Detecció i caracterització de nanopartícules mineralo-orgàniques en ronyons humans
Feb 22, 2022
Tsui-Yin Wong1,2,*, Cheng-Yeu Wu1,2,3,* et al
La calcificació ectòpica s'associa amb diverses malalties humanes, com ara l'aterosclerosi, el càncer,crònicaronyómalaltia, idiabetismellitus. Tot i que s'han detectat nanopartícules minerals als vasos sanguinis calcificats, la naturalesa i el paper d'aquestes partícules en el cos humà encara no estan clars. Aquí mostrem per primera vegada aquest humàronyóteixits obtinguts a partir de la fase finalcrònicaronyómalaltiao els pacients amb càncer renal contenen partícules minerals rodones i multilamel·lars de 50 a 1.500 nm, mentre que no s'observen partícules en controls sans. Les partícules minerals es troben principalment a la matriu extracel·lular que envolta els túbuls contornejats, recol·lectant conductes i bucles de Henle, així com dins del citoplasma de les cèl·lules que delimiten els túbuls, i consisteixen en fosfat de calci policristalí similar al mineral que es troba en els ossos i les calcificacions ectòpiques. ElronyóLes nanopartícules minerals contenen diverses proteïnes sèriques que inhibeixen la calcificació ectòpica en els fluids corporals, incloses l'albúmina, la fetuïna-A i l'apolipoproteïna A1. Atès que les nanopartícules minerals-orgàniques es troben no només dins dels dipòsits calcificats, sinó també en zones desproveïdes de calcificacions microscòpiques, les nostres observacions indiquen que les nanopartícules poden representar precursors de la calcificació i les pedres renals en humans.
Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
La calcificació ectòpica s'associa amb l'aterosclerosi, el càncer,crònicaronyómalaltiai diabetis mellitus 1-3. Estudis recents indiquen que l'aterosclerosi icrònicaronyómalaltiaels pacients amb signes de calcificació vascular presenten un augment dels riscos de morbiditat i mortalitat, cosa que suggereix que la calcificació ectòpica és perjudicial per a la salut humana1,3. La calcificació no desitjada també s'observa en persones envellides i la majoria de les persones majors de 60 anys mostren signes de calcificació vascular4. Per aquests motius, desxifrar els factors que indueixen la calcificació ectòpica i desenvolupar un tractament eficaç representen objectius importants.
La calcificació ectòpica es pot definir com un desequilibri entre els inhibidors i els inductors de la calcificació al cos. Els inhibidors de la calcificació inclouen proteïnes sèriques com l'albúmina, la fetuïna-A, l'osteopontina i la proteïna GLA de la matriu, així com petits compostos com el pirofosfat, mentre que la hiperfosfatèmia i la inflamació representen els principals inductors de la calcificació5–7. Estudis recents indiquen que els inductors de calcificació activen un procés cel·lular similar a la formació òssia durant la calcificació vascular7,8. També s'han detectat vesícules de matriu similars a les que indueixen la mineralització en els ossos en desenvolupament en els teixits tous calcificats7–9. Aquestes vesícules de la matriu són probablement alliberades per cèl·lules musculars llises vasculars que es diferencien en cèl·lules semblants als osteoblasts, que indueixen la calcificació7.
S'han detectat nanopartícules minerals (NP) en teixits tous que mostren signes de calcificació ectòpica. Preu et al. va trobar que el sèrum de rates tractades amb etidronat de bisfosfonat o amb vitamina D albergava complexos de proteïnes-minerals que contenen els inhibidors de la calcificació fetuïna-A i la proteïna GLA de la matriu10,11. De la mateixa manera, Jahnen-Dechent et al. van observar que els complexos minerals que contenen fetuïna A, que es van anomenar partícules de calciproteïna (CPP), es podien detectar en el líquid ascític de pacients amb peritonitis calcificant12. Un estudi recent de Bertazzo et al. van demostrar la presència de NP minerals a les vàlvules aòrtiques i les artèries coronàries tant de pacients amb febre ateroscleròtica com reumàtica13. Tot i que els estudis sobre la formació de partícules minerals s'han centrat normalment en el sistema cardiovascular humà, encara no està clar si les partícules es poden trobar en altres teixits i si aquestes entitats tenen un paper en la salut o la malaltia.
Hem observat anteriorment que els NPS minerals orgànics es formen espontàniament en els líquids corporals humans i animals14–28. Aquests NP minerals es van descriure inicialment com a nanobacteris (NB) i es creia que no només eren les cèl·lules més petites de la terra29, sinó també una possible causa transmissible de nombroses malalties, com ara la malaltia d'Alzheimer, l'aterosclerosi, el càncer,ronyópedraformació, poliquísticaronyómalaltiai prostatitis30-32. Tanmateix, els nostres resultats han demostrat que NB són de fet NPs minerals no vius que imiten bacteris comuns pel que fa a la seva morfologia, creixement, proliferació i subcultiu15,18,22. Queda per examinar la possibilitat que les partícules minerals semblants a l'anomenat NB es puguin trobar en teixits humans i si aquestes partícules tenen un paper en la malaltia.
