Determinació de l'echinacòsid en l'extracte aquàtic de Cistanche Herba per HPLC

Resum:

Objectiu Es va establir un mètode HPLC per adeterminació de l'equinacòsiden elextracte d'aigua de Cistancheherba.

Mètodes L'echinacòsid es va determinar per HPLC. La separació es va realitzar a la columna Inertsil ODS-SP C18 amb una fase mòbil formada per acetonitril (A) i solució d'àcid fosfòric 0,4% (B), mitjançant elució en gradient. La longitud d'ona de detecció es va establir a 333 nm i la temperatura de la columna era de 30 graus. El cabal era d'1,0 ml·min-1 i el volum d'injecció era de 10 μL. Resultats La relació lineal de l'equinàcòsid dins del rang de concentració de 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 va ser bona (r=0.999 8). Les recuperacions van ser del 94,59%-105,31% (RSD{= 2,93%, n=9). El contingut d'echinacòsid en extractes d'aigua de Cistanche herba va ser de 15.527,7.347,12.267 mg·g-1. Conclusió El mètode HPLC establert amb bona repetibilitat és precís, senzill i factible. És adequat per a la determinació d'echinacòsid en l'extracte aquàtic de Cistanche herba.

Paraules clau:HPLC;extracte aquàtic de Cistanche herba; equinacòsid; determinació del contingut

Cistanche deserticola és una medicina tradicional xinesa tònica que s'utilitza habitualment en la pràctica clínica i es coneix com "ginseng del desert" [1]. La Cistanche deserticola registrada a l'edició de 2015 de la Farmacopea Xinesa és la tija carnosa seca amb fulles escamoses de Cistanche deserticola YC Ma o Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. És càlid, dolç i salat, i torna als meridians del ronyó i l'intestí gros. Té els efectes de nodrir el yang del ronyó, reomplir l'essència i la sang, i hidratar els intestins i els laxants [2]. "La Materia Medica de Shen Nong", diu que pot "tonificar el mig, nodrir els cinc òrgans interns, enfortir el yin i nodrir l'essència". Cistanche deserticola conté principalment glicòsids feniletanoides, iridoides i els seus glicòsids, lignans i els seus glucòsids, polisacàrids, compostos èster i alcaloides [3]. Els glucòsids de feniletanol són els principals ingredients actius de Cistanche deserticola. Entre ells, l'echinacòsid i el verbascòsid figuren a Cistanche deserticola a la farmacopea xinesa.

Components indicatius per a la identificació i determinació del contingut. Els estudis farmacològics [4] mostren que Cistanche deserticola té diversos efectes farmacològics com ara laxant, protecció hepàtica, antiosteoporosi, antioxidant, anti-envelliment i anti-fatiga. L'extracte aquós de Cistanche deserticola pot promoure l'expressió del gen de la proteïna morfogenètica òssia 2 en osteoblasts de rata, fosfatasa àcida resistent al tartrat, osteocalcina al sèrum de ratolins ovariectomitzats i gens Smad1, mad5, factor de creixement transformador, etc. a la medul·la òssia. , té efectes contra l'osteoporosi [5-6].

L'equinàcia pot promoure la proliferació d'osteoblasts i promoure la diferenciació de cèl·lules mare mesenquimals de medul·la òssia cultivades in vitro en osteoblasts [7-9]. En els darrers anys, hi ha hagut molts informes d'investigació sobre la determinació del contingut d'echinacòsid i verbascòsid a l'extracte d'etanol de Cistanche deserticola i els seus preparats compostos [10-12], però hi ha pocs informes sobre la determinació del contingut dels components de l'índex a Cistanche deserticola extracte aquós. En aquest estudi, es va utilitzar cromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) per determinar el contingut d'echinaceaside en l'extracte aquós de Cistanche deserticola.

