Perfil complet de les formulacions de secretoma a partir de cèl·lules mare de líquid amniòtic humà fetal i perinatal, part 1

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Resum:Prèviament, vam informar que les cèl·lules mare derivades del líquid amniòtic de c-KIT més htaman obtingudes a partir de mostres sobrants de diagnòstic prenatal rutinari de Ⅱ trimestre (hAFS fetal) estan dotades d'un potencial paracrí regeneratiu que condueix a efectes de supervivència, antifibròtics i proliferatius. També es poden aïllar de mostres de residus clínics del III trimestre durant les cesàries programades (hAFS perinatal), oferint així una alternativa més fàcilment accessible en comparació amb l'hAFS fetal. No obstant això, es coneix poc sobre el perfil paracrí de l'hAFS perinatal. Aquí oferim una caracterització detallada del secretoma total de hAFS (és a dir, la totalitat dels factors paracrins solubles alliberats per les cèl·lules en el medi condicionat, hAFS-CM) i les vesícules extracel·lulars ( hAFS-EVs) dins d'ella, de cèl·lules perinatals fetals del Ⅱ trimestre versus del III trimestre. L'hAFS fetal i perinatal es va caracteritzar i es va sotmetre a un precondicionament hipòxic per millorar el seu potencial paracrí. Les formulacions hAFS-CM i hAFS-EV es van analitzar pel contingut de proteïnes i quimiocines/citocines, i es va investigar més la càrrega de l'EV mitjançant la seqüenciació d'ARN. El fenotip de l'AFS fetal i perinatal, juntament amb les seves corresponents formulacions de secretomes, es van solapar; tanmateix, l'hAFS fetal va mostrar una activitat de fosforilació oxidativa immadura en comparació amb les perinatals. El perfil de la seva càrrega paracrina va revelar algunes diferències segons l'etapa gestacional i el precondicionament hipòxic. Ambdues fonts cel·lulars van proporcionar formulacions enriquides amb factors neurotròfics, immunomoduladors, antifibròtics i estimulants endotelials, i el secretoma fetal immadur de hAFS es va definir per un perfil pro-vasculogènic, regeneratiu, pro-resolució i anti-envelliment més pronunciat. El perfil d'ARN petit va mostrar un enriquiment de microRNA tant en la càrrega fetal com perinatal de hAFS-EV, amb un nucli pro-resolució expressat de manera estable com a signatura molecular de referència. Aquí confirmem que hAFS representa una font atractiva de factors paracrins regeneratius; La selecció de formulacions de secretomes hAFS fetals o perinatals per a la futura teràpia paracrina s'hauria d'avaluar tenint en compte l'escenari clínic específic.

Paraules clau:líquid amniòtic; cèl·lules mare; efectes paracrins; vesícules extracel·lulars; medi condicionat per cèl·lules; quimiocina; citocines; proteòmica; seqüenciació d'ARN; microRNA

Feu clic aquí per saber-ne més

1. Introducció

La medicina regenerativa s'ha desenvolupat recentment com un camp emergent per proporcionar la restauració funcional del teixit lesionat mitjançant diverses estratègies. A mesura que els enfocaments d'enginyeria de teixits han avançat significativament en els darrers anys, la investigació dels efectes paracrins de les cèl·lules mare s'ha intensificat de manera simultània. S'ha demostrat que el potencial terapèutic de les cèl·lules mare trasplantades està mediat principalment pels seus factors solubles secretats, que poden orquestrar un microambient pro-regeneratiu al teixit hoste alhora que desencadenen l'activació de mecanismes endògens de recuperació funcional [1,2]. Per tant, la cèl·lula mare secreta la totalitat de les molècules tròfiques paracrines alliberades per cèl·lules, així com les vesícules extracel·lulars lligades a la membrana, s'han proposat cada cop més com a medicament terapèutic innovador mitjançant múltiples estudis preclínics independents dirigits a cardiovasculars, neurològics i/o inflamatoris. malaltia. En conseqüència, les cèl·lules mare es poden imaginar com a fàbriques biològiques per a l'explotació del seu secretoma terapèutic oferint tractaments regeneratius preparats per al seu ús i disponibles. Mitjançant l'aplicació d'aquesta estratègia basada en cèl·lules, però sense cèl·lules, es poden superar molts aspectes limitants associats a la teràpia cel·lular canònica, tot garantint efectes beneficiosos.què és un cistancheEn aquesta perspectiva, les cèl·lules estromals mesenquimals (MSC) s'han provat àmpliament com a candidates a cèl·lules putatives? De fet, les MSC i les cèl·lules mare/progenitores han estat dissenyades i/o estimulades per diferents estratègies de precondicionament per millorar la seva capacitat regenerativa i potencial secretor [3,4] amb un interès explícit en la rellevància biològica de les seves vesícules extracel·lulars (EVs) secretades.

