Control diferencial de cèl·lules T Treg humanes i efectores a la immunitat tumoral mitjançant anticossos anti-CTLA-4 dissenyats per Fc

Anti-CTLA-4 mAb és eficaç per millorar la immunitat tumoral en humans. CTLA-4 s'expressa per les cèl·lules T convencionals després de l'activació i per les cèl·lules FOXP3 més CD4 més Treg que es produeixen de manera constitutiva, plantejant una qüestió de com l'mAb anti-CTLA-4 pot controlar de manera diferent aquestes poblacions de cèl·lules T funcionalment oposades en immunitat tumoral. Aquí mostrem que les cèl·lules Treg efectores potents de FOXP3 eren abundants als teixits del melanoma, expressant CTLA -4 a nivells més alts que les cèl·lules CD8 més T que infiltraven el tumor. Després de l'estimulació in vitro de l'antigen tumoral de cèl·lules mononuclears de sang perifèrica d'individus sans o pacients amb melanoma, mAb anti-CTLA-4 modificat per la regió Fc amb una alta citotoxicitat mediada per cèl·lules depenent d'anticossos (ADCC) i fagocitosi cel·lular (ADCP). ) l'activitat va esgotar selectivament CTLA-4 més FOXP3 més cèl·lules Treg i, en conseqüència, van expandir les cèl·lules CD8 més T específiques de l'antigen tumoral.

És important destacar que l'expansió només es va produir quan l'estimulació de l'antigen es va retardar uns quants dies des del tractament amb anticossos per estalviar CTLA-4 més l'efector activat CD8 més cèl·lules T de la mort mediada per mAb. De la mateixa manera, en ratolins portadors de tumors, el tractament amb mAb anti-CTLA-4 d'ADCC/ADCP alt amb una vacunació retardada de l'antigen tumoral va allargar significativament la seva supervivència i va augmentar notablement la producció de citocines mitjançant cèl·lules T CD8 més infiltrades en el tumor, mentre que el tractament amb anticossos. simultàniament amb la vacunació no. El mAb anti-CTLA4 modificat per mostrar una activitat d'unió a Fc menor o nul·la no va mostrar aquesta millora immune in vitro i in vivo depenent del temps. Així, un alt mAb anti-CTLA-4 ADCC pot esgotar selectivament les cèl·lules Treg efectores i evocar immunitat tumoral en funció del CTLA-4, que expressa l'estat de les cèl·lules T efectores CD8 més. Aquestes troballes són fonamentals per dissenyar immunoteràpia contra el càncer amb mAbs dirigits a les molècules expressades habitualment per FOXP3 més cèl·lules Treg i cèl·lules T efectores reactives al tumor.

Cèl·lules T reguladores|CTLA-4|FOXP3|immunoteràpia contra el càncer|Citotoxicitat mediada per cèl·lules dependent d'anticossos.

Les cèl·lules CD25 més CD4 més Treg d'origen natural, que expressen el factor de transcripció FOXP3, tenen un paper indispensable en el manteniment de l'autotolerància immunològica i l'homeòstasi (1). Tanmateix, també dificulten les respostes immunitàries efectives contra les cèl·lules tumorals que sorgeixen d'un mateix, com ho il·lustren les troballes que els tumors del ratolí es poden eradicar simplement mitjançant l'esgotament de les cèl·lules Treg (2-5).

En humans, hi ha proves acumulades d'una abundant infiltració de cèl·lules Treg en diversos teixits tumorals (6-8) i una correlació significativa entre la infiltració de Treg i el mal pronòstic en diversos tipus de càncer (9). Per tant, és probable que el control de les cèl·lules Treg als teixits tumorals sigui una manera prometedora d'evocar una immunitat tumoral efectiva en pacients amb càncer.

Per als antitumorals, vam trobar que Cistanche deserticola té un efecte antitumoral evident en la investigació de rates. 3 Els components de polisacàrids de Cistanche deserticola poden millorar la funció immune del cos, promoure l'activació dels glòbuls blancs, millorar l'estat immune del cos i també poden actuar directament sobre les cèl·lules tumorals. Inhibició de la proliferació, metàstasi i invasió de cèl·lules tumorals. També inhibeix l'angiogènesi. El creixement del tumor i la metàstasi necessiten el suport del creixement de nous vasos sanguinis, i els components polisacàrids de Cistanche poden inhibir l'angiogènesi, reduint així el creixement del tumor i la metàstasi.

Feu clic aquí per comprar cistanche

Les cèl·lules T CD4 més que expressen FOXP3-humanes tenen una funció heterogènia, incloses les cèl·lules Treg i les cèl·lules T convencionals no supresives. Es poden fraccionar en tres subpoblacions pels seus diferents nivells d'expressió de FOXP3 i CD45RA (10) (Fig. 1A): (i) CD45RA més FOXP3lo cèl·lules Treg naïves / en repòs [Fracció (Fr). I];(ii) Cèl·lules Treg (Treg) efectores CD45RA− FOXP3hi (Fr. II), que són terminalment diferenciades i altament supressives; i (iii) cèl·lules CD45RA− FOXP3lo no Treg (Fr. III), que no tenen activitat supressiva i són capaces de secretar citocines proinflamatòries. Després de l'estimulació antigènica, el P. Les cèl·lules Treg ingènues es diferencien en Fr. II Cèl·lules Treg, que expressen altament CTLA-4 (10).

Fig. 1. Expressió preferent de CTLA-4 per cèl·lules FOXP3hi Treg al teixit del melanoma. (A i B) Gràfics representatius de la tinció de cèl·lules CD4 més T (A) i freqüències de cada fracció (B). Els PBMC de donants sans (HD, n=5) i els PBMC i TIL de pacients amb melanoma (n=11 i 14, respectivament) van ser sotmesos a tinció directa per CD4, CD45RA i FOXP3. (C i D) Gràfics representatius de l'expressió de CCR7 i CD45RA per cèl·lules CD8 més T (C) i resum de cada subconjunt de cèl·lules CD8 més T (D). (E) Clústers que expressen CTLA-4 (línia de punts) en PBMC i TIL de pacients amb melanoma mitjançant anàlisi CyTOF. Es mostren els diagrames viSNE de cèl·lules T CD4 plus i CD8 plus amb mapes de calor per als nivells d'expressió de marcadors indicats (n=2). (F) Tinció només superficial o superficial i intracel·lular de CTLA-4 a PBMC HD. (G) Expressions superficials de CTLA-4 per cada fracció cel·lular de TIL i PBMC de pacients amb melanoma. Mitjanes ± SEM. *P Menor o igual a {{20}}.05, **P Menor o igual a 0,01, ***P Menor o igual a 0,001 i ****P Menor o igual a 0,0001 per ANOVA unidireccional amb la prova HSD de Tukey post hoc.

Tot i que la majoria de cèl·lules de Fr. III són cèl·lules no Treg i no es diferencien en Fr. II Les cèl·lules eTreg, un subconjunt circulant de cèl·lules reguladores T-fol·liculars, que són CXCR5 més CD45RA−, s'inclouen a Fr. III (11), indicant heterogeneïtat del P. III població. En canvi, amb la presència d'aquestes tres poblacions FOXP3 plus a la sang, la majoria dels tumors mostren una infiltració predominant de cèl·lules Treg, que semblen estar suprimint les respostes immunitàries antitumorals efectives en pacients amb càncer (12). Aquestes troballes suggereixen que l'esgotament/reducció de cèl·lules Treg en tumors i ganglis limfàtics regionals és fonamental per evocar i augmentar les respostes immunes antitumorals, com s'ha demostrat recentment amb alguns anticossos monoclonals (mAbs) específics per a les molècules expressades específicament per les cèl·lules Treg (13).