En el present estudi, hem desenvolupat un enfocament de nanomaterials per detectar i analitzar NPs minerals orgànics en humans malalts.ronyóteixits. Mostrem que els teixits renals de pacients amb malaltia renal crònica terminal i càncer renal contenen NPs minerals multilamel·lars similars a les partícules minerals biomimètiques que precipiten espontàniament en fluids corporals in vitro. Els nostres resultats revelen coneixements crítics sobre la composició bioquímica, el mecanisme de formació i la funció biològica d'aquests minerals-partícules orgàniques i aporten llum sobre els mecanismes de calcificació ectòpica i l'inici de la malaltia al cos humà.
Resultats
Hem examinat teixits renals extrets quirúrgicament de pacients humans amb malaltia renal crònica terminal (n=2) o càncer renal (n=18; vegeu la taula 1; per a mostres de càncer renal, ens vam centrar en els -part cancerosa del teixit). Com a controls sans, es van estudiar biòpsies renals obtingudes de pacients amb traumatisme o hematoma però que no tenien una funció renal anormal prèvia (n=2; Taula 1).
Els teixits renals d'individus sans mostraven característiques histològiques normals i no es va observar cap calcificació ectòpica després de la tinció de von Kossa (Fig. 1A, B). D'altra banda, els teixits renals obtinguts d'individus malalts i tenyits amb hematoxilina i eosina (H&E) van mostrar evidències de dany tissular (Fig. 2A-C, indicat per fletxes) i el 80% dels teixits malalts examinats mostraven dipòsits mineralitzats, tal com es va revelar. per tinció de von Kossa (Fig. 1C–T, Fig. 2E,F, la calcificació és visible com a material negre indicat per fletxes negres; vegeu també la taula 1). Es van observar dipòsits calcificats a l'escorça i la medul·la, inclòs l'espai extracel·lular que envolta els túbuls contorneats distals, els túbuls contorneats proximals, els conductes col·lectors i els bucles de Henle, així com el citoplasma de les cèl·lules que delimiten els túbuls i els conductes (Fig. 1C-T i Fig. . 2E, F). No es va detectar cap calcificació al corpuscle renal (Fig. 2D).
Per examinar la naturalesa dels precipitats minerals, vam preparar seccions de ronyó ultra fines per a l'observació mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM). En exemplars que contenien dipòsits minerals microscòpics, es van detectar partícules o grànuls minerals al citoplasma de les cèl·lules epitelials renals, a la matriu extracel·lular sota la membrana basal i dins del lumen dels túbuls contornejats proximal i distal (Fig. 3A, B, les partícules s'amplien). als panells A1–A4 i B1–B4). També es van observar NPs minerals dins de les cèl·lules que revesteixen els bucles de Henle i els conductes de recollida (Fig. 3C, D, ampliada als panells C1, C2 i D1). Algunes partícules es van trobar dins de vesícules intracel·lulars a les cèl·lules renals (Fig. 3A, panells A1 i A2). L'enfocament de microscòpia electrònica utilitzat aquí també ens va permetre visualitzar l'interior de les partícules minerals; algunes partícules albergaven anells densos d'electrons que s'alternaven amb capes lleugeres i translúcides d'electrons (Fig. 3A, panells A3 i A4, Fig. 3C, panell C1). Diversos vasos sanguinis, com els vasos rectals (les artèries rectes del ronyó), estem envoltats d'un gran nombre de NPs minerals (Fig. 3D, panell D1). Així, es van trobar NP minerals en diversos llocs de tots els teixits renals humans que mostraven signes de calcificació ectòpica, mentre que no es van trobar partícules als controls sans examinats.
Les partícules minerals que es troben als teixits renals semblen ser molt semblants als NP mineralo-orgànics descrits que es formen espontàniament en fluids corporals en els nostres estudis anteriors15,17 (i que hem anomenat bions24). Per verificar aquesta possibilitat, vam preparar NP (o bions) orgànics minerals mitjançant un mètode de precipitació tal com hem descrit anteriorment15. Aquest mètode consisteix a afegir ions precipitants com el calci i el fosfat a un medi de cultiu cel·lular (medi d'àguila modificat de Dulbecco o DMEM) que conté un fluid corporal com un sèrum humà (HS), seguit d'una incubació en condicions de cultiu cel·lular (vegeu Mètodes). Les partícules produïdes d'aquesta manera (HS-NPS) eren esfèriques o el·lipsoides i mostraven una superfície mineral llisa o cristal·lina (Fig. 4A-E), similar a les partícules descrites anteriorment en els fluids corporals22,23 així com en l'ascite humana12 i artèries calcificades13. Les partícules minerals eren molt similars als minerals NPs o grànuls observats en els teixits renals pel que fa a la seva morfologia general, estructura multicapa i característiques superficials (Fig. 4F-J). La mida de les partícules derivades de HS i els grànuls de ronyó també eren comparables, variant entre 50 i 1.500 nm de diàmetre (Fig. 4A-E, F-J). Com s'ha indicat anteriorment, alguns grànuls de ronyó estaven envoltats per una membrana lipídica, possiblement representant vesícules de càrrega intracel·lular o vesícules de membrana extracel·lular (Fig. 4H, I, les membranes es denoten amb fletxes); aquestes estructures membranoses estaven absents en els exemplars de HS-NP preparats in vitro (Fig. 4A-E). Aquestes observacions suggereixen que els grànuls renals són similars als NP mineralo-orgànics reunits al sèrum.