Els EV són partícules de mida nanomètrica delimitades per una bicapa lipídica i secretades activament per tots els tipus de cèl·lules. Els vehicles elèctrics inclouen molt petits (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); operen com a transportadors biològics crítics de senyalització intercel·lular lliurant la seva càrrega molecular des d'una cèl·lula parental a una de resposta/objectiu [5,6]. Atès que el seu peculiar potencial paracrí per exercir efectes beneficiosos és comparable a les seves cèl·lules d'origen, els EV de cèl·lules mare han sorgit com a opcions terapèutiques atractives en models preclínics de malalties, com ara isquèmia, inflamació o lesions, tal com s'ha revisat àmpliament a [{{3]. }}]. Des d'una perspectiva translacional, a més del potencial modulador cel·lular, la viabilitat d'aïllament i l'elevada autorenovació són aspectes clau de la font ideal d'EVs terapèutics i factors solubles. En aquest escenari, el MSC fetal i perinatal pot oferir una opció interessant donat el seu potencial proliferatiu i el seu perfil immadur en el desenvolupament amb característiques intermèdies entre els progenitors somàtics embrionaris i adults [10,11]. El MSC fetal es pot aïllar dels annexos extraembrionaris durant la gestació com a mostreig sobrant obtingut durant el cribratge prenatal (és a dir, les vellositats coriòniques [12-14] i el líquid amniòtic [15,16]) o obtinguts com a progenitors perinatals en néixer, a partir de material de rebuig clínic (és a dir, membranes amniòtiques i placentàries [17-21], components del cordó umbilical [22-24] i terme líquid amniòtic [25,26]).

Cistanche pot anti-envelliment

En particular, les cèl·lules mare del líquid amniòtic humà (hAFS) s'han destacat com a estratègies terapèutiques prometedores en medicina regenerativa. i s'ha demostrat que són àmpliament multipotents in vitro i in vivo [16,27,28], contribueixen al llinatge hematopoètic després del trasplantament in utero [29] i s'empelten en òrgans lesionats mentre exerceixen efectes immunomoduladors [26,30] i s'activen. respostes reparadores endògenes, tal com es descriu de manera exhaustiva a [31]. El nostre equip i altres han demostrat encara més que hAFS allibera un secretoma altament enriquit amb molècules tròfiques bioactives capaços d'orientar-se a diferents mecanismes reparadors. S'ha informat que els factors paracrins d'hAFS proporcionen estímuls favorables a la supervivència amb l'extinció de la inflamació [32], proporcionen cardioprotecció contra la isquèmia prolongada [33.34] i la cardiotoxicitat [35] i estimulen l'angiogènesi local amb la reentrada del cicle cel·lular dels cardiomiòcits. 34,36]. Com que s'ha demostrat que la majoria d'aquests efectes es recapitulen només amb l'administració d'hAFS-EV, els estudis independents s'han centrat a disseccionar el seu perfil regeneratiu amb diferents antecedents patològics, incloent lesions musculars esquelètica i cardíaca, malaltia renal, osteoartritis, osteoporosi, enterocolitis necrotitzant i neurodegeneratives. models [34,37-44].