CTLA-4 s'expressa per cèl·lules T convencionals després de l'activació i per FOXP3 més CD25 més CD4 més cèl·lules Treg de manera constitutiva. Té un paper clau en la supressió mediada per Treg, almenys en part, mitjançant el control de l'expressió de CD80/CD86 per part de cèl·lules presentadores d'antigen (APC) (14-16). Inicialment es va considerar que el mAb CTLA-4 antihumà, que és clínicament eficaç en el tractament del melanoma (17, 18), bloquejava el senyal negatiu mediat per CTLA-4 a les cèl·lules T efectores activades, mantenint el seu estat activat en atacant les cèl·lules tumorals. No obstant això, estudis preclínics recents han demostrat que els mAb anti-CTLA-4 poden esgotar les cèl·lules FOXP3 més Treg, especialment als teixits tumorals, augmentant així la immunitat tumoral (19–21). En humans, però, és controvertit si CTLA-4 mAb afecta el nombre o la funció de les cèl·lules Treg o les cèl·lules T efectores, o ambdues, per millorar les respostes immunes antitumorals en contextos clínics.

En aquest estudi, hem investigat in vivo i in vitro, en humans i ratolins, els efectes dels mAbs anti-CTLA-4 dissenyats per Fc sobre les cèl·lules FOXP3 més Treg i les cèl·lules CD8 més T específiques de l'antigen propi/tumoral. Mostrem que el mAb anti-CTLA-4 que esgota les cèl·lules amb una alta activitat de citotoxicitat mediada per cèl·lules (ADCC) depenent d'anticossos pot provocar respostes immunitàries antitumorals depenent dels nivells i de la cinètica de l'expressió de CTLA-4 per part del dues poblacions. Els resultats es poden estendre a mAbs que esgoten les cèl·lules dirigides a altres molècules de superfície cel·lular que tant les cèl·lules Treg com les T efectores (Teff) expressen habitualment a diferents nivells i amb diferents cinètiques.

Importància

El mAb anti-CTLA-4 pot augmentar la immunitat tumoral malgrat l'expressió de CTLA-4 mitjançant poblacions de cèl·lules T oposades funcionalment: cèl·lules T efectores activades (Teff) i FOXP3 més CD4 més cèl·lules Treg. Aquí mostrem que mAb anti-CTLA-4 dissenyat per ser cèl·lules Treg esgotades citotòxiques de manera eficaç in vitro en humans i in vivo en ratolins. Va expandir les cèl·lules CD8 més Teff específiques de l'antigen quan l'estimulació de l'antigen tumoral es va retardar diversos dies per protegir-les de la mort per part del mAb. El mAb anti-CTLA-4 modificat per mostrar una activitat d'esgotament cel·lular menor o nul no va mostrar aquests efectes. Aquesta estratègia de control diferencial de les cèl·lules Treg i Teff mitjançant mAb citotòxics anti-CTLA-4 per evocar una immunitat tumoral eficaç ajudarà a dissenyar immunoteràpia contra el càncer dirigida a altres molècules expressades habitualment per les cèl·lules Treg i Teff.

Contribucions dels autors: investigació dissenyada per DH, A. Tanaka, HN i SS; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA i IK van realitzar investigacions; A. Tanemura va aportar nous reactius/eines analítiques; Dades analitzades per DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN i SS; i DH, A. Tanaka i SS van escriure el document.

Revisors: MA, Universitat Mèdica i Dental de Tòquio; i SAQ, University College London.

Declaració de conflicte d'interessos: HN va rebre una beca de recerca de Bristol Myers Squibb. SS va rebre una beca de recerca de Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK està emprat per Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., que va proporcionar alguns dels anticossos utilitzats en aquest estudi.

Publicat sota la llicència PNAS.

1 Adreça actual: Departament d'Immunologia, Graduate School of Medicine, Universitat de Nagoya, 466-8550 Nagoya, Japó.

2 Adreça actual: Departament d'Immunologia, Moffitt Cancer Center, Tampa, FL 33612.

3 Adreça actual: Division of Cancer Immunology, Exploratory Oncology Research & Clinical Trial Center, National Cancer Center, 277-8577 Kashiwa, Japó.

4 A qui s'ha d'adreçar la correspondència. Correu electrònic: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Publicat en línia el 26 de desembre de 2018.

Resultats

Acumulació de cèl·lules Treg FOXP3hi que expressen CTLA-4, terminalment diferenciades en teixits de melanoma.

Primer es va avaluar la freqüència de diverses subpoblacions de cèl·lules T entre limfòcits infiltrats de tumors (TIL) en pacients amb melanoma. Les cèl·lules eTreg CD45RA− FOXP3hi (Fr. II) van augmentar predominantment (∼ 10- vegades) en proporció entre CD4 més TIL, en comparació amb les cèl·lules CD4 més T de sang perifèrica en donants sans o pacients amb melanoma (Fig. 1 A i B). ). La freqüència de CD45RA− FOXP3lo Fr. Les cèl·lules no Treg III també van augmentar lleugerament (aproximadament el doble) entre CD4 més TIL. En canvi, les cèl·lules Treg naïves CD45RA més FOXP3lo (Fr. I) es van reduir significativament en els TIL a una quarta part, de mitjana, de la fracció corresponent a les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC).

Entre les cèl·lules T CD4 més convencionals de FOXP3 en TIL, les cèl·lules CD4 més T efectores/de memòria CD45RA-FOXP3-, que es podrien disseccionar més a les poblacions CD25 plus (Fr. IV) i CD25- (Fr. V) (10) , va augmentar lleugerament (∼1.3- vegades), mentre que CD45RA més FOXP3-naïf CD4 més cèl·lules T (Fr. VI) es van reduir significativament a una desena part de les de les PBMC. A la fracció de cèl·lules T CD8 més dels TIL, en comparació amb les PBMC dels pacients o donants sans, hi va haver un augment significatiu (∼1.6- vegades) de les cèl·lules T de memòria efectora CD45RA-CCR7- (TEM). amb una disminució significativa de les cèl·lules CD45RA més CCR7 més ingènues i CD45RA més CCR7− cèl·lules de memòria efectora diferenciada terminalment (TEMRA) fins a la meitat i una cinquena part, respectivament, de les de les PBMC, i cap canvi significatiu en CD45RA− CCR7 més la memòria central T (TCM) cèl·lules (Fig. 1 C i D). També es va observar en pacients amb melanoma que les cèl·lules CD8 més T ingènues en PBMCs van disminuir notablement (∼14- vegades) en comparació amb els donants sans.

A continuació, vam avaluar quina població de cèl·lules T expressava CTLA-4 en TIL o PBMC de pacients amb melanoma mitjançant citometria per citòmetre d'espectrometria de masses en temps de vol (CyTOF) (Fig. 1E i apèndix SI, Fig. S1A). El clúster de cèl·lules CD4 més CD45RA− Foxp3hi, que representa Fr. Les cèl·lules eTreg II, expressaven predominantment CTLA4 en PBMC i TIL, mentre que les cèl·lules CD8 més T amb prou feines expressaven CTLA-4 en PBMC o TIL. En els ratolins, l'expressió predominant de CTLA4 per FOXP3 més cèl·lules Treg es va observar de manera similar a la melsa i al teixit tumoral CMS5a (apèndix SI, fig. S1B). CTLA4 expressat pel P. humà. II Les cèl·lules Treg es trobaven principalment al compartiment intracel·lular i el CTLA de superfície cel·lular -4 estava limitat (Fig. 1F). No obstant això, en TIL, cèl·lules Treg i, en menor mesura, Fr. Es va trobar que les cèl·lules no Treg III expressaven CTLA superficial -4 a nivells significativament elevats (Fig. 1G i apèndix SI, Fig. S2). Les cèl·lules TIL CD8 més TCM i TEM també van expressar un nivell més alt de CTLA superficial-4 en comparació amb qualsevol de les fraccions de cèl·lules T circulants, tot i que les cèl·lules Treg van mostrar una expressió molt més alta en pacients amb melanoma (Fig. 1G i apèndix SI, Fig. S2).