Utilitzant l'anàlisi de difracció d'electrons de l'àrea seleccionada, vam observar que la fase mineral dels HS-NPs preparats in vitro consistia en un nanomaterial policristalí (Fig. 4E, requadre; observeu els febles anells concèntrics). Es van obtenir resultats similars per a grànuls renals (Fig. 4J, requadre) i per a ossos i calcificacions ectòpiques tal com es descriu en estudis anteriors33,35.
Hem estudiat la composició química dels HS-NP i els grànuls renals mitjançant l'espectroscòpia de raigs X amb dispersió d'energia (EDX). Els HS-NP van mostrar pics importants de carboni (C), calci (Ca), oxigen (O) i fòsfor (P) (Fig. 4K), d'acord amb la presència d'un mineral de fosfat de calci. També es va observar un pic baix de silici (Si) en HS-NPs (Fig. 4K), possiblement representant un constituent de partícules menors. Els grànuls de ronyó també van mostrar pics de carboni, calci, oxigen i fòsfor, indicatius d'un mineral de fosfat de calci, juntament amb pics addicionals de silici i ferro (Fe) (Fig. 4L). Els pics d'urani (U) es van atribuir a l'acetat d'urani utilitzat com a reactiu de contrast durant la preparació de la mostra (la presència d'urani en algunes mostres de partícules minerals com els grànuls de ronyó i la seva absència en el teixit de control de la figura 4M es pot atribuir a l'alt nivell d'urani). afinitat de l'urani pel fosfat, tal com es va informar anteriorment35). Els espectres de control EDX del teixit renal que envoltaven les partícules van mostrar pics de carboni i oxigen (Fig. 4M), cosa que suggereix que el calci i el fòsfor es van trobar principalment a les partícules minerals.
Les proporcions de calci: fòsfor (Ca:P) de HS-NP i grànuls de ronyó van variar de 0,65 a 1,18. Aquestes proporcions difereixen del valor teòric d'1,67 observat per a la hidroxiapatita estequiomètrica, però encara es troben dins del rang vist anteriorment per als cristalls de fosfat de calci i apatita observats a diversos graus de cristal·lització15. En conjunt, aquestes troballes confirmen que els grànuls del ronyó consisteixen en NPs de fosfat de calci.
S'ha trobat que diverses proteïnes inhibeixen la calcificació ectòpica de manera sistèmica al cos36,37. A més, es creu que la corona proteica que es troba a la superfície dels NPs sintètics determina la biodistribució i els efectes de les partícules a les cèl·lules in vivo38,39. D'altra banda, la composició de proteïnes dels NP mineralo-orgànics que es troben en els teixits renals humans encara no s'entén del tot. Hem trobat anteriorment que l'albúmina, la fetuïna-A i l'apolipoproteïna-A1 (apo-A1) representen les principals proteïnes que interaccionen amb els NP mineralo-orgànics formats en els fluids corporals17,20. Aquí hem utilitzat l'etiquetatge d'immunogold per examinar la presència i la ubicació ultraestructural d'aquestes proteïnes dins dels grànuls renals.
Hem utilitzat anticossos policlonals contra l'albúmina sèrica humana (HSA), la fetuïna sèrica humana A (HSF), l'apo-1A humana i l'HS sencer per examinar la presència de proteïnes sèriques en HS-NP i grànuls renals. L'especificitat dels anticossos policlonals (preparats com s'ha descrit anteriorment25) es va verificar mitjançant Western blotting (Fig. 5). Cadascun dels anticossos policlonals va reaccionar positivament amb els HS-NP preparats in vitro així com amb els grànuls minerals trobats en els teixits renals humans (Fig. 6A, B, panells A1-A3 i B1-B3; punts negres). Els anticossos van reaccionar principalment amb les capes denses en electrons o el nucli fosc dels HS-NP i els grànuls renals (Fig. 6A, B), cosa que indica que aquestes zones fosques poden contenir nivells més alts de proteïnes en comparació amb les zones amb llum electrònica. Els controls negatius realitzats sense anticossos primaris no van produir cap reacció (Fig. 6A, B, panells A4 i B4, control). Vam concloure que els grànuls de ronyó representen NPs mineralo-orgàniques similars als HS-NP basats no només en la seva morfologia i composició mineral, sinó també en la seva unió als principals inhibidors de la calcificació presents al sèrum.
