteïnes de fusió es va realitzar 24 hores abans de la inducció sèrica nefrotòxica d'ovella (figura 4a).

C3, C5 i properdina lliure El plasma C3 es va mesurar mitjançant un assaig immunoabsorbent lligat a enzims.14 Els nivells de propedina i C5 "lliure" en plasma es van mesurar mitjançant immunoassaigs d'electroquimioluminescència (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) amb anti - Properdina o un C5 anti-murí personalitzat recobert sobre plaques MSD d'alta unió. La properdina i C5 "lliures" lligades es van detectar amb antiproperdina (de W. Song) o anti-C5 monoclonal biotinilat (Alexion) combinat amb estreptavidina-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). El senyal quimioluminiscent es va adquirir mitjançant una imatge SECTOR S 6000 (MSD, Meso Scale Diagnostics) i es va analitzar amb el programari MSD Discovery Workbench (Meso Scale).

Diagnòstic, versió 4.0.12.1). Es van utilitzar com a estàndards la properdina murina recombinant i C5.

Funció renal i histologia

L'hematúria i la proteinúria es van avaluar mitjançant Hema-Combistix (Bayer, Reading, Regne Unit); Es va mesurar la urea plasmàtica i es va processar el teixit renal com s'ha descrit anteriorment.9 La creatinina urinària es va determinar en mostres d'orina puntuals mitjançant l'assaig del protocol Creatinina Companion (núm. 1012; Excell, Philadelphia, PA) i l'orina puntual/ L'albúmina plasmàtica es va mesurar mitjançant un assaig immunoabsorbent lligat a enzims (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Les seccions renals tenyides d'àcid periòdic amb Schiff es van avaluar de manera cega i es van classificar segons la gravetat de la lesió glomerular i tubulointersticial (0 [cap], 1 [lleu], 2 [moderada]). Es van avaluar deu glomèruls per secció per determinar el nombre mitjà de cèl·lules glomerulars. La tinció d'immunofluorescència es va realitzar en crioseccions de 5-mm muntades amb medi Vectashield amb DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Els anticossos utilitzats van ser C3b/C3c/iC3b de cabra policlonal conjugada amb isotiocianat de fluoresceïna (FITC) (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; IgG anti-ratolí de cabra policlonal conjugada amb FITC de cadena de figues específiques (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); IgG monoclonal de ratolí anti-cabra/ovella conjugada amb FITC (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); o Propedina anti-humà de cabra conjugada amb FITC (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immunologic Laboratories, Copenhaguen, Dinamarca).9 C3d anti-ratolí de cabra biotinilada (1:10; # BAF2655; R+D Systems , Minneapolis, MN) es va utilitzar en seccions bloquejades amb biotina (Sistema de bloqueig de biotina; Agilent Dako, Santa Clara, CA), amb anticòs secundari estreptavidina AF488 (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). La FH es va visualitzar en seccions bloquejades CD16/CD32-de rata purificada anti-ratolí (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) mitjançant FH antihumà de cabra (1:1000; #A312; Quidel, San Diego). , CA) i anticòs secundari monoclonal anti-IgG-FITC de cabra (1:100; clon GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Els macròfags glomerulars es van identificar mitjançant CD68 antiratolí de rata conjugada amb FITC (clon FA{-11 GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). L'anàlisi quantitativa d'immunofluorescència es va realitzar mitjançant un microscopi òptic Leica DM4B combinat amb una càmera digital Leica DFC700T (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanya) i el programari Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, versió 7). Es van examinar deu glomèruls per secció i la intensitat mitjana es va expressar en unitats arbitràries de fluorescencia.

Anàlisi estadística

GraphPad Prism, versió 8.0 (GraphPad, San Diego, CA) es va utilitzar per a l'anàlisi estadística. L'anàlisi de la variància de mesures repetides 2-mode amb la prova de comparacions múltiples de Bonferroni (els factors eren el temps i el tractament) es va utilitzar per a l'anàlisi del temps. Es va utilitzar la prova de comparacions múltiples de Kruskal-Wallis amb Dunn quan es van comparar diversos grups i la prova de Mann-Whitney per a 2 grups.

DIVULGACIÓ

MCP ha rebut honoraris de consultoria d'Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope i Achillion Pharmaceuticals. HTC ha rebut honoraris de consultoria d'Alexion, Novartis, Aurinia i Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ i SK-K són empleats d'Alexion Pharmaceuticals. SK és un antic empleat d'Alexion Pharmaceuticals i actualment treballa per Gemini Pharmaceuticals. Tots els altres autors no van declarar interessos en competència.

AGRAÏMENTS

MCP és un membre sènior de Wellcome Trust en ciències clíniques (referència de la subvenció 212252/Z/18/Z) i ACG i DPL reben el suport d'aquesta beca. YZ, SK, YW, KKJ i SK-K van ser finançats per Alexion Pharmaceuticals.

MATERIAL COMPLEMENTARI

Fitxer suplementari (PDF)

Figura S1. Proteïnes de fusió utilitzades en aquest estudi. La IgG-FH1-5 conté els 5 primers dominis del factor H del ratolí (FH1-5) vinculats a una Ig de ratolí no orientada. L'anti-P-FH1-5 consisteix en mFH1-5 lligat a un anticòs neutralitzant de propedina anti-ratolí de ratolí (anti-P; vegeu Miwa et al.30). Les proteïnes de control incloïen una Ig de ratolí no orientada a isotips (control d'IgG) i l'anticòs neutralitzant de la properdina anti-ratolí (Anti-P). Figura S2. Anàlisi de taca WES per detectar FH1-5 en mostres de plasma de ratolins amb deficiència de FH injectats amb (A) IgG-FH1-5 o (B) Anti-P-FH1-5. El 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5) es pot detectar fins a 11 dies després de la injecció d'IgG-FH1-5 i fins a 4 dies després de la injecció de proteïna anti-P-FH{1-5 (caixes vermelles ).Els controls inclouen plasma de ratolins de tipus salvatge on es detecta la proteïna del factor H de longitud completa (FH, caixes negres, carril C1) i ratolins amb deficiència de FH no injectats, on no hi ha FH evident (caixes negres, carril C2). Com era d'esperar, ni FHnorFH1-5 es detecten en mostres de plasma de ratolins injectats amb control Anti-P o IgG.

Figura S3. Immunotinció del complement glomerular 96 hores després de la injecció de control d'IgG o anti-P-FH1-5 en ratolins de tipus salvatge. Es mostren imatges glomerulars representatives (barra ¼ 100 mm).

Figura S4. El paper de la properdina en la deposició d'anti-P-FH1-5 en glomèruls de ratolins amb deficiència de FH. Els ratolins Cfh–/– es van injectar amb control d'IgG o anti-P (tractament 1) seguits 24-hores més tard per control d'IgG o anti-P-FH1-5 (tractament 2). Els animals van ser sacrificats 120 hores després del primer tractament i es va avaluar la tinció glomerular d'IgG, properdina i FH/FHR. Es mostren imatges representatives. La injecció d'anti-P va reduir notablement la tinció de properdina (fila 1, columna 2), però no la tinció de FH/FHR (es manté sense canvis) o IgG (està absent). L'administració d'anti-P-FH1-5 24-hores després del control d'IgG va donar lloc a l'aparició d'una tinció granular amb anticossos anti-IgG, anti-FH/FHR i anti-P tal com es va observar després de la injecció d'anti-P-FH 1-5 sol (vegeu la figura 3b). Aquesta tinció granular es va reduir quan la injecció anti-P-FH1-5 va ser precedida per una injecció anti-P, que esgota tant la circulació (vegeu la figura 1h) com la glomerular (vegeu la figura 3b). La tinció glomerular amb anti-IgG només va ser evident en ratolins injectats amb anti-P-FH1-5 (fila 3, columnes 3 i 4) i va ser significativament menor en ratolins que van rebre anti-P-FH1-5 precedit d'anti-P. Vam concloure que la deposició d'anti-P-FH1-5 als glomèruls de ratolins Cfh–/– depenia en part de la properdina. Les barres horitzontals denoten valors mitjans i els bigotis denoten el rang interquartil. El valor P es va derivar de la prova de Mann-Whitney. Barra ¼ 100 mm.