Tot i que l'evidència pot donar suport a la traducció clínica dels hAFS-EV per a la teràpia paracrina futura, és important tenir en compte que la majoria d'aquests estudis han investigat principalment el potencial modulador de l'hAFS fetal obtingut durant el cribratge prenatal del Ⅱ trimestre. De fet, un perfil complet del secretoma de la contrapartida perinatal (és a dir, a partir de les cesàries del III trimestre) encara no s'ha explorat amb detall. Els hAFS perinatals del tercer trimestre han mostrat propietats reguladores immunes distintives en comparació amb els trimestres me i II [26], tot mantenint un potencial regeneratiu endotelial rellevant [25].quant cistanche prendreCal destacar que l'informe recent sobre la morfologia heterogènia de l'hAFS fetal[45] ha proporcionat noves idees sobre la seva base i el seu perfil d'expressió gènica.bioflavonoidesAixò ha aportat una nova llum sobre el valor regeneratiu de les diferents fraccions cel·lulars de hAFS[46]. Per tant, la caracterització integral de les diferents subpoblacions de hAFS està cridant cada cop més l'atenció. Abans vam informar que una estimulació hipòxica i sense sèrum de 24 hores representa una estratègia eficaç per augmentar el potencial paracrí de l'hAFS fetal del Ⅱ trimestre [34,35,37]. Com que se sap poc sobre la composició del secretoma de l'hAFS del III trimestre, aquí informem de la comparació completa de l'hAFS Ⅱ versus el Ⅲ del trimestre i les seves fraccions de secretoma (inclosos els barrets-EV), per tal d'abordar la influència de l'etapa gestacional i la cèl·lula hipòxica. precondicionament de les característiques cel·lulars i secretomes.

2. Resultats

2.1.HAFS perinatal Presenta una coincidència fenotípica propera amb la fetal

No es va apreciar cap diferència estadísticament rellevant en l'edat del donant entre les mostres de líquid amniòtic fetal I trimestre i perinatal III trimestre. Fetal c-KIT* hAFS (f-hAFS de mostres de líquid amniòtic del II trimestre) i c-KIT* hAFS perinatal (p-hAFS de residus clínics de líquid amniòtic del III trimestre) van confirmar característiques similars amb morfologia semblant a fibroblast i ovalada (figura). 1A) i fenotip estromal mesenquimal (dades no mostrades), tal com es va informar anteriorment [16, 25]. Tant f-hAFS com p-hAFS cultivats in vitro fins al pas 5 van mostrar nivells insignificants de senescència a partir de l'activació de la- -galactosidasa (SA- -Gal) associada a la senescència en aproximadament el 4% de les cèl·lules (figura 1B) . Tant f-hAFS com p-hAFS van presentar un alt nivell de coexpressió dels marcadors mesenquimàtics CD107a i CD146, que s'ha informat recentment que defineixen un fenotip altament secretor [47]. Les cèl·lules CD107at CD146* representaven la majoria de la població f-hAFS (aproximadament el 64 per cent,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Figura 1. Avaluació fenotípica fetal i perinatal. (A) Imatges representatives de hAFS fetal (f-hAFS, panell esquerre) i hAFS perinatal (p-hAFS, panell dret) cultivades in vitro en condicions estàndard; barra d'escala: 200 um. (B) Anàlisi del marcador senescent beta-galactosidasa (SA- -Gal, en blau) mitjançant tinció de citoquímica en f-hAFS i p-hAFS després de 5 passatges en cultiu; imatges representatives es mostren al tauler esquerre, barra d'escala: 200 um. El percentatge corresponent de cel·les/camp positius -Gal es mostra al gràfic del panell dret (f-hAFS: 4,12±0,58 per cent i p-hAFS: 3,88±2,10 per cent; p=0.1424,n{ {24}} experiments). (C) Immunofenotip de hAFS que expressa marcadors mesenquimals CD146 i CD107a. Gràfics de citometria de flux representatius de f-hAFS i p-hAFS (tauler esquerre) i els valors corresponents referits a les cèl·lules CD107a més CD146 més doble positives; CD107a més CD146* f-hAFS: 63,68 ± 5,82 per cent, * p=0,016 en comparació amb el 36,32 ± 5,82 per cent restants f-hAFS (Altres); CD107at CD146 més p-hAFS: 52,07 ± 6,76 per cent amb la resta 93 ± 56,76 per cent de p-hAFS (Altres); CD107a més CD146 més f-hAFS vs CD107a més CD146 més p-hAFS p=0.2403,n=4 experiments. Altres: quantitat total de CD107a-CD146~hAFS restants, CD107a~CD146*hAFS i CD107a CD146-hAFS. Tots els valors s'expressen com a mitjana ± sem d'experiments independents. SA- -Gal:- -galactosidasa associada a la senescència.