1 material

1.1 Instruments

Cromatografia líquida d'alt rendiment LC-20AT, SPD-20A detector, SIL-20Un mostreig automàtic, CTO-10Forn de columna ASvp, estació de treball de cromatografia líquida en solució LC, Shimadzu Corporation of Japó; Balança analítica electrònica MES125P-OCE-DU, Sartorius Company, Alemanya; SHZ-D (Ⅲ) bomba de buit multiusos d'aigua circulant, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Sistema de circulació de refrigeració de l'evaporador rotatiu RC2B SO25, evaporador rotatiu RV 10 D S96, Companyia IKA, Alemanya; DK-S26

Bany d'aigua elèctric a temperatura constant, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Màquina d'aigua ultrapura de la sèrie UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Materials i reactius medicinals

El material medicinal Cistanche deserticola es va comprar a Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., número de lot: 1801001, 1806001, 181001. Tu Xingming, el farmacèutic tradicional xinès en cap del Tercer Hospital Afiliat de la Universitat de Medicina Xinesa de Guangzhou, el va identificar. com la tija carnosa seca amb fulles escamoses de Cistanche deserticola YCMa. La mostra s'emmagatzema a la sala de proves de drogues del Tercer Hospital Afiliat de la Universitat de Medicina Xinesa de Guangzhou; Substància de referència de glicòsids d'equinàcia, contingut 89,7%, Institut Xinès de Control d'Aliments i Medicaments, número de lot: 111670-

201706; l'acetonitril és cromatogràficament pur (Merck, Alemanya); el metanol i l'àcid fosfòric són analíticament purs (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); l'aigua és aigua ultrapura.

2 Mètodes i resultats

2.1 Preparació d'extracte aquàtic de Cistanche deserticola

Agafeu la pols gruixuda de material medicinal de Cistanche deserticola, afegiu 10 vegades la quantitat d'aigua destil·lada, escalfeu-lo i reflux per extreure'ls dues vegades, 1 hora cada vegada, filtreu, combineu el filtrat i concentreu el filtrat amb un evaporador rotatiu. a un contingut de fàrmac brut de 0,100 g·mL-1, i emmagatzemar-lo a 4 graus per al seu ús posterior.

2.2 Condicions cromatogràfiques i idoneïtat del sistema

Columna cromatogràfica: columna Inertsil ODS SP C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); fase mòbil: acetonitril (A)-0.4% solució d'àcid fosfòric (B), elució en gradient: 0 ~ 5 min, 17%

A; 5 ~ 25 min, 20% A; 25 ~ 30 min, 17% A; longitud d'ona de detecció: 333 nm; temperatura de la columna: 30 graus; cabal: 1,0 mL·min-1;

Volum d'injecció: 10 μL. En aquestes condicions cromatogràfiques, la separació entre els pics de l'echinacòsid i els components adjacents és superior a 1,5, i el nombre de plaques teòriques basades en el pic d'equinacèsid no hauria de ser inferior a 4,000. El cromatograma es mostra a la figura 1.

2.3 Preparació de la solució

2.3.1 Solució de substància de referència Peseu una quantitat adequada de substància de referència d'echinacòsid, peseu-la amb precisió, col·loqueu-la en un matràs aforat de 10 ml, afegiu-hi metanol per dissoldre-la i prepareu una solució de substància de referència que contingui 898,794 ug d'equinàcèsida per ml, 4 graus. Desa per a un ús posterior.

2.3.2 Solució de prova

Mesureu amb precisió 2,0 mL d'extracte aquós de Cistanche deserticola, evaporeu fins a sequedat en un bany maria, afegiu metanol per dissoldre, diluïu-lo a volum en un matràs aforat d'10 mL, agiteu bé i filtra amb una membrana microporosa de 0,22 μm per obtenir.