En conjunt, les característiques cardinals dels teixits del melanoma humà són un augment i una disminució marcats de les cèl·lules Treg i les cèl·lules Treg naïves, respectivament, i un augment marcat de les cèl·lules CD8 més T efectores/de memòria amb una reducció de les cèl·lules T CD8 més naïves. Aquestes cèl·lules Treg i les cèl·lules CD8 més T dels TIL expressen CTLA-4 a la superfície cel·lular, amb una expressió més alta per part de la primera que de la segona. A diferència de les cèl·lules eTreg TIL, les cèl·lules eTreg circulants en pacients amb melanoma són significativament més baixes en el nivell d'expressió superficial de CTLA4, cosa que suggereix que poden estar menys afectades pel tractament anti-CTLA-4 mAb.

Reducció tant de cèl·lules Treg com de cèl·lules T CD8 més específiques d'antígen mitjançant el tractament in vitro amb mAb Anti-CTLA-4 que esgota les cèl·lules i estimulació simultània d'antigens.

Per abordar si els efectes antitumorals dels mAb anti-CTLA-4 dependrien de la seva capacitat d'esgotar les cèl·lules Treg per ADCC, vam modificar la porció Fc de l'mAb anti-CTLA-4 IgG1 (clon MDX{{3 }}, ipilimumab), que posseïa una activitat ADCC moderada, per canviar la seva afinitat per Fc RIIIa (CD16a), un Fc R activador expressat per cèl·lules NK, monòcits/macròfags i altres cèl·lules (22) (Fig. 2A). Així, un mAb anti-CTLA-4 generat amb una alta activitat ADCC, que vam anomenar tecnologia de reenginyeria asimètrica-domini Fc (ART-Fc), posseïa una substitució d'aminoàcids diferent a cada cadena pesada (23); és a dir, substitucions L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A en una regió Fc de cadena pesada i substitucions D270E/K326D/A330M/K334E a l'altra. El mAb reconstruït va mostrar una afinitat d'unió 1,000- vegades més gran per a la Fc RIIIa humana que l'mAb no modificat sense augmentar l'afinitat per la Fc RIIb inhibidora. També vam generar un mAb anti-CTLA-4 que amb prou feines s'uneix a Fc Rs, que vam anomenar-Fc silenciós anti-CTLA-4, per substitucions d'aminoàcids; és a dir, L235R, G236R i S239K a la regió Fc d'ambdues cadenes pesades. En comparació amb el mAb anti-CTLA-4 Fc no modificat o silenciós, l'ART-Fc va mostrar una citotoxicitat in vitro molt més alta per a CTLA-4, que expressava cèl·lules d'ovari de hàmster xinès (CHO) en presència de PBMC de donants sans. , amb un augment de la citotoxicitat per una incubació més llarga (Fig. 2B). De la mateixa manera, el mAb ART-Fc anti-CTLA-4 va matar efectivament Fr. II Cèl·lules Treg i, en menor mesura, Fr. III no Treg o Fr. Les cèl·lules Treg ingènues, mentre que IgG1 (ipilimumab) o mAb Fc silenciós amb prou feines mostraven activitat mata (Fig. 2C).

A continuació, es van avaluar els efectes d'aquests mAbs dissenyats per Fc sobre l'expansió específica de l'antigen in vitro de les cèl·lules T CD8 més estimulant les PBMC de HLA-A * 0201, que expressen donants sans o pacients amb melanoma durant 9 dies amb diversos pèptids, per exemple: derivat de Melan-A/MART-1, un antigen propi/tumoral expressat per melanòcits normals i algunes cèl·lules de melanoma (24); i NY-ESO-1, antigen de càncer/testicular expressat per diversos tipus de cèl·lules canceroses i cèl·lules germinals humanes (25), citomegalovirus (CMV) o virus de la grip (grip). Aquesta estimulació de pèptids in vitro, per exemple pel pèptid Melan-A, va mantenir l'alta expressió de CTLA4 per les cèl·lules Treg (Fig. 2D i apèndix SI, Fig. S3). L'estimulació peptídica sola també va expandir el tetràmer específic del pèptid (Tet) més les cèl·lules CD8 més T, que expressaven nivells més alts de CTLA-4, especialment a la superfície cel·lular, en comparació amb les cèl·lules Tet- (Fig. 2 E, F, i jo). Quan el mAb ART-Fc anti-CTLA-4 estava present des de l'inici de l'estimulació peptídica de PBMC de donants sans o pacients amb melanoma, la proporció de cèl·lules Treg que expressen CTLA-4 entre les cèl·lules CD4 més T va ser es va reduir significativament de manera dependent de la dosi, mentre que el mAb Fc silenciós no va mostrar aquest efecte (Fig. 2 D i G i apèndix SI, Figs. S4 i S5).

La reducció de cèl·lules Treg, però, no va acompanyar l'expansió de les cèl·lules T CD8 més específiques de l'antigen; més aviat, el tractament va provocar una reducció profunda de la proporció de cèl·lules Tet més CD8 més T entre les cèl·lules CD8 més T (Fig. 2H). En aquestes estimulacions in vitro, IgG1 no modificada o mAb anti-CTLA -4 Fc silenciós no van mostrar una activitat significativa d'esgotament d'eTreg (Fig. 2I). El grau de reducció de cèl·lules eTreg per aquests mAb es va correlacionar de fet amb la reducció de les cèl·lules CD8 més T específiques de l'antigen, independentment de l'antigen estimulant, per exemple, el pèptid Melan-A o CMV (Fig. 2I).

Així, mentre que les cèl·lules Treg expressen constitutivament CTLA-4, especialment CTLA-4 intracel·lular, l'estimulació d'antigen expandeix les cèl·lules CD8 més T que expressen nivells elevats de CTLA-4, especialment a la superfície cel·lular. El mAb ART-Fc anti-CTLA-4 amb una alta activitat ADCC és, per tant, capaç d'esgotar no només CTLA-4 més cèl·lules Treg, sinó també CTLA-4 activat per antigen més CD8 més cèl·lules T . Aquest efector CD8 més l'esgotament de cèl·lules T pot compensar un efecte de millora immune de l'esgotament de cèl·lules eTreg en les respostes immunitàries in vitro.

Fig. 2. L'estimulació peptídica in vitro simultània amb el mAb ART-Fc anti-CTLA-4 restringeix les respostes de cèl·lules T CD8 més específiques de l'antigen. (A) Resum de les substitucions d'aminoàcids realitzades a la porció Fc del mAb anti-CTLA-4 IgG1 humà (clon MDX-010, ipilimumab) per generar mAbs ART-Fc o Fc silenciós, i les seves afinitats a Fc RIIb inhibidor o Fc RIIIa activador. L'afinitat silenciosa-Fc mAb estava per sota del límit de detecció de l'assaig BIACORE. (B) Activitat ADCC de diversos mAb anti-CTLA4 contra cèl·lules CHO que expressen CTLA-4 humanes. Anti-CTLA-4 mAb (ART, anti-CTLA-4 ART-Fc millorat amb ADCC; IgG1, anti-CTLA-4 IgG1 no modificat convencional; silenciós, anti-inactivat per la regió Fc CTLA-4 silent-Fc) es van incubar amb cèl·lules CHO i HD PBMC (n=3) a una relació E/T de 50:1. Mitjanes ± SEM. Els asteriscs indiquen diferències significatives entre cada anticòs i el Fc silenciós a les concentracions respectives per als cultius {{3{0}}h (negre) o 24-h (vermell). (C) Activitat ADCC a cada fracció cel·lular de cèl·lules T CD4 plus i CD8 plus de PBMC mitjançant mAbs ART-Fc, IgG1 o silenci-Fc anti-CTLA-4 (n=4 o 5). S'indiquen les freqüències de cèl·lules mortes entre les cèl·lules preetiquetades amb CTV després del cultiu de {{40}}h. (D) Expressió CTLA-4 de Fr. II Cèl·lules Treg després de 9 dies d'estimulació del pèptid Melan-A i 1 ug/ml de tractament amb mAb ART-Fc, Fc silenciós o IgG1 anti-CTLA-4 a PBMC sencers (n {{50 }}). (E i F) Expressions superficials de CTLA-4 per cèl·lules T Tet plus i Tet− CD8 plus després de les estimulacions peptídiques indicades. Histogrames representatius (E) i resum de la intensitat de fluorescència mitjana (MFI) (F) (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Grip, n=3; ESO{{ 57}}, n=4). (G i H) Gràfiques i freqüències representatives de Fr. II Cèl·lules eTreg (G) i cèl·lules CD8 més T (H) específiques de l'antigen de pacients amb HD (n=6) o melanoma (n=5) després del cultiu amb pèptid indicat i 1 ug/mL d'ART -Fc anti–CTLA-4 mAb com a D. (I) Quantificació de la freqüència de cèl·lules Treg (superior) i Tet més CD8 més cèl·lules T (inferior) després de 9 d d'estimulació de l'antigen Melan-A o CMV a PBMC HD amb mAbs anti-CTLA-4 indicats a G i H. Mitjans ± SEM. La importància representada entre els dos grups es va calcular mitjançant la prova t aparellada, ANOVA unidireccional o ANOVA bidireccional amb la prova HSD de Tukey post hoc. *P Menor o igual a 0,05, **P Menor o igual a 0,01, ***P Menor o igual a 0,001 i ****P Menor o igual a 0,0001.