A continuació, es va utilitzar la microscòpia d'immunofluorescència per confirmar la presència de grànuls minerals que contenien HSA i HSF en ronyons humans malalts. Utilitzant aquesta tècnica, es van mostrar teixits renals humans
tinció positiva per a les dues proteïnes en diverses àrees, inclòs l'interstici que envolta els túbuls renals, així com el citoplasma de les cèl·lules que delimiten els túbuls (Fig. 7A, panells A1 i A2). Els agregats de proteïnes que contenien tant albúmina com fetuïna-A també es van observar en aquestes àrees, encara que en quantitats més baixes en comparació amb la tinció de les proteïnes individuals (Fig. 7A i panell A3, tinció combinada en groc). En particular, vam notar que la tinció de proteïnes detectada per immunofluorescència es solapava estretament amb el patró de calcificació ectòpica observat mitjançant la tinció de von Kossa (Fig. 7A, B, la calcificació és visible com a material negre indicat per les fletxes a B). Aquests resultats proporcionen un suport addicional per a la presència de partícules mineralo-orgàniques als teixits renals humans examinats.
Discussió
Tot i que s'han fet avenços en la nostra comprensió de les interaccions entre les NP sintètiques i les cèl·lules humanes, sabem molt menys sobre els efectes dels NP mineralo-orgànics que es formen espontàniament en els fluids corporals. Els nostres estudis anteriors han demostrat que aquestes partícules es formen en fluids biològics quan les concentracions de calci i fosfat superen la saturació15,16. També vam observar que aquestes partícules són interioritzades per cèl·lules immunitàries, però que només les partícules grans indueixen reaccions immunitàries proinflamatòries23. Tanmateix, fins ara no s'havia examinat la distribució d'aquestes partícules als teixits humans i si tenen algun paper fisiològic o patològic en el cos.
En el present estudi, hem detectat per primera vegada NP mineralo-orgànics en ronyons de pacients humans que pateixen malaltia renal en fase terminal o càncer renal. Els NP mineralo-orgànics detectats contenen fosfat de calci poc cristal·litzat similar al mineral ossi, així com albúmina, fetuïna-A i apo-A1 que actuen com a inhibidors de la calcificació sistèmica en els fluids corporals. Els nostres resultats estan d'acord amb els informes anteriors que descriuen la presència de complexos minerals-proteïnes en teixits vasculars i fluids corporals12,13,34,40. Com que les partícules que vam observar es van trobar en zones que no contenien calcificacions microscòpiques, les nostres observacions suggereixen que les partícules poden representar precursors de la calcificació ectòpica en els teixits humans. Tenint en compte la possibilitat que els NP mineralo-orgànics puguin créixer gradualment de mida i patir una conversió de partícula a pel·lícula en condicions favorables tal com es descriu en els nostres estudis anteriors15,18, les observacions presentades aquí suggereixen que els precursors minerals poden conduir a la formació de més grans. dipòsits minerals in vivo, com ara la placa de Randall i els càlculs renals.
Les nostres observacions que les calcificacions ectòpiques minerals i els NP mineralo-orgànics es troben en diverses estructures anatòmiques dels ronyons són coherents amb les troballes anteriors de calcificacions ectòpiques en aquest òrgan41. Les observacions d'Evan et al. van indicar que la mineralització als ronyons de pacients amb nefrolitiasi pot començar i ocórrer predominantment al teixit intersticial dels bucles de Henle40,42. Aquests autors van observar que els dipòsits minerals que es formen en aquesta zona poden sobresortir de la cara basal de l'uroteli i conduir a la formació de càlculs renals. Les nostres observacions suggereixen que, a més dels bucles de Henle, altres àrees renals poden contenir NPs minerals que eventualment poden evolucionar per formar grans dipòsits minerals en els ronyons humans. També estem investigant la possibilitat que els NP minerals que es formen a la circulació sanguínia es puguin traslladar als teixits renals i induir la calcificació ectòpica i la formació de càlculs als ronyons.
Diversos grànuls de ronyó detectats en el present estudi es troben dins de vesícules intracel·lulars o extracel·lulars (Fig. 4H, I) i aquests són similars a les vesícules de la matriu que indueixen la calcificació en ossos i dents7,8. Recentment hem observat que les vesícules aïllades del sèrum humà i animal indueixen la formació de NPs minerals i precipitats microscòpics in vitro25. Schlieper et al.34 també van observar que les partícules minerals que es troben a les artèries s'associen amb estructures de membrana i van proposar que les vesícules de la matriu o els cossos apoptòtics poden representar nucleadors de partícules minerals en aquests teixits. De la mateixa manera, Khan et al. va informar que els dipòsits de fosfat de calci que es troben als ronyons de pacients humans amb càlculs renals idiopàtics estan associats amb fibres de col·lagen i vesícules de la matriu9. Aquests resultats suggereixen que els NP mineralo-orgànics detectats als teixits renals es poden formar mitjançant un mecanisme que implica vesícules de membrana, una situació anàloga a la que es veu a les artèries ateroscleròtiques7,8. D'altra banda, un estudi recent va demostrar que la calcificació ectòpica trobada a les artèries mamaries de les dones no estava associada amb marcadors de cèl·lules osteogèniques o apoptòtiques43, cosa que suggereix que el mecanisme de calcificació pot ser específic de l'òrgan o context biològic implicat. A més, els NP mineralo-orgànics com els que es descriuen aquí també es poden formar teixits renals humans a causa d'un fracàs per mantenir les concentracions fisiològiques d'ions (per exemple, calci i fosfat) i inhibidors de la calcificació (per exemple, albúmina, fetuïna-A i apo). -A1) en els fluids corporals de l'ésser humà.
Els nostres resultats suggereixen que la capa densa d'electrons i el nucli dels NPs orgànics de minerals poden contenir nivells més alts de proteïnes i molècules orgàniques en comparació amb les àrees amb llum electrònica de les partícules (Fig. 6A, B). Aquestes capes denses en electrons semblen estar mineralitzades com es veu per la naturalesa cristal·lina d'aquest material sota TEM (vegeu la figura 4A-J). Altres autors, inclosos Ryall41 i Evan et al.44, han proposat que la capa transparent d'electrons pot representar minerals mentre que les capes denses en electrons poden correspondre a molècules orgàniques. Aquestes interpretacions poden ser degudes almenys en part a la manera en què es van processar i examinar les mostres en cada estudi, així com a la naturalesa dels teixits de partida utilitzats.
A més de tenir un paper en la calcificació ectòpica, les partícules orgàniques de minerals poden induir inflamació en els teixits renals. Recentment hem demostrat que, mentre que els NP mineralo-orgànics no aconsegueixen induir la secreció d'interleucina proinflamatòria-1 pels macròfags humans, els agregats minerals més grans d'1 μm són capaços de fer-ho23. S'ha demostrat que l'alliberament d'interleucina-1 en resposta a materials cristal·lins depèn de l'activació de complexos moleculars intracel·lulars anomenats inflammasomes45–47. A més, les partícules minerals es van detectar en ronyons que contenen tumors i l'associació entre càncer i inflamació és ara ben reconeguda48. Queda per investigar la possibilitat que les partícules minerals agregades puguin activar un inflamasoma i contribuir al desenvolupament d'inflamació i càncer als ronyons o altres teixits.
A més de la calcificació ectòpica, els grànuls minerals descrits aquí poden participar en altres processos de malaltia. Per exemple, abans hem proposat que els NP minerals poden unir-se a diverses proteïnes dels fluids corporals i esgotar aquestes molècules orgàniques dels fluids corporals20,26. D'altra banda, el cos humà pot prevenir la formació i l'acumulació de NP minerals en circumstàncies normals basant-se en la presència d'inhibidors de la calcificació i el sistema reticuloendotelial (és a dir, macròfags). Així, els NP minerals només poden acumular-se una vegada que es pertorba l'homeòstasi del calci sistèmica o local i quan els mecanismes protectors han fallat al cos humà.
Proposem que l'enfocament de nanomaterials desenvolupat aquí es pugui utilitzar per estudiar la formació de NP mineralo-orgànics en teixits animals i humans. Per exemple, els anticossos generats contra proteïnes inhibidores de la calcificació com l'albúmina, la fetuïna-A i l'apo-A1 es poden utilitzar en combinació amb l'anàlisi de minerals per detectar i caracteritzar la formació de NPs mineralo-orgàniques en els teixits dels models animals. Els resultats obtinguts mitjançant aquest enfocament es poden aplicar a mesures clíniques fetes en fluids corporals humans per tal d'identificar paràmetres biològics que reflecteixen l'estat de formació de partícules minerals i calcificació ectòpica al cos. Esperem que aquest coneixement pugui conduir al desenvolupament de noves estratègies terapèutiques per prevenir i tractar malalties humanes i condicions associades a la calcificació ectòpica.
Mètodes
Teixits renals.L'ús de teixits humans i els experiments realitzats en aquest estudi van ser aprovats per la Junta de Revisió Institucional de l'Hospital Memorial Chang Gung; els mètodes i experiments es van dur a terme d'acord amb les directrius aprovades. Es va obtenir el consentiment informat per escrit dels pacients. Es van obtenir teixits renals sans control a partir de biòpsies de pacients amb traumatisme i hematoma sense antecedents de malaltia renal (n=2); També es van obtenir teixits renals de pacients amb càncer renal (n=20) i de pacients amb malaltia renal en fase terminal (n=2) els ronyons dels quals es van extreure o fer una biòpsia durant la cirurgia de trasplantament (taula 1). Per als teixits de càncer renal, la part no cancerosa del teixit es va disseccionar i analitzar en el present estudi.