2.2. L'AFS fetal mostra un metabolisme diferent de l'AFS perinatal

Per avaluar si l'etapa gestacional pot influir en el metabolisme mitocondrial, es van analitzar f-hAFS i p-hAFS en condicions estàndard de cultiu in vitro mitjançant anàlisis bioquímiques. L'avaluació del metabolisme aeròbic va mostrar que la taxa de consum d'oxigen (OCR) i la síntesi d'ATP eren més baixes en f-hAFS respecte a p-hAFS, ambdues quan s'estimulaven amb piruvat més malat (P/M;***p).<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. El precondicionament hipòxic no afecta la viabilitat fetal i perinatal i manté la seva activitat secretora

Per tal de definir les formulacions de secretomes hAFS, les cèl·lules es van cultivar en condicions sense sèrum per evitar qualsevol contaminació per FBS. Prèviament vam demostrar que les condicions de cultiu hipòxic de 24 h sense sèrum (SF) i 1 per cent d'O2 no van alterar significativament la viabilitat de l'hAFS fetal de Ⅱ trimestre (f-esperança), mentre que van donar suport a l'alliberament de factors paracrins regeneratius en el seu medi condicionat per cèl·lules. (hAFS-CM) i en vesícules extracel·lulars (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Aquí, a més de perfilar les fraccions del secretoma p-hAFS per primera vegada, vam avaluar si p-ha presentat un comportament similar sota el mateix règim de precondicionament, utilitzant la condició de cultiu normòxic com a control. La viabilitat de f-hAFS i p-hAFS es va analitzar després de 24 h en els següents paràmetres: condició normòxica (20 per cent d'O2) en medi de cultiu de control complet (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo i Ctrl p-hAFSnormo), una condició normoxica en medi SF (SF f-hAFSnormo i SF p-hAFSnormo), condició hipòxica (1 per cent O2) en un medi de control complet (Ctrlf-té hipo i Ctrl p-hAFSnypo) i condició hipòxica en medi SF (SF f-té hipo i SF p -té hipo, figura 3A). Vam confirmar que la viabilitat de f-ha no es va alterar tant en condicions Ctrl com SF i sota estimulació hipòxica, amb més del 80 per cent (fins a gairebé el 88 per cent) del total de cèl·lules no afectades. Les cèl·lules apoptòtiques primerenques i tardanes oscil·laven entre ca. Del 13 al 18 per cent en condicions de SF, sense cap rellevància estadísticament significativa. De la mateixa manera, la viabilitat perinatal estava en el rang del 80-92 per cent, i les cèl·lules apoptòtiques primerenques i tardanes representaven fins a un 18 per cent en condicions de SF. p-hAFS només es va influir marginalment en les condicions hipòxiques i SF combinades; de fet, mentre que el precondicionament no va influir en la supervivència cel·lular quan es van cultivar p-hAFS en un medi complet, la condició SF corresponent va mostrar un augment de ca. 4-plega (* pàg<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Figura 2. Caracterització metabòlica de l'AFS fetal i perinatal. (A) Taxa de consum d'oxigen (OCR), síntesi d'ATP mitjançant F1-F.ATP sintasa i relació P/O en f-have i-have en presència de piruvat més malat (P/M) o succinat (Succ);***p=0,0005,**p{=0,0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustràliaLa comparació del percentatge d'inhibició de la síntesi d'OCR i d'ATP en f-i-hAFS a causa dels inhibidors indicats anteriorment s'informa al panell inferior B. Per als experiments d'OCR: hAFS més Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

A continuació, es va avaluar el rendiment de fraccions de secretoma obtingudes a partir de f-hAFS versus p-hAFS en funció de l'enriquiment de proteïnes. El total té secretoma, ja que la totalitat dels factors paracrins secretats per les cèl·lules, aquí està representada pel hAFS-CM. La concentració de proteïnes de f-hAFS-CM i p-hAFS-CM al medi SF després del precondicionament de cèl·lules hipòxiques versus la condició normòxica de control com a línia inicial (és a dir, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo i p -hAFS-CMHypo,) es va avaluar mitjançant un assaig de BCA i es va mesurar segons les cèl·lules 10§.cistanchEls resultats obtinguts van suggerir que f-has-CM i p-hAFS-CM van mostrar una tendència positiva igual en l'enriquiment de proteïnes després de l'encebació hipòxica (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 cèl·lules de grau;p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/1{0 graus de cèl·lules) sobre les seves homòlegs normòxics (f-hAFS-CMnormo:105,50±19,89 ug/10 graus de cèl·lules; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 graus de cèl·lules). De la mateixa manera, la concentració de proteïnes superficials de hAFS-EVs es va mesurar en f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo i p-hAFS-EVShypo Els EV van mostrar un rendiment comparable quan es van obtenir a partir de f-hAFS o p-hAFS. Pel que fa a les formulacions hAFS-CM, es va apreciar una tendència positiva en l'augment del contingut de proteïnes en f-hAFS-EV i p-hAFS. Els EV es van apreciar després de l'estimulació hipòxica durant el període condició normòxica corresponent (f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 graus de cèl·lules i p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 graus de cèl·lules; f-have-EVsnormo∶1,28±0,36 ug/10,36 ug cèl·lules -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 graus de cèl·lules, figura 3C).