Expansió sòlida de cèl·lules T CD8 més específiques de l'antígen mitjançant l'esgotament de cèl·lules eTreg abans de l'estimulació de l'antigen.

. A continuació, vam intentar esgotar les cèl·lules CTLA-4 més Treg abans de l'estimulació de l'antigen per evitar que les cèl·lules T CD8 més T que expressen CTLA-4 activades per antigen no matessin per mAb anti-CTLA-4. Vam cultivar PBMC sencers de donants sans o pacients amb melanoma en presència d'ART-Fc anti-CTLA-4 mAb durant 5 dies sense estimulació d'antigen, vam eliminar el mAb, després vam estimular les cèl·lules amb diversos pèptids durant 8 dies i les vam analitzar per al proporció de cèl·lules Treg i Tet més CD8 més cèl·lules T entre CD4 més cèl·lules T o CD8 més cèl·lules T, respectivament (Fig. 3A). La proporció de cèl·lules Treg FOXP3hi es va reduir significativament en 5 d amb el pretractament ART-Fc (Fig. 3A i apèndix SI, Fig. S6) i es va mantenir a un nivell baix durant l'estimulació peptídica posterior (Fig. 3B), cosa que indica que Treg. les cèl·lules no s'havien recuperat completament durant el període d'estimulació de l'antigen. Aquest pretractament ART-Fc combinat amb l'estimulació d'antigen va induir una expansió robusta de cèl·lules T CD8 més específiques de Melan-A de PBMC de donants sans i cèl·lules CD8 més T específiques de NY-ESO-1 de PBMC de pacients els teixits de melanoma dels quals expressaven NY-ESO-1 (Fig. 3C). Les cèl·lules CD8 més T específiques de CMV no es van veure molt afectades per l'esgotament de Treg mediat per ART-Fc. En contrast amb ART-Fc, el mAb silenciós-Fc anti-CTLA-4 no va alterar la freqüència de les cèl·lules Treg i no va poder expandir les cèl·lules Tet més CD8 més T independentment de l'espècie d'antigen (Fig. 3D).

Un dels diferents mecanismes de supressió utilitzats per les cèl·lules Treg és la regulació a la baixa depenent de CTLA-4 de l'expressió de CD80 i CD86 per les cèl·lules dendrítiques (DC) (14, 15). Per investigar les possibles contribucions d'aquest mecanisme a l'expansió de les cèl·lules CD8 més T específiques de l'antigen propi/tumoral després del tractament in vitro amb ART-Fc anti-CTLA-4 mAb, es va avaluar l'expressió de CD80 i CD86 mitjançant Els DC, que es van definir fenotípicament com Lin-1− CD11c més HLA-DR plus , en PBMC de donants sans. Tant l'expressió CD80 com CD86 van mostrar una regulació positiva diferent en el grup pretractat amb ART-Fc, en contrast amb l'expressió CD80/CD86 no alterada en una IgG1- pretractada i silenciosa sense modificar. –grup pretractat, o no tractat (Fig. 3E). A més, el grau d'afinitats d'unió a Fc R dels mAb tenia una bona correlació amb la seva activitat d'esgotament de Treg i també amb Tet més CD8 més activitat induïdora de cèl·lules T (Fig. 3F). Com que el simple bloqueig de CTLA-4 per Fc silenciosa no va regular a l'alça CD80/86, els resultats van indicar que l'esgotament de Treg per ART-Fc va activar DC, tot i que existeix la possibilitat que l'ART-Fc en si mateix contribueixen, a més, a l'activació de DC mitjançant la unió d'alta afinitat als seus receptors Fc activadors.

En conjunt, aquests resultats indiquen que l'esgotament de Treg per ART-Fc anti-CTLA-4 mAb diversos dies abans de l'exposició a l'antigen pot evitar la mort de CTLA-4 més les cèl·lules CD8 i T activades per l'antigen per part de l'anticòs, ampliant-los, almenys en part, mitjançant la millora de l'expressió CD80/CD86 per part dels APC.

Fig. 3. El preesgotament de cèl·lules Treg utilitzant l'AcM ART-Fc anti-CTLA-4 millora les respostes de cèl·lules T CD8 més específiques de l'antigen propi/tumoral. (A-D) Les cèl·lules CD8 més T específiques de l'antigen es van induir a partir de PBMC sencers de HD (n=7) o pacients (n=5) ​​després de 5 d de pretractament amb ART-Fc anti-CTLA{ {11}} mAb. (A) Esquema de l'experiment i tinció representativa de FOXP3 i CD45RA de cèl·lules CD4 més T el dia -5 i el dia 0 de l'experiment. Resum de Fr. II Freqüències eTreg al dia 0 (a baix). (B i C) Tinció representativa de FOXP3 de cèl·lules CD4 més T (B) i cèl·lules CD8 més T específiques d'antigen (C) amb o sense pretractament ART-Fc per a cada pèptid després del cultiu. Resum de les freqüències de cèl·lules T CD8 i T específiques de Treg i antigen després del cultiu (inferior). (D) Resum de Fr. II eTreg i Tet més CD8 més freqüències de cèl·lules T amb pretractament de mAb anti-CTLA{27}} Fc silenciós en lloc d'ART-Fc com en A-C. (E) Nivells d'expressió de CD80 i CD86 per Lin{-1-CD11c més HLA-DR més DC després de 5 d d'estimulació Melan-A amb el pretractament dels anti-CTLA indicats -4 mAbs (n=6). Els números dels histogrames mostren MFI. (F) Resum de les freqüències de Treg i Tet més CD8 més cèl·lules T després del pretractament amb mAbs anti-CTLA-4 indicats seguits de l'estimulació de Melan-A26-35 com a A-C. Mitjanes ± SEM. La significació representada entre els dos grups es va calcular mitjançant la prova t aparellada. *P Menor o igual a 0,05.

CTLA-4: l'esgotament de Treg mediat abans de la vacunació amb antígens tumorals millora les respostes antitumorals en ratolins.