2.4 Investigació de la relació lineal

Mesura amb precisió {{0}},25, 0,5{0, 1,00, 2,00, 2,50, 3.00 mL de la solució de referència a l'apartat 2.3.1, col·loqueu-la en un matràs aforat de 5 ml, afegiu-hi metanol fins que arribi al volum i agiteu bé per obtenir una concentració de gradient de 44.{{17} }, 89.879 4. 179.758 8, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL{-1 solució de referència, filtrada per una membrana microporosa de 0,22 μm. Mesureu segons les condicions cromatogràfiques de 2.2 i registreu l'àrea del pic. Feu una regressió lineal amb la concentració de massa de la substància de referència com a abscissa (X, ug·mL-1) i l'àrea del pic com a ordenada (Y), i s'obté l'equació de regressió: Y=13 185 .0X-32 273.0, r=0.999 8. Els resultats mostren que l'equinàcia té una bona relació lineal dins del rang de concentració de 44.939 7 ~ 539.276 4 ug·mL-1.

2.5 Prova de precisió

Agafeu 539.276 4 ug ·mL- 1 solució de referència, injecteu i mesureu 6 vegades contínuament segons les condicions cromatogràfiques sota 2,2 i registreu l'àrea del pic. Els resultats van mostrar que la RSD de l'àrea del pic d'echinacòsid era de l'1,81%, cosa que indica una bona precisió de l'instrument.

2.6 Prova d'estabilitat

Mesureu amb precisió 2.0 mL d'extracte aquós de Cistanche deserticola, evaporeu fins a sec en un bany maria, afegiu metanol per dissoldre, diluïu-lo en un matràs aforat d'10 mL, agiteu bé, filtreu amb un {{ 7}}.22 μm de membrana microporosa, seguiu les condicions cromatogràfiques del punt 2.2 i col·loqueu-les a 0 i 2 respectivament. , 4, 8, 12, 24 h de mesura d'injecció, registre l'àrea del pic. Els resultats van mostrar que la RSD de l'àrea del pic d'echinacòsid era de l'1,16%, cosa que indica que la solució de prova tenia una bona estabilitat en 24 hores.

2.7 Prova de repetibilitat

Mesureu amb precisió 2,0 mL d'extracte d'aigua de Cistanche deserticola i prepareu 6 solucions de prova en paral·lel segons el mètode de 2.3.2. Injecteu mostres per mesurar-les segons les condicions cromatogràfiques de 2.2 i registreu l'àrea del pic. Els resultats van mostrar que el RSD delequinacòsidla concentració de massa va ser de l'1,28%, cosa que indica una bona repetibilitat del mètode.

2.8 Prova de recuperació de la mostra

Mesureu amb precisió 9 porcions d'1,0 mL d'extracte d'aigua de Cistanche deserticola, afegiu 0,8, 1,0 i 1,2 mL de solució de referència (1,552 mg·mL{{11). }}) respectivament, evaporeu fins a sequedat en un bany maria, afegiu metanol per dissoldre i ajusteu-lo a un matràs aforat d'10 mL; Agitar bé i filtrar a través d'una membrana microporosa de 0,22 μm per preparar solucions de prova de concentració alta, mitjana i baixa. Prepareu 3 còpies de cada concentració en paral·lel. Mesura segons les condicions cromatogràfiques de 2.2. Anoteu l'àrea del pic i calculeu la recuperació de la mostra. Taxa. Els resultats es mostren a la taula 1.

2.9 Determinació del contingut de la mostra

Mesureu amb precisió 3 porcions de 2.0 mL d'extracte aquós de Cistanche deserticola, evaporeu fins a sec en un bany maria, afegiu metanol per dissoldre, diluïu-lo en un matràs aforat d'1{0 mL, agiteu bé, filtreu amb una membrana microporosa de 0,22 μm, i mesura segons les condicions cromatogràfiques de 2.2. Enregistreu l'àrea del pic i calculeu el contingut d'echinaceaside. Els resultats es mostren a la taula 2.

Taula 1 Resultats de les proves de recuperació d'echinacòsid

Taula 2 Resultats de la determinació del contingut d'echinacòsid en extracte aquàtic de Cistanche herba