2.4. EVs d'alliberament de hAFS fetal i perinatal amb morfologia i distribució de mida anàlogues

L'anàlisi morfològica mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM) va augmentar l'elevada proliferació d'EV-secretor tant de f-hAFS com de p-hAFS (figura 4). Es va investigar més la mida i l'àrea dels f-hAFS-EVs i p-hAFS-EVs (Figura 4B) després del precondicionament hipòxic en comparació amb la línia de base normòxica. Fetals i perinatals han alliberat EV de mida heterogènia, en el rang de 40-250 nm, per tant, inclouen tant exosomes/EV petits com microvesícules/vesícules vessals. La mida mitjana dels EV/camp en els diferents grups era comparable, els hAFS-EV fetals mesuraven 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo: 104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97,10±10,10 nm) i perinatals mesurats 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94,60±19,53 nm; p-hAFS-EVShypo:76,43±4.86 nm, Figura 4B, panell esquerre). Pel que fa al rendiment, l'hAFS estimulat sota hipòxia va mostrar una tendència positiva en l'augment de la quantitat de petits EV, tot i que aquest augment no va ser estadísticament significatiu. f-hAFS-EVStypo va mesurar 40-70 nm, que era gairebé el doble que en comparació amb el seu homòleg normòxic. Perinatal-has-EVSHypo que mesurava 40-70 nm, {70-100 nm i 100-130 nm eren gairebé el triple de les obtingudes en cultiu normòxic (figura 4B).

L'anàlisi de seguiment de nanopartícules (NTA) va mostrar un nombre elevat de partícules tant en preparacions f-hAFS-EV com p-hAFS-EV i va confirmar l'augment d'EV a les mostres hipòxiques, tal com també s'ha observat a partir de les anàlisis anteriors (f-hAFS-). EVsnormo: 182±0,1{0'partícules/10 grau de cèl·lules; f-have-EVshypo: 3,30±0,22×10 graus de partícules/10 graus de cèl·lules ;p-hAFS-EVsnormo: 2,43 ± 0,80 × 10 graus de partícules/10 graus de cèl·lules; p-hAFS-EVshypo: 3,05 ± 0,62 × 10 graus de partícules/10 graus de cèl·lules, figura 4C).

Figura 4. Caracterització morfològica dels have-EV fetals i perinatals. ( A ) Imatges representatives de la microscòpia electrònica de transmissió (TEM) de f-hAFS i p-hAFS (panel superior i inferior esquerre, respectivament, amb fletxes negres que indiquen cossos multivesiculars intracitoplasmàtics amb petits EVs / exosomes) i de f -hAFS-EV i p-hAFS-EV (tauler superior i inferior dret, respectivament) alliberats en condicions sense sèrum i sota condicionament normoxic versus hipòxic (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; i f-hAFS-EVshypo, respectivament), barres d'escala: 200 nm. (B) Panell esquerre: anàlisi TEM de la distribució de la mida dels hAFS-EVs; panell dret: es va considerar la distribució del nombre f-hAFS-EVs i p-hAFS-EVs per intervals de mida de camp des de 40 nm fins a 250 nm; els valors s'expressen com a mitjana±sem de n=3 experiments independents. (C) Anàlisi de seguiment de nanopartícules per a la mida i la distribució de hAFS. Panell esquerre: imatge representativa de la sortida gràfica; panell dret: concentració de hAFS-EV mesurada com a partícules de 10 graus per cèl·lules secretores de 10 graus; nm: nanòmetre; ml: mil·lilitre.