Per validar en ratolins les troballes in vitro amb PBMC humans i mAbs anti-CTLA-4 humans, vam generar mAbs amb un ADCC alt o baix i una activitat de fagocitosi cel·lular dependent d'anticossos (ADCP) a partir de CTLA{{4} anti-ratolí. }} mAb (clon UC10) de l'isotip IgG2a (anomenat d'ara endavant mIgG2a) per substitució d'aminoàcids al domini Fc (Fig. 4A). La mutació S239D en ambdues cadenes pesades va augmentar l'afinitat per Fc RIV del ratolí ∼set vegades (variant mFa55 mIgG2a), mentre que les mutacions L235R, G236R i S239K en ambdues cadenes pesades les van fer no vinculades a Fc Rs del ratolí (variant mFa31 mIgG2a); el primer es deia ratolí ADCC/ADCP-enhanced-Fc (millorat), el segon mAb silenciós-Fc del ratolí (mSilent). Per comparar l'activitat antitumoral d'aquests mAbs anti-ratolí-CTLA-4 modificats amb Fc en combinació amb la vacunació amb antigen tumoral, vam inocular per via subcutània a ratolins BALB/c cèl·lules de fibrosarcoma CMS5a que expressaven l'antigen humà NY-ESO-1, i el dia 9, quan es va establir el tumor, es va tractar els ratolins amb 100 ug de cada mAb i es va vacunar amb pèptid NY-ESO-1 el mateix dia (dia 9; d'ara endavant anomenem el protocol "tractament concurrent"). o 3 dies més tard (dia 12; d'ara endavant "Pretractament Ab") (Fig. 4B). El pretractament d'Ab amb mAb mEnhanced va ser més eficaç que el tractament simultània o el pretractament amb mIgG2a o mSilent mAb en el retard del creixement del tumor; els efectes dels dos darrers mAb sobre el creixement del tumor eren baixos i no significativament diferents entre el pretractament d'Ab i el tractament concurrent (Fig. 4C). La supervivència va ser significativament millor en ratolins pretractats amb mAb mEnhanced, i també en ratolins amb tractament simultània o pretractament amb mIgG2a, tot i que cap de les maneres de tractament amb mIgG2a no va aconseguir la regressió del tumor en la majoria dels ratolins (Fig. 4 C i D).

Fig. 4. El pretractament amb mAb anti-CTLA-4 millorat amb ADCC/ADCP indueix forts efectes antitumorals en ratolins. (A) Resum de les substitucions d'aminoàcids realitzades a la porció Fc del mAb anti-ratolí CTLA-4 IgG2a (clon UC10; mIgG2a) per generar ADCC/ADCP-anti-ratolí-CTLA{{ Es mostren els mAbs 10}} (millorat) o silenciós Fc anti-ratolí-CTLA-4 (mSilent) i les seves afinitats amb el Fc RIV del ratolí. L'afinitat mAb mSilent estava per sota del límit de detecció de l'assaig BIACORE. (B– D) Esquema de l'experiment (B). Els ratolins van ser desafiats amb 2 × 106 fibrosarcoma CMS5a que expressava NY-ESO humà-1 el dia {{4{0}}, i es van deixar sense tractar o tractats amb mEnhanced, mIgG2a o silenciós mAb anti-ratolí-CTLA-4 el dia 9. La vacunació de NY-ESO-181–88 pèptids barrejats amb CFA es va realitzar el mateix dia (dia 9, tractament simultània) o 3 dies més tard (dia 12, pretractament Ab). Creixement del tumor de cada ratolí amb una línia en negreta que indica la mitjana de cada grup de tractament (C) (n=8-13 per grup). Resum del creixement mitjà del tumor de cada grup de tractament (D, esquerra). Els asteriscs indiquen valors P entre el grup de pretractament mAb millorat mitjançant ANOVA bidireccional amb la prova de comparació múltiple de Tukey. Resum de la taxa de supervivència (D, dreta) de cada grup de tractament. Els valors de P entre la supervivència de cada grup i la supervivència del control de la vacuna sola es van calcular mitjançant una prova de rang logarítmic. L'esdeveniment de mort correspon a una longitud del tumor superior o igual a 200 mm o la mort del ratolí. *P Menor o igual a 0,05, **P Menor o igual a 0,01, ***P Menor o igual a 0,001 i ****P Menor o igual a 0,0001.

El pretractament millorat amb mAb també va donar lloc a un augment significatiu del nombre de cèl·lules T CD8 més infiltrades en el tumor i la relació CD8/Treg en TIL, tot i que el percentatge de cèl·lules FOXP3 més entre les cèl·lules CD4 més T va augmentar lleugerament (Fig. 5 A–). C). A més, mentre que la freqüència de CD8 més TIL específics del pèptid de NY-ESO-1 no va ser estadísticament diferent entre els ratolins tractats amb cada mAb o entre el pretractament i el tractament concurrent, el CD8 més TIL específic de l'antigen del mAb millorat es va tractar prèviament. els ratolins, en comparació amb altres grups, van mostrar una producció significativament més activa d'IL-2 i IFN després de la reestimulació in vitro amb el pèptid NY-ESO-1 (Fig. 5 D i E). A més, la memòria efectora CD8 més cèl·lules T definides com la població CD44highCD62Llow va augmentar significativament entre els CD8 més TIL específics de NY-ESO-1 en ratolins pretractats amb mAb millorats (Fig. 5 F i G).

En conjunt, el pretractament mAb millorat va ser més eficaç per evocar la immunitat tumoral, seguit del pretractament amb mIgG2a, que tenia certa activitat ADCC, mentre que mSilent mAb va ser molt menys efectiu. Els resultats indiquen que el pretractament de ratolins portadors de tumors amb mAb anti-CTLA-4 millorat amb ADCC/ADCP seguit de la vacunació amb antigen tumoral pot evocar efectivament respostes immunes antitumorals in vivo.

Discussió

Les principals troballes d'aquest informe són: (i) les cèl·lules eTreg altament supressives i diferenciades terminalment són abundants en els teixits tumorals i expressen CTLA de superfície-4 a nivells més alts que les cèl·lules CD8 més T que infiltran el tumor; (ii) mAb anti-CTLA-4 amb una alta activitat ADCC és capaç d'esgotar/reduir les cèl·lules CTLA-4eTreg altes i CTLA{-4 més les cèl·lules efectores CD8 més T; i (iii) el mAb anti-CTLA-4 que esgota les cèl·lules pot evocar i millorar la immunitat tumoral efectiva quan el règim de tractament d'anticossos està dissenyat per no afectar CTLA-4 més les cèl·lules efectores CD8 més T, per exemple, mitjançant alterant el moment de l'esgotament de les cèl·lules Treg i la vacunació de l'antigen del càncer.

L'activitat ADCC del mAb anti-CTLA-4 és un determinant clau de l'eficàcia de la reducció d'eTreg i l'expansió resultant de les cèl·lules T CD8 més reactives al tumor. Donant suport a la idea, vam demostrar que mAb anti-CTLA-4 (ART-Fc) amb una activitat ADCC millorada (i/o activitat ADCP en ratolins) era capaç d'augmentar les respostes immunes antitumorals in vitro en humans i in vivo en humans. ratolins esgotant les cèl·lules Treg que expressen CTLA-4. Els mAbs anti-CTLA4 (Fc silenciós) modificats per mostrar molt menys o cap activitat ADCC no van mostrar aquesta activitat antitumoral, fins i tot si posseïen la mateixa especificitat per a un epítop de la molècula CTLA-4. Encara no està clar en humans si l'efecte antitumoral de l'ipilimumab amb la porció Fc d'IgG1 s'atribueix al bloqueig de la molècula CTLA4 o a l'esgotament de les cèl·lules que expressen CTLA-4 per ADCC. Es va demostrar en ratolins que una millora de la immunitat antitumoral mitjançant un mAb anti-CTLA-4 requeria l'esgotament de les cèl·lules Treg infiltrades en el tumor mitjançant l'ADCC mediat per Fc R (19–21, 26, 27). De la mateixa manera, es va demostrar que els anticossos contra les molècules GITR, OX40 i CD25, en les quals les cèl·lules Treg infiltrades en el tumor expressen les quantitats més altes, depenen de l'esgotament de cèl·lules Treg mediada per ADCC en el rebuig del tumor (19, 26, 28). També es va informar que el tractament amb ipilimumab en pacients amb melanoma va reduir significativament les cèl·lules FOXP3 més Treg als teixits tumorals, especialment en els que responen a la clínica (29).

A més, un informe recent ha demostrat que, entre els pacients amb melanoma amb una càrrega de mutació tumoral elevada, els que genèticament tenien una variant d'alta afinitat de Fc RIIIa amb ADCC millorat (variant V158, a diferència de la variant de baixa afinitat F158) van mostrar significativament millors. respostes clíniques al tractament amb ipilimumab i millor supervivència global (27). Aquesta troballa dóna suport a la idea que mAb anti-CTLA-4 amb una millor activitat d'esgotament de Treg pot ser més eficaç que l'ipilimumab en la immunoteràpia contra el càncer. Per tant, és probable que el mAb ART-Fc anti-CTLA4, que posseeix una gran afinitat per la variant V158 (KD=3,7 × 10−10 M, en comparació amb 3,1 × 10−6 M per a ipilimumab o IgG1) , pot tenir una millor eficàcia clínica en la immunoteràpia contra el càncer mitjançant l'esgotament de les cèl·lules Treg. En conjunt, aquestes troballes en humans i ratolins indiquen que mAb anti-CTLA-4 d'ADCC/ADCP alt pot ser eficaç per evocar i millorar la immunitat tumoral mitjançant l'esgotament de les cèl·lules Treg.

Fig. 5. Respostes de cèl·lules T CD8 més específiques d'Ag induïdes en ratolins portadors de tumors mitjançant un pretractament amb mAb anti-CTLA-4 millorat amb ADCC/ADCP. (A-G) Els TIL de la figura 4 es van analitzar 19 dies després de la implantació del tumor (n=4-6 per grup). El nombre de cèl·lules T infiltrades per gram de tumor (A). Relació de cèl·lules CD8/Treg (B). Freqüència de cèl·lules Foxp3 més Treg entre les cèl·lules CD4 més T (C). Gràfics representatius de IL-2 més IFN- més CD8 més cèl·lules T (D). La producció de citocines es va mesurar reestimulant els TIL amb pèptids ESO-181–88 in vitro durant 5 h. Resum de Tet més CD8 més cèl·lules T al tumor i IL{{20}} més IFN- més CD8 més cèl·lules T a D després de la reestimulació (E). Gràfics representatius (F) i resum (G) de les expressions CD44 i CD62L per NY-ESO-1-Tet més CD8 més cèl·lules T al tumor de cada grup de tractament. Les dades es van obtenir de tres experiments independents. Valors P entre Naïve o EM CD8 més subconjunts de cèl·lules T de cada condició. Mitjanes ± SEM. *P Menor o igual a 0.05, † P Menor o igual a 0.05, **P Menor o igual a 0,01, ††P Menor o igual a 0,01, i ***P Menor o igual a 0,001 per ANOVA bidireccional amb la prova de comparació múltiple de Tukey.

Materials i mètodes

Mostres de donants.

Es van obtenir mostres de sang perifèrica d'individus sans o pacients amb melanoma en estadi III a IV. Els PBMC es van aïllar per gradient de densitat amb Ficoll-Paque (GE Healthcare). Els TIL es van obtenir a partir de teixits de melanoma resecats. El tumor es va picar i les suspensions unicel·lulars generades després d'una suau dissociació MACS (Miltenyi) es van preparar filtrant a través d'un colador cel·lular de 40- μm. Tots els donants van proporcionar un consentiment informat per escrit abans del mostreig d'acord amb la Declaració d'Hèlsinki. El present estudi va ser aprovat per la Junta de Revisió Institucional de la Universitat d'Osaka.

Anàlisi CyTOF.

Els TIL i els esplenòcits de ratolins portadors de tumors es van enriquir per a cèl·lules CD3 més i es van tenyir amb 198-cisplatina per a la discriminació de cèl·lules mortes i un panell d'anticossos que inclouen els anticossos conjugats amb metalls següents: 172Yb-CD4 (RM{4-5 ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC{-10), 158GdFOXP3 (FJK{-16s). Per als PBMC i els TIL humans, les suspensions cel·lulars es van codificar amb anticossos anti-CD45 amb diversos conjugats metàl·lics, tal com es va descriure anteriorment (35), abans de tenyir-se amb 198-cisplatí per a la discriminació de cèl·lules mortes i després tinció d'anticossos amb el panell següent. Els anticossos conjugats amb metall es van obtenir de Fluidigm o el kit d'etiquetatge d'anticossos Maxpar (Fluidigm) es va utilitzar segons les instruccions del fabricant per conjugar anticossos purificats: 89Y-CD45 (clon: HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend), 175Yb- Es van utilitzar anticossos CD45 (HI30; Biolegend) per codificar diferents mostres de barres; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-Biotina (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 Cd)-CD8a (RPA) -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; Fluidigm), 145Nd-TCD44 ; Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C398.4A); Fluidigm; , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R+D Systems), 156Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R+D Systems), 156Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm), 1654Dx2; CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL{-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3,9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL{-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy-CTLA-4 (14Dy-CTLA-4; Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) i 168Er-Ki-67 (Ki{-67; Fluidigm).

Les cèl·lules humanes i de ratolí es van arreglar amb eBioscience Foxp3/tampons de tinció del factor de transcripció (ThermoFisher) abans de la tinció intracel·lular. Les cèl·lules tacades es van tornar a suspendre en un 2% de PFA amb un intercalador d'ADN de 191/193-iridi (Fluidigm) durant la nit, després es van rentar i es van tornar a suspendre en aigua Maxpar (Fluidigm) i perles de quatre elements EQ (Fluidigm) immediatament abans de l'anàlisi amb Helios CyTOF. sistema (Fluidigma). Les dades normalitzades es van analitzar amb Cytobank Premium.

Estimulació de cèl·lules T CD8 més específiques d'antígens.

Es van estimular PBMC sencers d'individus sans i pacients amb melanoma amb 10 μM de pèptids curts específics per a HLA-A*0201 (Operon Biotechnology) durant 8–9 dies: Melan-A26–35 (EAAGIGILTV), CMV495–503 (NLVPMVAVV), Flu58 –66 (GILGFVFTL) o NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). Per determinar l'efecte del mAb anti-CTLA-4 amb diversos ADCC, es va afegir un dels següents mAb al cultiu a 1 ug/ml (tret que s'indiqui el contrari) el mateix dia o 5 dies abans de l'estimulació de l'antigen: ADCC -IgG1 anti-CTLA-4 humà millorat (MDX-010-ART-Fc), anti-CTLA-4 IgG1 convencional no modificat (MDX{-010-IgG1) o Fc silenciosa Anticossos anti-CTLA-4 IgG1 (MDX{-010-silenciosa-Fc): Chugai Pharmaceutical va proporcionar amablement tots els mAb. La meitat del medi es va substituir per un medi fresc que contenia 10 U/mL IL-2 i 40 ng/mL IL-7 cada 3 dies.

Assaig d'alliberament de lactat deshidrogenasa amb cèl·lules CHO que expressen CTLA humana-4.

Es va realitzar un assaig d'alliberament de lactat deshidrogenasa (LDH) per determinar l'activitat ADCC en PBMC. Les cèl·lules CHO DG44-hCTLA4 (de Chugai Pharmaceutical) es van sembrar a 96-plaques de fons rodó (1 × 104 cèl·lules per pou) i es van incubar amb diverses concentracions de mAbs durant 15 min. Els PBMC obtinguts de donants sans es van afegir al cultiu amb una relació efector-objectiu (E∕T) de 50:1. Les cèl·lules es van incubar a 37 graus, 5 per cent de CO2 durant 6 o 24 h, es van recollir 100 μL del sobrenedant de cada pou i es va mesurar l'absorbància de 492 nm i 630 nm mitjançant Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Instruments). Es va considerar que l'alliberament de LDH era màxim després de la incubació de les cèl·lules en una solució de Nonidet P-40 a l'1 per cent. La citotoxicitat (per cent) es va determinar a partir de la fórmula; (AC)∕(BC) × 100, on A, B i C representen l'alliberament de LDH de cada experiment, l'alliberament màxim de LDH i l'alliberament de LDH de fons, respectivament. Tots els experiments es van realitzar per duplicat.

Assaig ADCC amb PBMC humà recentment aïllat.

Els PBMC de donants sans es van classificar FACS per a cada fracció de cèl·lules T i Treg es van marcar prèviament amb CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher) i es van cultivar amb cèl·lules no T, com a cèl·lules efectores, amb una proporció objectiu-efector d'1:50. A continuació, es va afegir 1 ug/mL de mAb anti-CTLA-4 indicat al sèrum AB humà al 10 per cent que contenia medi RPMI1640 amb 5 UI/mL IL-2. Després de cultiu de 24-h a 37 graus, la freqüència de cèl·lules mortes, indicada per la tinció fixable LIVE/DEAD (ThermoFisher), entre les cèl·lules CTV plus es va avaluar per FACS.

Experiments de tumors murins.

Es van comprar ratolins BALB/c de sis a 7-setmanes a CLEA Japó i es van mantenir en condicions específiques lliures de patògens. Els ratolins van ser desafiats per via subcutània amb 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1. Nou dies després de la implantació del tumor, els ratolins van rebre 100 ug de mAb anti-ratolí-CTLA4 (clon UC-10; mIgG2a, mEnhanced o mSilent, de Chugai Pharmaceutical) per via intravenosa. La variant mEnhanced (variant mFa55 mIgG2a) es va generar per la mutació S239D al domini CH2 i mostra una afinitat d'unió millorada amb el Fc RIV del ratolí aproximadament set vegades en comparació amb la mIgG2a de tipus salvatge. Els ratolins es van tractar amb la vacunació de 100 ug d'ESO-181–88 pèptids (Operon Biotechnology) barrejats amb 200 μL de CFA/PBS (proporció 1:1) ja sigui el mateix dia (dia 9, tractament simultània) o 3. d més tard (dia 12, pretractament Ab) per via subcutània. La mida del tumor es va mesurar cada 3-4 d. Els experiments van ser aprovats per la Junta de Revisió Institucional i es van dur a terme d'acord amb la normativa de la Universitat d'Osaka.

Citometria de flux.

Tal com es va descriure anteriorment (12, 23), les cèl·lules CD8 més T específiques d'antigen generades in vitro es van tenyir amb Melan-A, CMV o tetràmer de la grip (TC Matrix) o NY-ESO marcat amb PE-1 tetràmer (MBL) durant 10 min a 37 graus, i després es tenyeix amb diversos mAb de superfície. Per a la tinció de la superfície CTLA-4 en aquest estudi, es va utilitzar un anticòs CD152 biotinilat-anti-humà (clon BNI3; BD Biosciences) a 4 graus durant 15 min amb altres anticossos contra molècules de superfície. Després del rentat, vam afegir APC-estreptavidina (Biolegend) també a 4 graus durant 15 minuts per evitar la tinció de les molècules de CTLA-4 exterioritzades a la superfície després d'una condició de tinció prolongada a 37 graus. Aquests procediments de tinció es van realitzar abans de la fixació i la permeabilització, tal com es descriu al nostre estudi anterior (24).

La tinció intracel·lular de FOXP3 es va realitzar mitjançant el conjunt FOXP3 Transcription Factor Staining Buffer (eBioscience). Es van utilitzar els anticossos següents amb etiquetes fluorescents indicades per a la tinció de cèl·lules humanes: PerCP/Cy5.5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), biotina-CTLA-4 (BNI3) ; BD Biosciences), APC-Streptavidin (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegged), AlexaFluor700-CD4 (RPA) -T4; eBioscience), barreja FITC-Lineage (BD Biosciences), PerCP/Cy5.5-CD11c (3.9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) i colorant de viabilitat fixable eFluor780 (eBioscience). Es van utilitzar els anticossos següents per tenyir cèl·lules de ratolí: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy{7-CD3e ({145-2C11; eBioscience), eFluor 450-CD4 (RM{4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK{-16s; eBioscience), FITC-IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL{-2 (JES{6-5H4; eBiosciences) i colorant de viabilitat fixable eFluor780 (eBioscience). Les cèl·lules TIL CD8 més T de ratolins específiques de l'antigen es van tacar amb tetràmers ESO-181-88 marcats amb PE i H-2Dd restringits (TC Matrix), tal com es descriu anteriorment. Per mesurar la producció de citocines a partir de cèl·lules T CD8 més, es van reestimular els TIL de ratolí durant 5 h a 37 graus en presència de 10 μM dels mateixos pèptids ESO-181-88 utilitzats per a una vacunació amb GolgiPlug (BD Bioscience). La fixació i la permeabilització es van realitzar amb el conjunt de tampons Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience). Les cèl·lules es van adquirir amb LSR Fortessa (BD Bioscience) i es van analitzar mitjançant el programari FlowJo v9.9.5.

Anàlisi estadística

Es va utilitzar la prova t de dues cues per avaluar la importància entre els dos grups. Es va utilitzar ANOVA unidireccional o bidireccional amb la prova de diferència significativa honesta (HSD) de Tukey post hoc per comparar diversos grups. Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant el programari Prism v6 (GraphPad). Els valors de p < 0,05 es van considerar significatius.

AGRAÏMENTS.

Donem les gràcies als membres del Departament de Dermatologia de la Facultat de Medicina de la Universitat d'Osaka per la recollida de mostres de pacients; i K. Teshima, T. Shimizu i N. Mizoguchi per a l'assistència tècnica. Chugai Pharmaceutical Co., Ltd va generar i proporcionar anticossos CTLA-4 anti-humà i ratolí Fcengineered. Aquest estudi va comptar amb el suport de Grant-in-Aid for Specially Promoted Research 16H06295 (a SS), Grants-in-Aid. per a la investigació científica (A) 26253030 (a SS) i (B) 26290054 (a HN), Grantin-Aid per a desafiar la investigació exploratòria 26670581 (a HN) i Grant-inAid per a joves científics (B) 26860331 i 23K (a 157) A. Tanaka) del Ministeri d'Educació, Cultura, Esports, Ciència i Tecnologia del Japó; i Core Research for Evolutional Science and Technology de l'Agència de Ciència i Tecnologia del Japó (SS). Aquest estudi es va dur a terme en part com a programa d'investigació del Projecte per al desenvolupament de la investigació innovadora en terapèutica del càncer (P-DIRECT) i la recerca pràctica per al control innovador del càncer i el projecte per a la investigació del càncer i l'evolució terapèutica (P-CREATE) pel Japó. Agència d'Investigació i Desenvolupament Mèdic.

1. Sakaguchi S (2004) Cèl·lules T reguladores CD4 més naturals per a l'autotolerància immunològica i el control negatiu de les respostes immunes. Annu Rev Immunol 22:531–562.

2. Zou W (2006) Cèl·lules T reguladores, immunitat tumoral i immunoteràpia. Nat Rev Immunol 6:295–307.

3. Tanaka A, Sakaguchi S (2017) Cèl·lules T reguladores en la immunoteràpia contra el càncer. Res cel·lular 27: 109–118.

4. Quezada SA, Peggs KS, Curran MA, Allison JP (2006) El bloqueig de CTLA4 i la immunoteràpia combinada GM-CSF altera l'equilibri intratumoral de les cèl·lules T efectores i reguladores. J Clin Invest 116: 1935–1945.

5. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S (1999) Inducció de la immunitat tumoral eliminant les cèl·lules CD25 més CD4 més T: una base comuna entre la immunitat tumoral i l'autoimmunitat. J Immunol 163:5211–5218.

6. Wolf AM, et al. (2003) Augment de les cèl·lules T reguladores a la sang perifèrica dels pacients amb càncer. Clin Cancer Res 9:606–612.

7. Curiel TJ, et al. (2004) El reclutament específic de cèl·lules T reguladores en el carcinoma d'ovari fomenta el privilegi immune i prediu una supervivència reduïda. Nat Med 10:942–949.

8. Petersen RP, et al. (2006) Foxp3 que infiltra el tumor i les cèl·lules T reguladores s'associen amb la recurrència en pacients amb NSCLC en estadi patològic I. Càncer 107:2866–2872.

9. Shang B, Liu Y, Jiang SJ, Liu Y (2015) Valor pronòstic de FoxP3 que infiltra el tumor més cèl·lules T reguladores en càncers: una revisió sistemàtica i metaanàlisi. Sci Rep 5:15179.

10. Miyara M, et al. (2009) Dinàmica de delimitació i diferenciació funcional de cèl·lules CD4 més T humanes que expressen el factor de transcripció FoxP3. Immunitat 30:899–911.

11. Wing JB, et al. (2017) Una subpoblació diferent de cèl·lules reguladores T-fol·liculars CD25− es localitza als centres germinals. Proc Natl Acad Sci USA 114:E6400–E6409.

12. Saito T, et al. (2016) Dues subpoblacions de cèl·lules T FOXP3(plus)CD4(plus) controlen clarament el pronòstic dels càncers colorectals. Nat Med 22:679–684.

13. Sugiyama D, et al. (2013) Anti-CCR4 mAb esgota selectivament FoxP3 de tipus efector més CD4 més cèl·lules T reguladores, evocant respostes immunes antitumorals en humans. Proc Natl Acad Sci USA 110:17945–17950.

14. Shevach EM (2009) Mecanismes de foxp3 més supressió mediada per cèl·lules reguladores T. Immunitat 30:636–645.

15. Ala K, et al. (2008) Control CTLA-4 sobre Foxp3 més la funció reguladora de les cèl·lules T. Science 322:271–275.

16. Qureshi OS, et al. (2011) Trans-endocitosi de CD80 i CD86: una base molecular per a la funció extrínseca cel·lular de CTLA-4. Science 332:600–603.

17. Hodi FS, et al. (2010) Millora de la supervivència amb ipilimumab en pacients amb melanoma metastàtic. N Engl J Med 363:711–723.

18. Robert C, et al. (2011) Ipilimumab més dacarbazina per al melanoma metastàtic no tractat prèviament. N Engl J Med 364:2517–2526.

19. Bulliard Y, et al. (2013) L'activació dels receptors Fc contribueix a les activitats antitumorals dels anticossos dirigits al receptor immunoregulador. J Exp Med 210:1685–1693.

20. Simpson TR, et al. (2013) L'esgotament depenent de Fc de les cèl·lules T reguladores que infiltren el tumor co-defineix l'eficàcia de la teràpia anti-CTLA-4 contra el melanoma. J Exp Med 210:1695–1710.

21. Selby MJ, et al. (2013) Els anticossos anti-CTLA-4 de l'isotip IgG2a milloren l'activitat antitumoral mitjançant la reducció de les cèl·lules T reguladores intratumorals. Càncer Immunol Res 1: 32–42.

22. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Receptors Fcgamma com a reguladors de les respostes immunes. Nat Rev Immunol 8:34–47.

23. Mimoto F, et al. (2013) Nova variant Fc d'anticossos dissenyada asimètricament amb afinitat i especificitat d'unió a Fc R superiors en comparació amb la variant Fc fucosilada. MAbs 5:229–236.

24. Maeda Y, et al. (2014) Detecció de cèl·lules T CD8 més autorreactives amb un fenotip anèrgic en individus sans. Ciència 346: 1536–1540.

25. Gnjatic S, et al. (2006) NY-ESO-1: revisió d'un antigen tumoral immunogènic. Adv Cancer Res 95:1–30.

26. Arce Vargas F, et al.; Melanoma Consorci TRACERx; Consorci Renal TRACERx; Lung TRACERx Consortium (2017) L'anti-CD25 optimitzat amb Fc esgota les cèl·lules T reguladores que infiltren el tumor i fa sinergia amb el bloqueig de PD-1 per eradicar els tumors establerts. Immunitat 46:577–586.

27. Arce Vargas F, et al.; Melanoma TRACERx; TRACERx Renal; Consorcis pulmonars TRACERx (2018) La funció efectora Fc contribueix a l'activitat dels anticossos humans anti-CTLA-4. Cèl·lula del càncer 33:649–663.e4.

28. Bulliard Y, et al. (2014) El compromís OX40 esgota els Tregs intratumorals mitjançant l'activació de Fc Rs, donant lloc a l'eficàcia antitumoral. Immunol Cell Biol 92:475–480.

29. Romano E, et al. (2015) Citotoxicitat mediada per cèl·lules depenent d'ipilimumab de cèl·lules T reguladores ex vivo per monòcits no clàssics en pacients amb melanoma. Proc Natl Acad Sci USA 112:6140–6145.

30. Walker LSK, Sansom DM (2011) El paper emergent de CTLA4 com a regulador extrínsec cel·lular de les respostes de les cèl·lules T. Nat Rev Immunol 11:852–863.

31. Linsley PS, et al. (1996) Tràfic intracel·lular de CTLA-4 i localització focal cap a llocs d'interacció amb TCR. Immunitat 4:535–543.

32. Egen JG, Allison JP (2002) L'acumulació d'antigen de limfòcits T citotòxics-4 a la sinapsi immunològica està regulada per la força del senyal TCR. Immunitat 16:23–35.

33. Ko K, et al. (2005) Tractament de tumors avançats amb mAb anti-GITR agonistes i els seus efectes sobre Foxp3 més CD25 més CD4 més cèl·lules T reguladores que infiltran el tumor. J Exp Med 202: 885–891.

34. Prieto PA, et al. (2012) Bloqueig de CTLA-4 amb ipilimumab: seguiment a llarg termini de 177 pacients amb melanoma metastàtic. Clin Cancer Res 18:2039–2047.

35. Mei HE, Leipold MD, Schulz AR, Chester C, Maecker HT (2015) Codificació de barres de cèl·lules mononuclears de sang perifèrica humana vives per a citometria de massa multiplexada. J Immunol 194:2022–2031.

Danbee Haa,b, Atsushi Tanakaa, Tatsuya Kibayashia,c, Atsushi Tanemurad, Daisuke Sugiyamaa,1, James Badger Winga, Ee Lyn Lima, Karen Wei Weng Tenge, Dennis Adeegbea,2, Evan W. Newelle, Nishiro Hiyarokawashi,Ichiro 1,3 i Shimon Sakaguchia,b,4.

un Immunologia Experimental, Immunology Frontier Research Center, Universitat d'Osaka, 565-0871 Osaka, Japó; b Laboratori d'Immunologia Experimental, Departament de Ciència i Enginyeria de la Regeneració, Institut de Ciències Mèdiques i de la Vida de Frontera, Universitat de Kyoto, 606-8507 Kyoto, Japó; c Divisió de recerca, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Kanagawa, Japó; d Departament de Dermatologia, Escola de Postgrau en Medicina, Universitat d'Osaka, 565-0871 Osaka, Japó; i Agència electrònica de Ciència, Tecnologia i Recerca, Xarxa d'Immunologia de Singapur, 138632 Singapur.

Aportat per Shimon Sakaguchi, 23 de novembre de 2018 (enviat a revisió el 19 de juliol de 2018; revisat per Miyuki Azuma i Sergio A. Quezada).

For more information:1950477648nn@gmail.com