Anàlisi histològica.Els teixits renals es van muntar sobre blocs de parafina. Es van seccionar els blocs i es van escalfar rodanxes de teixit en una placa calenta a 70 graus durant 30 minuts per eliminar la parafina. Les seccions es van submergir en una solució fresca de xilè tres vegades durant 15 minuts per eliminar completament la parafina restant. Les seccions es van rehidratar amb etanol al 95 per cent, 80 per cent i 70 per cent durant 5 minuts cada vegada. Les mostres rehidratades es van rentar amb aigua destil·lada doble (ddH2O) durant 5 minuts. Els nuclis cel·lulars es van tacar amb hematoxilina durant 8 minuts. El colorant es va treure de les mostres amb aigua tèbia durant 10 minuts. Les mostres de ronyó es van esbandir amb ddH2O i es van submergir 10 vegades en etanol al 95%. Les mostres tractades amb etanol es van tacar amb eosina Y durant 1 min. Les mostres es van deshidratar amb etanol al 95 per cent i al 100 per cent durant 10 minuts cada vegada, seguit d'un pas de deshidratació en xilè durant 10 minuts. Els exemplars de ronyó deshidratats finals es van muntar sobre portaobjectes de vidre amb un 50 per cent de glicerol i es van observar sota un microscopi de llum equipat amb una càmera digital.
Es van preparar espècimens desparafinitzats i rehidratats tal com es descriu per a la tinció de H&E. Les seccions rehidratades es van tacar amb nitrat de plata (5 per cent), seguida de l'exposició a la llum UV durant 20 minuts. La solució es va rentar amb ddH2O durant 15 minuts. Les seccions es van tenyir amb tiosulfat de sodi (5 per cent) durant 5 minuts, seguit de rentat amb ddH2O durant 15 minuts. Les seccions es van tacar amb vermell nuclear ràpid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) durant 5 minuts. Les mostres tacades es van deshidratar successivament amb etanol al 95% i al 100% durant 10 minuts cadascuna, abans de la deshidratació en xilè durant 10 minuts. Les mostres de ronyó es van muntar sobre portaobjectes de vidre i es van examinar tal com es descriu anteriorment.
Microscòpia electrònica i anàlisi EDX.Les mostres de ronyó es van tallar en trossos petits de menys d'1 mm de gruix mitjançant un microscopi de dissecció LGPS (Olympus, Tòquio, Japó). Els teixits es van fixar amb un 2,5 per cent de glutaraldehid i un 1 per cent de paraformaldehid en tampó de cacodilat 0,1 M a 4 graus durant la nit. Les mostres fixes es van rentar tres vegades amb tampó de cacodilat 0,1 M en sacarosa al 8% (pH 7,2) sobre gel durant 10 minuts. Els teixits rentats es van incubar en solució salina tamponada amb fosfat (PBS; 137 mM NaCl, 2, 7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) que contenia 1 per cent de tetròxid d'osmi i 1, 5 per cent de ferrocianur de potassi durant 2 hores sobre gel. Els teixits es van rentar amb ddH2O sobre gel 10 minuts tres vegades. Els teixits rentats es van tacar sobre gel amb un 1% d'acetat d'uranil en ddH2O durant 1 h, abans de rentar-los tres vegades amb ddH2O sobre gel. Els teixits renals es van deshidratar amb etanol al 30, 50, 70, 80 i 90 per cent durant 10 minuts cada vegada, excepte quan l'etanol va arribar al 70 per cent, en aquest cas les mostres es van emmagatzemar a 4 graus durant la nit. Els teixits es van tacar amb un 1% d'àcid fosfotúngstic en un 95% d'etanol durant 15 minuts, abans de la deshidratació amb un 95% d'etanol durant 5 minuts. Els exemplars es van submergir en òxid de propilè al 40, 57, 67 i 100 per cent en etanol durant 10 minuts cada vegada, seguit d'una altra immersió en òxid de propilè al 100 per cent durant 5 minuts. Els teixits renals es van infiltrar amb un 50, 70 i 100 per cent d'Eponate 812 (Ted Pella, Redding, CA) durant 1 h cada vegada. Les mostres de ronyó incrustat 812-eponat es van preparar incubant dues vegades en un 100% d'eponat. Les mostres incrustades es van incubar en un forn a 60 graus durant la nit per permetre la polimerització de la resina.
Els pellets de HS-NP rentats obtinguts com anteriorment es van fixar amb glutaraldehid (2,5 per cent) i paraformaldehid (1 per cent) en ddH2O durant 4 hores a 4 graus. Els pellets fixos es van rentar amb ddH2O tres vegades durant 10 minuts cada vegada. Els pellets es van deshidratar amb successives incubacions en etanol al 30, 50, 70, 80, 90, 95 i 100 per cent, durant 10 minuts cada vegada, excepte quan l'etanol va arribar al 70 per cent, en què els pellets es van emmagatzemar a 4 graus durant la nit. Altres solucions d'etanol només es van posar en contacte amb els pellets durant 10 minuts. Els pellets deshidratats es van infiltrar amb un medi d'incrustació blanc LR (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) mitjançant diferents proporcions d'etanol i medi LR (3:1, 1:1 i 1:3) durant 30 minuts cadascun. Els pellets es van infiltrar amb medi LR fresc (100 per cent) durant la nit abans de la polimerització. Els pellets infiltrats amb medi LR es van incubar en un forn a 60 graus durant 2 dies per permetre la polimerització de la resina. Es van seccionar blocs de ronyó i HS-NP per produir rodanxes amb un gruix de 70 a 100 nm mitjançant un micròtom Reichert Ultracut S (Leica, Wetzlar, Alemanya). Les seccions de teixit es van tacar amb un 4% d'acetat d'uranil abans de la visualització amb un microscopi electrònic de transmissió JEM 1230 (JEOL, Tòquio, Japó) operat a 100 kV. Els patrons de difracció d'electrons es van obtenir amb el mateix sistema. Es van utilitzar reixes de níquel com a suport.
Per a l'anàlisi EDX, es van tacar seccions primes de teixits renals amb acetat d'uranil i es van rentar amb ddH2O com anteriorment, seguit d'assecat en un armari dessecador electrònic. Es van observar mostres amb un microscopi electrònic de transmissió JEM 2100 (JEOL) d'alta resolució que funcionava a 120 kV. Els espectres EDX es van obtenir per triplicat mitjançant un sistema INCA Energy EDS (Oxford Instruments, Abingdon, Regne Unit). Es van observar seccions primes de HS-NP sense tinció.
Preparació de NPs mineralo-orgàniques.Totes les solucions inicials es van ajustar a pH 7,4 i es van esterilitzar per filtració a través de membranes de 0.2μm abans d'utilitzar-les. L'HS es va obtenir de voluntaris humans sans mitjançant una tècnica de venopunció convencional. L'ús de fluids biològics humans en aquest estudi va ser aprovat per la Junta de Revisió Institucional de l'Hospital Memorial Linko Chang Gung i es va obtenir el consentiment informat per escrit dels voluntaris. Els HS-NP es van preparar afegint 3 mM de CaCl2 i Na2HPO4 cadascun a DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) que contenia un 10 per cent de HS, seguit d'una incubació durant una setmana en condicions de cultiu cel·lular (37 graus, 5 per cent de CO2, aire humidificat). Les partícules es van sedimentar per centrifugació a 16,000 × g durant 15 minuts a 4 graus i es van rentar dues vegades amb tampó HEPES (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) mitjançant el mateix procediment de centrifugació.
SDS-PAGE i Western blotting.L'anàlisi SDS-PAGE i Western blot es va realitzar essencialment com abans15. Breument, 0,2 ug (Fig. 5A,D) o 1,2 ug (Fig. 5B,C) de proteïnes HS, 47 ug (Fig. 5A,B,D) o 590ug de proteïnes HS-NP (Fig. 5C), 0.1ug de HSA (Fig. 5A-D) i 0.6ug (Fig. 5A, C, D) o {{23} },15 ug de HSF (Fig. 5B) es van dissoldre en 5 × "tampó de càrrega" (0.313 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 0,05% blau de bromofenol, 50% glicerol, 12,5% - mercaptoetanol) a una concentració final d'1 ×, abans de l'escalfament a 95 graus durant 5 minuts i la separació en condicions de desnaturalització i reducció en un SDS-PAGE al 10% mitjançant un sistema de mini-gel (Hoefer, Holliston, MA). El control NP (utilitzat al carril 1 de la figura 5A-D) consistia en NP minerals preparats afegint 3 mM de CaCl2 i Na2HPO4 cadascun a DMEM (volum final d'1 ml), seguit d'una incubació durant un dia en condicions de cultiu cel·lular; les partícules es van sedimentar per centrifugació a 16,000 x g durant 15 minuts, es van rentar dues vegades amb tampó HEPES i es van tornar a suspendre en 50 ul de tampó HEPES. Es va processar una alíquota de 20 ul de partícules resuspeses per a SDS-PAGE com anteriorment. Les membranes de PVDF es van bloquejar durant 1 h en llet desgreixada al 5% (p/v) a temperatura ambient. Els anticossos primaris generats internament, tal com es va descriure abans25, es van utilitzar amb una dilució d'1:1,000 (-apo-A1 i -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) , o 1:6,000 ( -HSA). L'anticòs secundari conjugat amb peroxidasa de rave picant anti-conill de cabra es va utilitzar segons les instruccions proporcionades pel fabricant (Millipore, Billerica, MA). Les taques es van revelar mitjançant quimioluminescència millorada (Amersham Biosciences, Amersham, Regne Unit) i pel·lícules autoradiogràfiques.
Etiquetatge immunogold.Es van preparar mostres per a l'observació TEM. Els blocs HS-NP es van seccionar en rodanxes de menys de 7 0 nm de gruix. Les seccions de mostra de les graelles es van bloquejar amb un 1% de gelatina de peix (Sigma) en tampó HEPES 0, 1 M (pH 8, 0) durant 25 minuts. Les graelles es van incubar amb els anticossos primaris següents: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. El control negatiu no contenia cap anticòs primari (1 per cent de gelatina de peix al tampó HEPES). Les seccions incubades es van esbandir amb tampó HEPES durant 15 minuts. Les seccions esbandides es van bloquejar amb un 1% de gelatina de peix en tampó HEPES durant 20 minuts. Els exemplars es van tractar amb la IgG anti-conill de cabra conjugada d'or 5-nm secundària durant 1 h. Les mostres es van rentar amb tampó HEPES durant 10 minuts, abans de rentar-les amb ddH2O durant 10 minuts. Les observacions TEM es van realitzar com a anterior.
Microscòpia de fluorescència.Les diapositives histològiques de teixit renal preparats com anteriorment es van bloquejar amb un 1% d'albúmina sèrica bovina durant 1 h a temperatura ambient. Les diapositives es van incubar amb anticossos policlonals primaris a una dilució d'1:4,000. Després dels passos de rentat, les mostres es van incubar amb els anticossos secundaris de cabra anti-conill-FITC (492/520nm) i cabra anti-conill-TRITC (550/570nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) a 1:100 per 1h. Els complexos es van rentar amb PBST durant 15 minuts. La taca fluorescent 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) es va utilitzar a 10 ug/ml durant 15 minuts. Els exemplars tenyits amb DAPI es van deshidratar amb etanol al 95 i al 100 per cent durant 10 minuts cadascun, seguit de la deshidratació en xilene durant 10 minuts més. Les mostres de ronyó deshidratades es van muntar amb un medi de muntatge de fluorescència Vectashield H-1000 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i es van observar sota un microscopi confocal (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Alemanya) equipat amb una càmera Spot Flex.
Cistanche tubulosa prevé la malaltia renal, feu clic aquí per obtenir la mostra
Referències
1. Giachelli, CM Calcificació ectòpica: recopilació de fets concrets sobre la mineralització dels teixits tous. Am J Pathol 154, 671–675 (1999).
2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Calcificació vascular: mecanismes i ramificacions clíniques. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004).
3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Calcification in atherosclerosis. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).
4. Allison, MA, Criqui, MH i Wright, CM Patrons i factors de risc per a l'aterosclerosi calcificada sistèmica. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004).
5. Ketteler, M. et al. Deficiències de proteïnes reguladores del calci en pacients en diàlisi: un concepte nou de calcificació cardiovascular en urèmia. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).
6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Orientació a la calcificació vascular: suavitzar un objectiu dur. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).
7. Kapustin, AN i Shanahan, CM Regulació del calci de les vesícules de matriu derivades de cèl·lules musculars llises vasculars. Tendències Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).
8. Doherty, TM et al. Calcificació en aterosclerosi: biologia òssia i inflamació crònica a la cruïlla arterial. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003).
9. Khan, SR, Rodríguez, DE, Gower, LB i Monga, M. Associació de plaques de Randall amb fibres de col·lagen i vesícules de membrana. J Urol 187, 1094–1100 (2012).
10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK Caracterització bioquímica del complex sèrum fetuïna-mineral. J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003).
11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM i Than, TN Els nivells sèrics del complex fetuïna-mineral es correlacionen amb la calcificació de l'artèria a la rata. J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004).
12. Heiss, A. et al. Paper jeràrquic de la fetuïna-A i les proteïnes sèriques àcides en la formació i estabilització de partícules de fosfat de calci. J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008).
13. Bertazzo, S. et al. La microscòpia electrònica nanoanalítica revela coneixements fonamentals sobre la calcificació del teixit cardiovascular humà. Nat Mater 12, 576–583 (2013).
14. Martel, J. & Young, JD. Presuposts nanobacteris a la sang humana com a nanopartícules de carbonat de calci. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008).
15. Young, JD et al. Els nanobacteris putatius representen restes fisiològiques i subproductes de cultiu de l'homeòstasi normal del calci. Plos One 4, e4417 (2009).
16. Young, JD et al. Caracterització de granulació de calci i apatita en sèrum com a complexos mineraloproteics pleomòrfics i com a precursors de putatius nanobacteris. Plos One 4, e5421 (2009).
17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Complexos Fetuin-A/albúmina-minerals semblants a grànuls de calci sèric i nanobacteris putatius: demostració d'un concepte de sembra d'inhibició dual. Plos One 4, e8058 (2009).
18. Young, JD & Martel, J. The rise and fall of nanobacteria. Sci Am 302, 52–59 (2010).
19. Martel, J., Wu, CY i Young, JD Avaluació crítica del sèrum irradiat amb gamma utilitzat com a alimentador en el cultiu i demostració de nanobacteris putatius i nanopartícules calcificants. Plos One 5, e10343 (2010).
20. Martel, J. et al. Anàlisi proteòmica integral de nanopartícules minerals derivades de fluids corporals humans i analitzades per cromatografia líquida-espectrometria de masses en tàndem. Anal Biochem 418, 111–125 (2011).