REFERÈNCIES

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Noöl LH, et al C glomerulopathy∶ anew dassification. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripathy: comprensió de la malaltia real rara impulsada pel complement. Nat ReyNephrol.201915129-143

3. Pickering MC, Cook HT.Sèrie de mini-revisió traduccional sobre el factor H del complement: malalties renals associades amb el factor H del complement, nous coneixements sobre humans i animals. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, factor C3nechritic （C3NeF）∶estabilització de la fase fluida i la convertasa de la via alternativa unida a les cèl·lules. J Immunol 1976;116:1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, l'efecte et al d'un factor nefrític sobre C3 i sobre la via terminal del complement in vivo i in vitro. Oin Exp Immunol. 1986;65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. Factor nefrític G3 (C3NeF): dissociació de l'estabilització en fase líquida i lligada a cèl·lules de la via alternativa C3 convertasa. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J, et al L'activació no controlada de C3 provoca glomerulonefritis membranoproliferativa en ratolins amb deficiència en el factor del complement H. Nat Genert.2002:31;424-428.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y, et al. La combinació de la mutació del factor H i la deficiència de properdina provoca una glomerulonefritis C3 severa. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM, et al. La pèrdua de properdina agreuja la glomerulopatia C3 derivada de la deficiència del factor H. J Am Soc Nephrol. 2013;24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, et al. El factor H facilita l'eliminació de l'iC3b unit a GBM controlant l'activació de C3 en la fase fluida. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F, et al El tractament amb el factor H del complement humà reverteix ràpidament la deposició del complement renal en ratolins amb deficiència de factor H. Kidney Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll, et al Factor H humà optimitzat per la glicosilació produït per Moss per a l'aplicació terapèutica en trastorns del complement. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y, et al. Una molècula de factor H de minicomplement estès millora la glomerulopatia C3 experimental. Ronyó Int. 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA, et al. Eficàcia de la inhibició del complement dirigida en la glomerulopatia C3 experimental. J Am Soc Nephrol. 2016;27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR, et al Construcció de factor H del complement dissenyada per al tractament de la glomerulopatia C3. J Am Soc Nephrol. 29;2018:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M, et al. La localització glomerular de C3 indica la formació de dipòsits immunitaris en curs i l'activació del complement en la glomerulonefritis experimental. Sóc J PatholL. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP, et al. Glomerulopatia familiar C3 associada a mutacions CFHRS característiques clíniques de 91 pacients en 16 pedigrís. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP, et al. La patologia i la protecció en la nefritis nefrotòxica està determinada per la participació selectiu de receptors Fc específics. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC, et al. Protecció contra la membrana basal antiglomerular (nefritis mediada per GBM en ratolins amb deficiència de C3-i C{4-. C Exp Immunol. 1997;110:403-409).

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H et al. Comparació de les propietats de reconeixement de superfícies i d'unió a C3b del factor del complement humà i del ratolí H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp roe EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al El desenvolupament de la síndrome urèmica hemolítica típica depèn del complement C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145.

22.Pdkering MC, de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry et al. Síndrome urèmica hemolítica espontània desencadenada pel factor H del complement mancat de dominis de reconeixement superficial. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23 Herbert AP. Mike E, Chen ZAet aL Evasió del complement mediada per la millora del factor H capturat: implicacions per a la protecció de les superfícies pròpies del complement.J Immunol. 2015;195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, et al. La dimerització de proteïnes relacionades amb el factor H del complement modula l'activació del complement amb. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z, et al. Enginyeria racional d'un inhibidor immune minimitzat amb propietats úniques de triple orientació. J Immunol. 2013;190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC, et al. El complex d'atac a la membrana glomerular no és un marcador fiable de l'activació de C5 en curs en la nefritis lúpica. Ronyó Int. 2019.95655-665.

27. Antonioli AH White J, Crawford F, et al. Modulació de la via alternativa del complement per proteïnes relacionades amb el factor H murí. J Immunol. 2018;200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z, et al. La proteïna relacionada amb el factor H murií FHR-B promou l'activació del complement. Front Immunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ et al. La proteïna 5 relacionada amb el factor H del complement glomerular (FHR5) és molt freqüent en la glomerulopatia C3 i s'associa amb una insuficiència renalKdney Int Ren. 2019;4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D, et al. El bloqueig de la properdina, la via alternativa i els receptors d'anafilatoxines milloren la lesió renal d'isquèmia-reperfusió en ratolins amb factor d'acceleració de la decadència i CD59 doble knockout. J Immunol. 2013;190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P, et al Serum properdin consumption as a biomarker of C5 convertas dysregulation in C3 glomerulopathy. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y, et al. La combinació de la mutació del factor H i la deficiència de properdina provoca una glomerulonefritis C3 severa.JAm Soc Nephrol.2013;2453-65.

32. Zhang Y, Nester OM Martin B. et al Definició del perfil del biomarcador del complement de la glomerulopatia C3. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.