2.5.Caracterització proteòmica de l'hAFS fetal versus perinatal destaca les diferències en la seva composició del secretoma segons l'edat gestacional i el precondicionament hipòxic

La caracterització proteòmica de les formulacions de secretomes f-hAFS i p-hAFS es va realitzar mitjançant una plataforma lliure d'etiquetes d'escopeta, basada en l'acoblament de nanocromatografia líquida i espectrometria de masses d'alta resolució (nLC-HRMS). Es van adquirir quaranta-vuit perfils proteòmics mitjançant l'anàlisi duplicada de tres rèpliques biològiques d'hAFS-CM i have-EVs de f-hAFS i p-hAFS sotmeses a un precondicionament de cèl·lules hipòxiques en comparació amb la condició normòxica com a control. Es van identificar un total de 4179 grups de proteïnes diferents amb almenys un pèptid únic i amb pesos moleculars que oscil·laven entre 2 i 3900 kDa i punts isoelèctrics de 3,6 a 13. Es va observar una expressió proteica mitjana més alta en els hAFS-EVs en comparació amb hAFS-CM. . L'alineació de totes les llistes de proteïnes obtingudes es va dur a terme a partir de les proteïnes identificades. Per a cada condició experimental, es va crear una llista única normalitzant i fent una mitjana[50] dels valors de concordança de l'espectre de pèptids (PSM) atribuïts a les proteïnes, que representen el nombre d'espectres de masses assignats a cadascuna i representen indirectament la seva abundància a les mostres. La llista completa de proteïnes identificades a les formulacions hAFS-CM i have-EV es mostra a la taula S1.

L'aplicació de l'anàlisi discriminant lineal (LDA[51]) en aquesta llista mestra va permetre l'extracció de proteïnes estadísticament significatives (Fratio Major o igual a 4,5 i** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 en formulacions hAFS-CM i have-EV considerades per separat. Mentre que al voltant del 69,5% i el 69,9% de les proteïnes es van compartir entre les condicions hAFS-EV i hAFS-CM respectivament, el contingut restant va aparèixer exclusiu en diferents proporcions, que van del 3,7% al 13,4%, entre les formulacions.

Per examinar quantitativament els canvis proteòmics, es va realitzar una anàlisi diferencial sense etiquetes utilitzant el programari MAProMa fet a casa i aplicant dos algorismes, DAve (mitjana diferencial) i DCI (índex de confiança diferencial, que representa la relació i la confiança en l'expressió diferencial). respectivament), sobre els PSM de cada proteïna entre els dos termes comparats. Utilitzant filtres estrictes per a DAve i DCI per maximitzar la confiança de la identificació i tenir en compte les proteïnes amb una variació superior a un canvi de plec d'1,5, comparacions per parelles de f-hAFS-CM versus p-hAFS-CM i de f-hAFS-EVs versus Els p-hAFS-EV es van fer segons l'etapa de gestació cel·lular. Es van trobar un total de 58 i 109 proteïnes expressades de manera diferent als compartiments has-CM i have-EV anteriors, respectivament (figura S1B, C per als detalls seleccionats i taules S2-S3 en forma estesa). Entre aquestes, 30 proteïnes van resultar regulades a l'alça en f-hAFS-CM i 28 van ser regulades a l'alça en p-hAFS-CM (figura S1B); de la mateixa manera, 44 proteïnes diferents van donar lloc a una regulació positiva en f-have-EV i 65 es van regular a l'alça en p-hAFS-EV (figura S1C). En particular, les proteïnes que van donar lloc a una regulació a l'alça en f-have s'han de considerar regulades a la baixa en p-has i viceversa.

es reporten els valors; vegeu la taula S2 per obtenir la llista completa i els paràmetres detallats de les proteïnes informades. (C) Anàlisi d'enriquiment de processos biològics de proteïnes identificades amb una freqüència d'almenys 2 en hAFS-CM fetal (tauler esquerre) i have-CM perinatal (plafó dret) segons el precondicionament hipòxic cel·lular. A partir de l'eina FunRich, els termes d'ontologia genètica es mostren en gràfics de barres que informen del percentatge de gens enriquits per a cada categoria (barres roses per a-have-CMnormo, barres morades per a f-hAFS-CMhypor barres blaves clares per a p-hAFS-CMnormo, i boles blaves per a p-hAFS-CMhypo).comprar cistancheNomés els termes d'ontologia gènica amb Bonferroni corregits amb *p<0.05 are="">

Aquest article està extret de Int. J. Mol. Ciència. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms