Diferenciació, ronyó, nefrogènesi, progenitors de nefrona,

Contacte:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

RESUM

La dotació de nefrones, definida durant el període fetal, dicta la salut renal i cardiovascular relacionada al llarg de la vida. Mostrem aquí que, malgrat els seus efectes negatius sobrecreixement del ronyó, l'augment genètic de GDNF allarga el programa nefrogènic més enllà del seu cessament normal. L'anàlisi mecanicista en diverses etapes va revelar que l'excés de GDNF manté els progenitors de la nefrona i la nefrogènesi mitjançant l'augment de l'expressió dels seus objectius secretats i la senyalització WNT augmentada, donant lloc a un efecte de dues parts en el manteniment dels progenitors de la nefrona. GDNF i anormalment altn els ronyons embrionaris augmentenels seus objectius coneguts, però també Wnt9b i Axin2, amb la desacceleració concomitant de la proliferació del progenitor de la nefrona. La disminució dels nivells de GDNF en el postnatalels ronyons es normalitzenel brot ureteric i crea un entorn permissiu per a la continuació del programa nefrogènic, tal com es demostra amb l'autorenovació i diferenciació del progenitor de nefrona postnatal morfològicament i molecularment normal. Aquests resultats estableixen que l'excés de GDNF té un efecte bifàsic sobre els progenitors de nefrona en ratolins, que poden respondre fidelment a la manipulació de la dosi de GDNF durant el període fetal i postnatal. Els nostres resultats suggereixen que detectar el nivell d'activitat de senyalització és un mecanisme important mitjançant el qual el GDNF i altres molècules contribueixen a l'especificació de la vida útil del progenitor de la nefrona.

Suplement de cistanche tubulosa vs deserticolaperalimentació renal

INTRODUCCIÓ

El ronyó dels mamífers és un òrgan que filtra la sang no regenerador amb funcions essencials de desintoxicació i equilibri d'electròlits.

Les nefrones que executen aquestes funcions neixen durant el període fetal, ja que el ronyó adult només presenta una capacitat reparadora limitada o un augment glomerular compensatori (hipertròfia) (Chawla i Kimmel, 2012; Rinkevich et al., 2014; Romagnani et al., 2013). La massa nefrona baixa congènita és un factor de risc àmpliament acceptat per a la hipertensió, la proteinúria, la glomeruloesclerosi i la malaltia renal terminal (Bertram et al., 2011; Hoy et al., 2008) i, per tant, influeix molt en la salut renal al llarg de la vida. El programa nefrogènic acaba entre les setmanes de gestació 35-37 en humans i el dia postnatal (P) 3 en el ratolí (Hartman et al., 2007; Hinchliffe et al., 1991; Ryan et al., 2018), però els mecanismes que hi contribueixen al cessament s'entenen poc. S'ha postulat que hi ha canvis específics de l'etapa en els patrons de creixement (Cebrián et al., 2004) i mecanismes intrínsecs de detecció de l'edat cel·lular (Chen et al., 2015a). Molecularment, la senyalització SMAD induïda per la proteïna morfogenètica òssia (BMP) (Brown et al., 2015), l'hamartina (Tsc1) (Volovelsky et al., 2018) i la regulació del microARN (Yermalovich et al., 2019) participen en la determinació de la nefrogènia. durada del programa. Tanmateix, la plasticitat del programa nefrogènic no s'ha explorat completament. Les nefrones es diferencien d'un conjunt de progenitors de nefrones (NP), també conegut com a mesenquima metanèfric o cap. Els NP que expressen un repertori únic de marcadors que inclouen SIX2, factor neurotròfic derivat de la línia de cèl·lules glials (GDNF) i CITED1, només estan presents al ronyó embrionari on envolten cada punta de brot uretèric (UB) des del seu establiment (Boyle et al., 2008); Self et al., 2006). El procés de nefrogènesi està sincronitzat amb la ramificació de la UB, que simultàniament manté l'auto-renovació en la població de NP indiferenciada i indueix un subconjunt de NP a experimentar una transició gradual de mesenquima a epiteli mitjançant etapes precursores ben definides (agregats pretubulars, PA; vesícules renals). , RV; cossos en forma de coma, CSB; cossos en forma de S, SSB), que finalment es diferencien en nefrones funcionals (Kobayashi et al., 2008; Lindström et al., 2018). L'equilibri en l'autorenovació versus la diferenciació dins de la població de NP depèn dels senyals que medien les interaccions recíproques del teixit inductiu que tenen lloc entre la UB i el mesènquima veí. El mesènquima metanèfric i els senyals derivats de NP, com el GDNF i els factors de creixement de fibroblasts (FGF), regulen la morfogènesi de la UB, a través de la qual el ronyó embrionari creix en grandària, aconsegueix la seva forma i estableix el sistema de conductes col·lectors (Costantini i Kopan, 2010). La senyalització RET activada per GDNF a les puntes de la UB regula un perfil transcripcional responsable del control dels progenitors del conducte col·lector i la morfogènesi de la UB (Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019; Lu et al., 2009; Ola et al., 2009. , 2011; Riccio et al., 2016). Les transcripcions regulades per GDNF també inclouen proteïnes secretades, com WNT11 i CRLF1, amb potencial demostrat per regular el programa nefrogènic (O'Brien et al., 2018; Schmidt-Ott et al., 2005). Altres reguladors de nefrogènesi derivats de la UB són els lligands WNT9b i FGF que influeixen en el manteniment i la diferenciació de NP (Barak et al., 2012; Carroll et al., 2005; Kiefer et al., 2012). Prèviament hem informat que la interrupció genètica de la regió no traduïda de Gdnf 3' provoca un augment de l'expressió 3- 6-de GDNF endògena i provoca hipoplàsia renal a causa del defecte de ramificació de la UB (Kumar et al., 2015). A diferència de la letalitat del nounat en els nocauts de Gdnf, els ratolins Gdnfhyper/hyper sobreviuen fins a 3 setmanes i han revelat el paper essencial del GDNF en la recollida de l'autorenovació del progenitor del conducte (Costantini, 2012; Kumar et al., 2015; Li et al., 2019). Aquí, demostrem que l'excés de GDNF, malgrat el seu efecte negatiu en el creixement global del ronyó, pot ampliar la vida útil de NP, reforçant així encara més la plasticitat recentment reconeguda dels ronyons de mamífers.

PARAULES CLAU:Diferenciació, Ronyó, Nefrogènesi, Progenitors de Nefrona, Ratolí

RESULTATS

El programa nefrogènic embrionari depèn del GDNF

La disposició espacial de SIS2-NP positius a l'embrió i el postnatal primerencronyonssegueix un patró estereotipat i ben descrit, en el qual el teixit inicial multicel·lular s'aprima amb el temps sense afectar gaire l'organització global del nínxol (Short et al., 2014). Els NP als ronyons Gdnfhyper/hyper es van distribuir al voltant de la UB anormalment ampla com una capa més prima (Fig. 1A-F; Fig. S1A, B). La quantificació de NP a E11,5 va revelar un augment inicial, que es va normalitzar transitoriment a E12,5 però va disminuir greument a E14,5 en Gdnfhyper/hyper ronyons (Fig. 1E-G; Fig. S1C-F). L'anàlisi de la mitosi va demostrar que tant el GDNF augmentat de manera endògena com el suplementat exògenament provoca una reducció significativa de pHH3 més NPC (Fig. 1H; Fig. S1G). Col·lectivament, les dades mostren que l'excés de GDNF, que funciona principalment a la UB, on s'expressen els seus receptors (Pachnis et al., 1993), indueix un ràpid descens de la proliferació de cèl·lules NP durant el desenvolupament primerenc del ronyó.

Se sap que la diferenciació prematura o accelerada de NP pot provocar la disminució de les cèl·lules NP al seu nínxol (Kobayashi et al., 2008; O'Brien, 2018). Per avaluar-ho, es va examinar la nefrogènesi tenint-se amb LEF1 i ciclina D1, que marquen les primeres cèl·lules compromeses amb la diferenciació i les nefrones sotmeses a una epitelització completa, respectivament (Lindström et al., 2015). Això va mostrar una disminució general del nombre de precursors de nefrones primerenques i va indicar una diferenciació reduïda de nefrones en Gdnfhyper/hyper embrionari.ronyons(Fig. 2). L'avaluació de la densitat glomerular va donar suport encara més a això i va demostrar densitats generals més baixes en els ronyons hipodisplàstics Gdnfhyper/hiper que en els ronyons de tipus salvatge (WT) (Fig. S1G). Curiosament, l'anàlisi dels glomèruls corticals dins de l'àrea total mesurada, i especialment les proporcions de glomèruls corticals a totals, van revelar proporcions lleugerament superiors a les de WT a Gdnfhyper/hyper (Taula 1; 17 per cent a Gdnfhyper/hyper, 12 per cent en WT). Això indica que malgrat la desacceleració primerenca de l'autorenovació i diferenciació de NP, els ronyons que s'enfronten a un excés de GDNF durant l'organogènesi tenen una nefrogènesi postnatal en curs amb un augment menor de les nefrones més recents, que es troben més corticalment (Rumballe et al., 2011; Short). et al., 2014).

L'excés de GDNF allarga la vida útil del grup de NP postnatalMolts models de ratolí amb deficiència encreixement del ronyó, ja sigui per morfogènesi de la UB i/o per diferenciació de nefrones, moren immediatament després del naixement (Kuure i Sariola, 2020). Malgrat la hipoplàsia important, les anomalies en la morfologia de la UB i la nefrogènesi embrionària greument alterada (Fig. 2), els ratolins Gdnfhyper/hyper sobreviuen fins a 3 setmanes després del naixement (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019), oferint una possibilitat. per examinar la nefrogènesi postnatal.

Tal com s'ha establert (O'Brien, 2018), la nostra anàlisi de les poblacions de NP a P1-P10 va revelar una pèrdua dramàtica en els ronyons WT a P3, en què es va detectar sis2-positivitat principalment en el

diferenciant els precursors de la nefrona, i només el 10 per cent de les puntes UB analitzades (nínxols) es van tapar amb cèl·lules progenitores de nefrona (NPC) (Fig. 3A, n=2 ronyons). Tanmateix, es van detectar SIS 2-NP positius en el 59% dels nínxols Gdnfhyper/hyper a P3 (Fig. 3B, n=2 ronyons). De la mateixa manera, es van detectar NP positius PAX2-en nínxols NP dels ronyons Gdnfhyper/hiper a P3, però les cèl·lules positives PAX2- es van localitzar exclusivament en els precursors de la nefrona diferenciadora a WTronyons(Fig. 3C,D).

Nefrogènesi en Gdnfhyper/hyper postnatalronyonsva demostrar una millora significativa respecte a la dels ronyons embrionaris, com s'exemplifica amb patrons similars de precursors de nefrona en WT i Gdnfhyper/hiper ronyons (Fig. 3E-H; compareu amb la Fig. 2). Finalment,

vam trobar que aproximadament el 18 per cent dels nínxols NP sostenien SIS 2-NPC positius a P4, i els NPC compromesos estaven presents a Gdnfhyper/hyperronyonsfins a P6, mentre que els NPC compromesos es van detectar a WT

ronyonsnomés fins a P4 (Fig. 4; Fig. S1H). Això demostra que la vida útil de la NP in vivo no està prefixada i suggereix que la modulació dels nivells de factor de creixement, específicament GDNF, contribueix al moment de l'ona final de diferenciació de la nefrona.

Vam plantejar la hipòtesi que els NPC persistents als ronyons Gdnfhyper/hiper postnatals podrien derivar de mecanismes compensatoris generals provocats per defectes de ramificació de la UB que condueixen a la hipoplàsia renal (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019) o, alternativament, derivar del GDNF específic. efectes sobre la població de NP. Per discriminar entre les opcions, es van analitzar els NP postnatals en altres models d'hipoplasia renal. Fgf9;20-deficientronyonsmostren un aprimament similar de les capes de cèl·lules NP embrionàries (Barak et al., 2012) com el detectat a Gdnfhyper/hyperronyons, però no vam poder detectar SIS2- i/o PAX2-cèl·lules positives als seus nínxols NP postnatals (Fig. S2). Per aprofundir en això, a continuació vam analitzar Hoxb7Cre; Mek1fl/fl; Mek2 plus /− ronyons (Ihermann-Hella et al., 2014) en què, de manera similar als ratolins Gdnfhyper/hyper, la hipoplàsia renal és causada per una ramificació deteriorada de la UB. Aquest model també no tenia signes de nefrogènesi prolongada, tal com es va detectar per la presència de cèl·lules positives SIX2- i/o PAX{2-en els seus nínxols NP postnatals (Fig. S3), donant suport a la visió que la hipoplàsia renal com a això no és suficient per mantenir la nefrogènesi postnatal.

Les dades publicades també demostren que la hipoplàsia renal sola no és capaç de suportar el manteniment postnatal de la NP (Kuure i Sariola, 2020), cosa que suggereix a més un paper actiu per al GDNF. Tanmateix, no podem excloure completament la possibilitat que l'excés de factors de creixement diferents de GDNF tinguessin el mateix efecte.

Els NP postnatals sostinguts mantenen el programa nefrogènic més enllà del seu cessament normal

Els NP postnatals sostinguts mantenen el programa nefrogènic més enllà del seu cessament normal

A continuació, el potencial de diferenciació dels NP sostinguts al Gdnfhyper/hyper postnatalronyonsva ser examinat. L'anàlisi de Ki67 va revelar patrons de proliferació postnatal comparables als ronyons WT i Gdnfhyper/hyper fins a P4 (Fig. 5A, B). A partir de P5, les cèl·lules Ki67-positives van disminuir a la zona de diferenciació cortical dels ronyons WT (Fig. 5C, E, G). Aquesta caiguda de la proliferació cortical no es va detectar als ronyons Gdnfhyper/hiper, que mostraven cèl·lules en cicle actiu en estructures semblants a precursors de nefrona a P7 (Fig. 5D, F,

H) però ja no a P12 (Fig. S4A,B).

L'anàlisi de diferenciació de nefrona postnatal va demostrar una quantitat excessiva de precursors de nefrona en Gdnfhyper/hyperronyonsfins a P7, mentre que aquests es van detectar en ronyons WT només fins a P4 (Fig. 6; Fig. S4C-F). Aquesta nefrogènesi postnatal persistent, però, no va aconseguir augmentar la densitat glomerular de la de les etapes embrionàries tardanes (Fig. S5A-C; 6,4±2,1 versus 10,2±1,2, respectivament; mitjana±sem). La proporció de glomèruls corticals en Gdnfhyper/hiper ronyons a P7 (59 per cent) és 1,5 vegades més gran

Fig. 1. Els progenitors de la nefrona s'esgoten a la hiper/hiper Gdnf embrionàriaronyons. (A, B) El marcador SIX2 (vermell) del progenitor de la nefrona (NP) es localitza a les puntes del brot ureteric (UB) que cobreixen el mesènquima (calbindina, verd) a WT (A; n=4 ronyons) i Gdnfhyper/hyper (B; n=5 ronyons) ronyons a E11.5. (C, D) ronyons E12,5 WT (C) i Gdnfhyper/hyper (D) cultivats in vitro durant 24 h i tenyits per a SIX2 (vermell) per visualitzar la població de NP i la calbindina (verd) per a UB (n{{9} } ronyons/ tractament, tres experiments independents). (E, F) els NP són abundants al ronyó E14,5 WT (E; 42,6/punta), mentre que a Gdnfhyper/hyper ronyó els NP es redueixen clarament (F; fletxes, 29,8/punta) (n=207 per a WT i 431 per a puntes Gdnfhyper/hiper analitzades en nou ronyons/genotip).

Les fletxes blanques assenyalen les cèl·lules NP (vermelles).

(G) Anàlisi de SIS2-import positiu de NP en WT i Gdnfhyper/hyperronyonsmostra grups de NP inicials comparables a E12.5. Les dades es presenten com a quantitat mitjana de SIS2-NPs±sem positius en comparació amb les dels companys de camada WT, que s'estableixen al 100 per cent i reflecteixen els resultats obtinguts a partir de quatre camades independents (WT: 100±15,61 per cent, n{{ 7}}; Gdnfhyper/hyper: 124,74±33,89 per cent, n=5; P=0.533, prova t de dues cues a SPSS). (H) La proporció de SIS 2-NP positius proliferants en Gdnfhyper/hyper ronyons a E12,5 mostra una disminució significativa en comparació amb el ronyó WT. Les dades es presenten com a proporció mitjana de SIS2-NPs±sem positius proliferants en comparació amb les dels companys de camada WT, que s'estableixen al 100 per cent i reflecteixen els resultats obtinguts a partir de tres camades independents (WT: 100 ± 9,04 per cent, n{{ 25}}; Gdnfhyper/hyper: 56,94±12,67 per cent, n=5;

*P=0.024, prova t de dues cues a SPSS). Barres d'escala: 100 µm.

que en WTronyons(39 per cent) (Taula 1) que recolza l'opinió que el conjunt de NP postnatal sostingut als ronyons Gdnfhyper/hiper indueix noves nefrones després de la cessació normal de la nefrogènesi.

Els ratolins Gdnfhyper/hiper amb nefrogènesi prolongada en ronyons severament hipodisplàstics no mostren signes de neoplàsia o tumorigènesi durant la seva curta vida útil (Kumar et al., 2015; Turconi et al., 2020).

Els ronyons Gdnfwt/hyper mostren una disminució embrionària més lleu dels NPC que Gdnfwt/hyperronyons. Aquests ratolins viuen una vida normal i no mostren tumorsronyós i altres òrgans (Turconi et al., 2020) (Fig. S6A-D, n=62). L'augment de GDNF doble durant l'embriogènesi, però, no aconsegueix mantenir la població de NP en Gdnfwt/hiper ronyons postnatals (Fig. S6E, F), cosa que suggereix un ajustament ajustat.

Fig. 2. Efecte de l'excés de GDNF sobre la nefrogènesi embrionària. (A) LEF1 (vermell), un marcador d'agregats pretubulars, vesícules renals distals i cossos en forma de S, al ronyó WT E14.5. (B) E14.5 Gdnfhyper/hyper ronyó mostra molt pocs precursors de nefrona diferenciadors LEF1-positius i l'abundància típica d'epiteli de brot ureteri (UB) detectat per la tinció de calbindina (verd).

(C) La ciclina D1 (vermell) taca tots els precursors de les nefrones diferenciadores (els asteriscs marquen els agregats pretubulars i els cossos en forma de coma, les fletxes apunten als cossos en forma de S), que es poden observar abundantment al costat de l'epiteli UB (verd) a E14.5 WTronyó.

(D) Es detecten significativament menys precursors de nefrona diferenciadors a E14.5 Gdnfhyper/hyperronyó. (E, F) Localització de Ciclina D1 (vermell) a E16.5 WT (E) i

Gdnfhyper/hiper (F) ronyons. Calbindin (verd)

La tinció visualitza l'epiteli UB a totes les imatges. Per a cada tinció en una etapa determinada n=3 ronyons/genotip. Barra d'escala: 100 µm.

Taula 1. Quantificació de la densitat glomerular en Gdnfhyper/hyper ronyons a E18.5 i P7

Les dades són la quantitat mitjana de nefrona per mm±sem cúbic (n=4 ronyons/genotip, una mitjana de vuit diapositives analitzades per a cada ronyó amb intervals de 125 µm per evitar el recompte d'iteracions dels mateixos glomèruls). La proporció de glomèruls corticals als ronyons WT a E18,5 és del 12 per cent, mentre que als ronyons Gdnfhyper/hiper és del 17 per cent. A P7, la proporció de glomèruls a l'escorça augmenta encara més a Gdnfhyper/hyperronyons,cosa que suggereix que les nefrones encara s'estan diferenciant activament.

límit llindar per a la capacitat del GDNF per modular el programa nefrogènic.

La nefrogènesi postnatal persistent depèn dels canvis en la senyalització induïda per GDNF

L'expressió de Gdnf es perd dels ronyons WT per P2 (www.gudmap.org), mentre que el seu ARNm i proteïna encara estan presents a Gdnfhyper/hyper.

La nefrogènesi postnatal persistent depèn dels canvis en la senyalització induïda per GDNF

L'expressió Gdnf es perd de WTronyonsper P2 (www.gudmap.org), mentre que el seu ARNm i proteïna encara estan presents a Gdnfhyper/hyper

ronyonstan tard com P7 (Fig. 7A-D). El complex del receptor GDNF conservador s'expressa només a les puntes epitelials de l'UB (Costantini, 2012;

Golden et al., 1999). A causa de la localització del receptor al teixit adjacent a la població NPC, vam sospitar que els efectes de l'augment del GDNF endògen sobre la nefrogènesi havien de ser mediats.

mitjançant molècules derivades de la UB, secretades i dependents del GDNF (http://www.signalpeptide.de/index.php) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011; Schmidt-Ott et al., 2011; 2005) (Taula 2), o altres molècules, l'expressió de les quals podria canviar a causa de la UB sobredimensionada.

L'anàlisi de l'expressió de les dianes GDNF secretades derivades de la UB va revelar una regulació positiva significativa de Crlf1, Srgn i Wnt11 en Gdnfhyper/hyper ronyons a E14.5 (Fig. 7E). A més, l'expressió de Wnt9b augmenta significativament (Fig. 7E). Una anàlisi addicional dels objectius de senyalització de WNT/-catenina (Clevers i Nusse, 2012) al control E14.5 i als ronyons Gdnfhyper/hyper van demostrar una regulació significativa de l'objectiu canònic Axin2 (P=0.003371), mentre que el WNT expressat per NP objectius (Karner et al., 2011) van mostrar una tendència de regulació a la baixa, probablement reflectint el nombre total reduït d'NPC (Fig. S7A). En conjunt, aquests indiquen que no només la senyalització induïda per GDNF augmentada, sinó també l'augment de la senyalització induïda per Wnt9- i Wnt{11- amb funcions conegudes en la regulació de l'NPC participen en la mediació de la comunicació recíproca des de l'UB mutant fins al conjunt de NP adjacent a E14.5 (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018).

Fig. 3. Diferenciació de nefrones al cessament de la morfogènesi renal. (A) El ronyó P3 WT ha perdut SIX 2-progenitors de nefrona (NP) positius corticals, tal com mostra la pèrdua de cèl·lules al mesènquima de la tapa (fletxa). En canvi, SIX2 es localitza al mesènquima lateral i als precursors primerencs de la nefrona (punts de fletxa).

La quantificació de 48 nínxols NP (nombres de punta analitzats) va revelar només cinc nínxols amb NP. (B) El mesènquima cap positiu per a SIX2 encara està present al ronyó Gdnfhyper/hyper a P3 (fletxes). La quantificació de 107 nínxols NP (números de punta analitzats) va revelar 63 nínxols amb cèl·lules NP. (C, D) Tinció de PAX2 (vermell) i calbindina (verd) en WT (C) i Gdnfhyper/hyper

(D) ronyons a P3. Les fletxes apunten a la posició on es mantenen les cèl·lules NP a Gdnfhyper/hyperronyons.

(E, F) Quantitat comparable de precursors de nefrona positiu (vermell) de ciclina D1- en P3 WT (E) i Gdnfhyper/hyper

(F) ronyons. (G, H) La visualització dels precursors positius de la nefrona LEF1- (vermell) i de l'epiteli ureteric (verd) revela una nefrogènesi en curs similar en WT

(G) i Gdnfhyper/hiper (H) ronyons. Per cada tinció

n=3 ronyons/genotip. Barres d'escala: 100 µm.

Caracterització molecular de P5 Gdnfhyper/hyperronyonsva mostrar una regulació persistent de Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 i Uncx4.1 (també conegut com Uncx), però també va revelar una expressió més gran del potencial factor de nínxol Lama1 (Rayagiri et al., 2018), inductor de diferenciació de nefrones Wnt4 (Stark et al. , 1994) i l'agonista de senyalització WNT R-spondina 1 (Rspo1) (Fig. 7F; Fig. S7B). Aquest perfil transcripcional suggereix un efecte derivat de la UB augmentat sobre els NP, que semblen experimentar una ona de diferenciació basada en la disminució de l'expressió Fgf9 i Fgf20 i la localització desplaçada de les cèl·lules SIX2 més (Figs 4C, D i 7F). Vam provar funcionalment si les expressions Crfl1, Wnt11 i Wnt9b més significativament augmentades possiblement afecten el programa nefrogènic del ratolí. CRLF1, en complex amb la seva citocina semblant al lligand fisiològic de la cardiotrofina, indueix la diferenciació en cultius de mesenquim renal aïllat de rata (Schmidt-Ott et al., 2005). La caracterització dels ronyons Crfl1-knockout va revelar una mida del ronyó i una nefrogènesi comparables amb els ronyons WT (Fig. S6C-F), cosa que suggereix funcions prescindibles de CRLF1 in vivo. A continuació, es va provar la contribució de l'augment de la senyalització canònica de WNT als fenotips causats per l'excés de GDNF. IWR1 inhibeix les tankirases 1 i 2, que són necessàries per al desenvolupament normal del ronyó (Chen et al., 2009; Huang et al., 2009; Karner et al., 2010). El tractament amb IWR1 va alleujar el nombre de punta i la morfologia de la UB en presència d'excés de GDNF (Fig. S8). Finalment, vam preguntar si l'expressió de Wnt11 augmentada significativament als ronyons Gdnfhyper/hyper contribueix al programa nefrogènic prolongat en ratolins Gdnfhyper/hyper creuant l'al·lel eliminatori de Wnt11 amb el fons Gdnfhyper. Això no va poder generar un homozigot doble

Fig. 4. Els progenitors de la nefrona es mantenen persistentment als ronyons Gdnfhyper/hiper postnatals. (A, B) La localització del marcador de progenitor de nefrona (NP) SIX2 (vermell) a WT a P4 (A) i P6 (B) mostra la pèrdua de NPs als ronyons WT en què SIX2 només es troba en vesícules renals feblement positives (asteriscs) . (C) A Gdnfhyper/hyper ronyons a P4, SIX2 també es localitza a NPs que cobreixen les puntes (fletxes) del brot ureteral (verds) (n =315 puntes a WT i 245 a Gdnfhyper/hyper analitzats en quatre ronyons/genotip). (D) La localització de SIX2 (vermell) i calbindina (verd) als ronyons P6 Gdnfhyper/hiper revela la persistència de cèl·lules NP compromeses (13; * indica nefrones diferenciades) al ronyó mutant (n=3 ronyons/genotip) . La quantificació dels nínxols de cèl·lules NP va mostrar molt pocs consells, que no tenien SIS2-NP positius als ronyons WT, mentre que el 81% dels nínxols als ronyons Gdnfhyper/hyper (n=2, 16 nínxols) estaven acompanyats. amb SIS2-positivitat en precursors de nefrona compromesos i diferenciats. Barra d'escala: 100 µm.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− descendència (taula 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 més /− cria). Aquests resultats indiquen la letalitat embrionària per als mutants Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− i ens van obligar a centrar l'anàlisi en els ronyons Gdnfhyper/hyper;Wnt11 més /−. L'eliminació d'un al·lel Wnt11 en Gdnfhyper/hyper fons va millorar lleugerament la morfologia de la UB i va reduir la mida del ronyó més que en Gdnfhyper/hyper ronyons, probablement reflectint la formació reduïda de quists del conducte col·lector després de la disminució de la dosi de Wnt11 (Fig. S9A-C). No obstant això, SIS2-població de NP positiva es va millorar (29,8 NPC/tip versus 40,7 NPC/tip a E14,5 i 20,3 NPC/tip enfront de 30,9 a P0) i la nefrogènesi es va millorar a la zona de diferenciació cortical de Gdnfhyper/hiper ;Wnt1 més /− ronyons (Fig. 8; Fig. S9D-F; compareu també amb la Fig. 1F). Així, aquests resultats suggereixen que l'augment dels nivells de GDNF augmenten diversos objectius GDNF/Ret derivats de brots, que, no sols, sinó en combinació entre ells i juntament amb l'augment de la senyalització canònica de WNT, estan regulant els NPC als ronyons embrionaris.

DISCUSSIÓ El recompte de nefrones es defineix durant la vida fetal i pot variar molt entre individus. L'expansió i la vida útil de la NP influeixen molt en la dotació final de la nefrona i, per tant, la identificació dels mecanismes reguladors que controlen l'autorenovació de la NP és important. Aquí, mostrem que el factor neurotròpic GDNF, conegut per iniciar el desenvolupament renal i regular la morfogènesi de la UB (Costantini, 2010; Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019), és, malgrat els seus efectes negatius sobre el creixement renal, capaç de d'allargar el programa nefrogènic més enllà del seu cessament normal. Els nostres resultats demostren que l'excés de GDNF té un efecte bifàsic en l'auto-renovació i manteniment de NP. A partir de la nostra anàlisi, proposem un model de com funciona l'excés de GDNF en Gdnfhyper/hyper ronyons

mitjançant mecanismes que impliquen canvis en la progressió del cicle cel·lular i la capacitat de detectar els nivells de factors de creixement. Inicialment als ronyons embrionaris, els nivells elevats de GDNF provoquen una disminució ràpida del nombre de NP per nínxol, que és típic de molts models de ratolins amb deficiència primària a UB (Carroll i Das, 2013; Chen et al., 2015b; Costantini i Kopan, 2010; Liu et al., 2018). La disminució prematura de la NP observada en aquests models publicats anteriorment sol ser causada per la seva diferenciació prematura, cosa que no és el cas dels ronyons Gdnfhyper/hiper. En canvi, l'excés de GDNF és capaç de mantenir el cicle cel·lular actiu a l'escorça renal postnatal significativament més temps del que es veu als ronyons WT. La proliferació es produeix a les cèl·lules NP, que es mantenen més temps que als ronyons WT, i continuen produint noves nefrones. En el futur, serà interessant veure si serà possible administrar l'excés de GDNF d'una manera favorable per a la nefrogènesi postnatal continuada sense afectar greument la morfogènesi de la UB per distorsionar el creixement global de l'òrgan. Les nostres dades demostren que la disminució precoç dels NPs embrionaris dels ronyons Gdnfhyper/hyper es deu a una disminució de la proliferació cel·lular en lloc de l'augment de la diferenciació prematura. Aquest mecanisme cel·lular està recolzat per canvis moleculars detectats en objectius GDNF coneguts (Crlf1, Wnt11 i Srgn) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011) i en importants reguladors de la senyalització de manteniment de cèl·lules NP (Wnt9b, Wnt11 i els seus objectius transcripcionals) (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; O'Brien et al., 2018). Examen previ de la longevitat i la resiliència de les cèl·lules NP mitjançant l'ablació de la població NP amb la toxina diftèrica A, o pertorbar l'activació de MAPK/ERK, que ambdues van provocar un ràpid descens de les cèl·lules NP sense un efecte positiu en la seva vida útil (Cebrián et al., 2014). ; Ihermann-Hella et al., 2018), juntament amb els nostres resultats suggereixen que la proliferació de cèl·lules NP té inherentment un paper important en la definició de la seva vida total. D'acord, les cèl·lules NP dels ronyons embrionaris tardans mostren taxes de proliferació significativament reduïdes i una diferenciació accelerada, mentre que el trasplantament de cèl·lules NP antigues a ronyons en fase anterior allarga la seva vida útil (Chen et al., 2015a). A partir dels nostres resultats, proposem que el GDNF contribueix al mecanisme mitjançant el qual les cèl·lules NP senten la seva edat de desenvolupament i, finalment, la seva vida útil. En un ronyó normal, l'expressió de GDNF és alta a l'inici de la morfogènesi renal i durant la fase de creixement actiu, mentre que es produeix una clara disminució dels nivells de GDNF als ronyons embrionaris tardans, donant lloc a una pèrdua d'expressió en l'etapa postnatal primerenca (Figs 7 i 9). . Els nivells de GDNF als primers ronyons Gdnfhyper/hiper són anormalment alts, cosa que sembla inhibir la proliferació de cèl·lules NP, probablement a causa dels canvis cel·lulars i moleculars detectats dins de la UB mutant, com ara una via WNT alterada.

(Fig. 7E, F; Fig. S7A, B), que té efectes coneguts sobre la biologia dels NPC (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2016; 2018). De manera similar als ronyons WT, els nivells d'ARNm de Gdnf i de proteïna GDNF disminueixen en els ronyons Gdnfhyper/hyper postnatals en què Gdnf es manipula a nivell post-transcripcional permetent la regulació temporal endògena de l'expressió (Kumar et al., 2015). Probablement, això disminueix l'expressió de GDNF fins al nivell permissiu per a l'autorenovació i diferenciació de cèl·lules NP, que es detecten com un programa nefrogènic sostingut en els ronyons postnatals (Fig. 9). Aquesta plasticitat depenent del factor de creixement recentment reconeguda en la diferenciació renal té esperança per al seu ús amb finalitats regeneratives en el futur. Les primeres pistes de la possibilitat d'allargar el període de diferenciació de nefrones provenien d'experiments que inhibien BMP/

Fig. 5. Proliferació cortical sostinguda en Gdnfhyper/hiper ronyons postnatals. (A, B) La tinció de Ki67 als ronyons P4 WT (A) i Gdnfhyper/hyper (B) mostra un patró similar de cèl·lules proliferatives als ronyons corticals (fletxes vermelles) d'ambdós genotips. (C,D) En els ronyons P5 WT (C) la positivitat Ki67- es redueix significativament a l'escorça (fletxa vermella), mentre que els ronyons Gdnfhyper/hiper (D) encara presenten una proliferació focalment molt alta (fletxes vermelles). (E, F) La proliferació al ronyó cortical WT (E) es redueix encara més a P6, mentre que es manté molt activa en els ronyons Gdnfhyper/hiper (F). (G, H) Les cèl·lules proliferatives Ki67- positives es localitzen als túbuls renals medul·lars (fletxa negra) als ronyons P7 WT (G), però encara es detecta proliferació activa a les estructures de nefrona diferenciadora cortical (fletxes vermelles) dels ronyons Gdnfhyper/hiper (H). Per a cada etapa postnatal, n=3 ronyons/genotip. Barra d'escala: 1 mm.

P7 només en Gdnfhyper/hiper ronyons. (A, B) El marcador precursor de nefrona LEF1 (vermell) als ronyons WT (A) i Gdnfhyper/hyper (B) a P4 demostra una nefrogènesi en curs en ambdós genotips (fletxes) (n=2 ronyons/genotip). (C,D) Els ronyons P5 WT (C) mostren molt poques cèl·lules LEF1-positives a l'escorça, mentre que es detecta una àmplia nefrogènesi als ronyons Gdnfhyper/hiper (D; fletxes; n=4 ronyons/genotip) . (E,F) LEF1 ja no està present a l'escorça dels ronyons WT a P6 (E), mentre que encara es detecten abundants precursors de nefrona als ronyons Gdnfhyper/hiper (F) (n=3 ronyons/genotip). (G) Ciclina D1 (blanca) i JAG1 (vermell) es localitzen a túbuls distals diferenciats de nefrona (fletxa groga i punta de fletxa) al ronyó P7 WT (n =3 ronyons). (H) En els ronyons P7 Gdnfhyper/hiper, la ciclina D1 i JAG1 es localitzen en cossos en forma de coma (punta de fletxa) i en forma de S (fletxa) de precursors de nefrona a la zona de diferenciació cortical, mostrant així una nefrogènesi sostinguda en aquesta etapa postnatal tardana (n { {19}} ronyons). Barres d'escala: 100 µm.

Senyalització SMAD1/5, que va provocar ronyons lleugerament més grans amb més nefrones que en ronyons tractats amb vehicles (Brown et al., 2015). La disminució de la dosi de Tsc1, que codifica un inhibidor de mTOR, manté les cèl·lules NP durant un dia addicional, sense efectes reportats sobre el nombre de cèl·lules NP embrionàries (Volovelsky et al., 2018). També es va observar una nefrogènesi prolongada en ratolins amb sobreexpressió de Lin28, Lin28b o Let-7 inactivat (Let-7a1; Let-7d; Let-7f1) (Urbach et al. ., 2014; Yermalovich et al., 2019), que també mostren tumorigènesi directa o activació dels loci Igf2 o H19h associats al tumor de Wilms del càncer de ronyó pediàtric (Chen et al., 2018; Ogawa et al., 1993). Com a nota, no es van detectar canvis en la localització o els nivells de pSMAD1/5 en els ronyons Gdnfhyper/hyper, que són hipodisplàstics i compatibles amb la vida durant tres setmanes.

El present estudi se centra en la caracterització de la funció de GDNF en la nefrogènesi, que s'ha examinat prèviament mitjançant la disminució de la dosi de Gdnf endògena i té com a resultat una reducció de la dotació de nefrones (Cullen-McEwen et al., 2001, 2003). El complex receptor canònic del GDNF està format per la tirosina quinasa RET i el seu co-receptor GFRa1, que només es coexpressen exclusivament a l'epiteli UB (Costantini, 2012; Golden et al., 1999; Pachnis et al., 1993). . El GDNF és un factor de nínxol clau per a les cèl·lules de punta de la UB (Chi et al., 2009; Riccio et al., 2016; Shakya et al., 2005). Prèviament hem demostrat que l'excés de GDNF expandeix el conjunt de progenitors del conducte col·lector a costa de l'allargament del tronc uretèric, donant lloc a un fenotip de tronc curt expandit i un fenotip de tronc curt a causa de defectes en la motilitat del progenitor i la longitud del cicle cel·lular escurçat (Li et al., 2019). Durant les etapes embrionàries l'efecte combinat d'anormalment

Fig. 7. Anàlisi d'expressió dels reguladors crucials del desenvolupament renal. (A) L'assaig d'hibridació in situ de Gdnf a P4 no pot detectar cap transcripció al ronyó WT (n =3 ronyons). (B) L'expressió de Gdnf es manté al ronyó P4 Gdnfhyper/hiper i es localitza a la zona de diferenciació cortical en la qual es mantenen els progenitors de la nefrona (fletxes vermelles) a causa de l'excés de GDNF (n =3 ronyons). (C) Anàlisi qRT-PCR de transcripcions de Gdnf en ronyons Gdnfwt/ko, WT, Gdnfwt/hyper i Gdnfhyper/hyper a P7 (n=3 ronyons/genotip). L'expressió de Gdnf en Gdnfhyper/hyper ronyons és significativament més alta que en WT (P=0.036) i Gdnfwt/ko (P{=0.038) (mitjana±sem, prova t de dues cues a SPSS ). (D) Anàlisi ELISA dels nivells de proteïna GDNF als ronyons P7 (n=5 ronyons/ genotip) (mitjana ± sem). (E, F) quantificació basada en qRT-PCR dels nivells d'expressió relatius dels gens seleccionats a E14 (E) i a P5 (F) (n=3 ronyons/genotip en una etapa determinada). Els objectius de GDNF secretats derivats de la UB es mostren a sobre de la línia discontínua, mentre que altres reguladors de nefrogènesi coneguts es presenten a sota de la línia. Els ronyons Gdnfhyper/hiper mostren una regulació positiva significativa de Crlf1 (*P=0.019), Srgn (*P{=0.021), Wnt11 (**P{=0.001) i Wnt9b ( **P=0.01) a E14, mentre que a P5, les expressions gèniques augmentades significativament inclouen Crlf1 (**P=0.009), Etv4 (**P{=0.{{). 39}}), Etv5 (*P=0.03), Lama1 (*P{=0.014) i Wnt4 (*P{=0.026). En canvi, la transcripció de Sostdc1 (**P=0.000), Fgf9 (**P{{=0.001) i Fgf20 (**P{{=0.001) ) es redueix significativament en Gdnfhyper/hyper ronyons a P5. Barra d'escala: 100 µm.

GDNF elevat, canvis biofísics induïts per la morfologia de la punta de la punta UB anòmales i alteracions moleculars associades en les dianes de GDNF i la via WNT semblen empènyer conjuntament les cèl·lules NP cap a una proliferació disminuïda. Aquí mostrem que la morfologia de la punta de la UB ampliada millora amb el temps, però persisteix en formes lleus fins a P4 en Gdnfhyper/hiper ronyons postnatals (Fig. 5). Les cèl·lules de punta UB encara estan presents molecularment als ronyons P5 Gdnfhyper/hyper, que expressen alts nivells de marcadors de punta regulats per GDNF Crlf1, Etv4, Etv5 i Lama1, objectius WNT canònics expressats per NPC Cited1 i Uncx4.1, així com l'agonista de WNT R -spondin1 (Fig. 7E,F; Fig. S7A,B) (Karner et al., 2011; Lu et al., 2009; Vidal et al., 2020). Aquests canvis moleculars a la UB postnatal probablement proporcionen un entorn favorable per a l'autorenovació sostinguda de NP més enllà de P2/P3. Hem identificat CRLF1 i WNT11 secretats derivats de la UB com a objectius GDNF que, juntament amb el WNT canònic augmentat

la senyalització, augmentada addicionalment per l'augment de l'expressió de Wnt9b, media els seus efectes sobre la regulació de NP. Les nostres dades també indiquen que la funció de CRLF1 és redundant amb altres citocines, ja que la seva inactivació no afecta la diferenciació renal. Tant WNT9b com WNT11 regulen molts aspectes dels NPC i la nefrogènesi (Carroll et al., 2005; Karner et al., 2011; Majumdar et al., 2003; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). La regulació a l'alça de Wnt9b expressada per UB, que se sap que regula molts aspectes de la nefrogènesi, en Gdnfhyper/hyper ronyons pot imitar la seva expressió forçada en NPs, cosa que altera el seu manteniment versus l'equilibri de diferenciació (Kiefer et al., 2012) i, per tant, contribueix mecànicament. a l'autorenovació desequilibrada de NP en Gdnfhyper/hipernefrogènesi. Això es recolza en una morfologia de punta millorada després de la inhibició canònica de WNT per part de IWR1 en ronyons sencers que s'enfronten a l'excés de GDNF.

Taula 2. Gens diana de GDNF secretats amb potencial per influir en el programa nefrogènic

Els nostres resultats mostren que la inhibició de l'IWR1 en si té un efecte important sobre els NPC, que es dispersen i s'adhereixen sense problemes als consells de la UB. La inhibició canònica de WNT en els mateixos NPC probablement contribueixi al fracàs d'augmentar el seu fenotip en presència d'excés de GDNF. Això està recolzat pels nostres experiments genètics en què la reducció de l'expressió Wnt11 expressada per UB al fons Gdnfhyper/hyper va millorar el manteniment i la diferenciació de NP, però no va poder rescatar completament la hipoplàsia renal causada per l'excés de GDNF. Això pot ser, almenys parcialment, a causa de la manca d'activació dels dos al·lels Wnt11 al fons Gdnfhyper/hyper a causa de la letalitat embrionària de Wnt11−/− (Nagy et al., 2016). Així, un al·lel Wnt11 restant pot fins i tot augmentar la cascada de GDNF com es va suggerir anteriorment (Majumdar et al., 2003) i, per tant, prohibir en part el rescat complet de la nefrogènesi. El nostre estudi actual no pot descartar la possibilitat que alguns efectes del GDNF sobre els NP es deguin a la senyalització no canònica del GDNF, ja que els seus potencials receptors de senyalització alternatius són expressats pels NP (Brodbeck et al., 2004; Enomoto et al., 2004; Keefe Davis et al., 2013; Paratcha et al., 2003). Tanmateix, tant la supressió de NCAM com l'expressió de Gfra1 només a UB (posant-la sota el control del promotor Ret) mantenen el fenotip renal normal (Cremer et al., 1994; Heuckeroth et al., 1999; Keefe Davis et al., 2013; Rossi et al., 1999; Sariola i Saarma, 2003). Això suggereix que, almenys per si sols, ni NCAM ni GFRa1 són essencials per al programa nefrogènic. En resum, els nostres experiments suggereixen que el GDNF, que ha estat i està actualment en assaigs clínics per a la malaltia de Parkinson (Kirkeby i Barker, 2019), pot tenir potencial per servir com a mitjà prospectiu per millorar la dotació de nefrones en el futur. Es necessita experimentació addicional per identificar possibles mitjans per activar excessivament la senyalització de GDNF sense efectes nocius sobre el creixement renal.

MATERIALS I MÈTODES

Animals

Els protocols d'investigació i cura dels animals es van realitzar d'acord amb el Codi de conducta ètica per a l'experimentació amb animals, així com les directives de la Unió Europea (Directiva 2010/EU/63) i van ser aprovats pel National Animal Experiment Board de Finlàndia. Els ratolins es van allotjar en gàbies ventilades individualment amb menjar i aigua ad libitum. La humidificació i la calefacció òptimes es van proporcionar constantment al Centre d'Animals de Laboratori certificat de la Universitat d'Hèlsinki. La generació i el genotipat dels models de ratolí Gdnfhyper (Kumar et al., 2015) i Fgf9;20 (Barak et al., 2012) s'han descrit anteriorment. Gdnfhyper;Wnt11− els cadells provenen d'encreuaments de C57BL6 Wnt11−

Taula 3. Resum dels genotips de descendència dels encreuaments Gdnfwt//hyper;Wnt11 més /−

(Nagy et al., 2016) i línies Gdnfhyper, i es van genotipar tal com es va descriure anteriorment (Kumar et al., 2{015; Nagy et al., 2{016) ). Totes les línies de ratolí utilitzades en els estudis es van mantenir en un fons mixt triple 129Ola/ICR/C57bl6. La generació de ratolins knockout Crlf s'ha descrit anteriorment (Alexander et al., 1999). El genotipat per PCR es va realitzar mitjançant un conjunt d'imprimadors neoespecífics (5′-AGAGCTATTCGGCTTAGACTG-3′ i 5′-CCTGATCGACAAGACCGGCTTC-3′) juntament amb conjunts d'imprimadors específics de gens per a Crlf1 (5′-GCCTAATAGGTGCTGGGTGA{{{{{ 18}}′ i 5′-GACCCTATCTGCGTTTTCCA-3′). Recollida de teixits Els embrions es van escenificar segons els criteris de Theiler (1989) tal com es va descriure anteriorment (Kuure et al., 2005) i es van recollir després de la luxació cervical de dones embarassades amb anestèsia profunda amb CO2. Els cadells embrionaris i postnatals tardans es van sacrificar per decapitació. El teixit es va disseccionar al medi de Dulbecco complementat amb un 0,2% d'albúmina sèrica bovina (BSA) seguit de la fixació amb un 4% de paraformaldehid (PFA) o cultiu d'òrgans. Cultiu d'òrgans Els ronyons aïllats d'embrions de ratolí E11.5 i E12.5 es van col·locar a la interfície aire-líquid suportats pel sistema de membrana de polièster Transwell® (Costar) i es van cultivar a 37 graus en una atmosfera humidificada al 5% de CO2 amb medi de cultiu renal [F12 :DMEM (1:1) més Glutamax (Gibco)] complementat amb sèrum boví fetal al 10 per cent i penicil·lina-estreptomicina (Ihermann-Hella i Kuure, 2019). Per al cultiu in vitro amb 100 ng/ml de GDNF exògen (ProSpec Ltd) (Sainio et al., 1997) dirigit a la quantificació de NPC, cada bloc urogenital que contenia metanefros, el rudiment renal definitiu, es va reduir a la meitat al llarg de la línia mediana ventralis. La meitat de cada mostra es va cultivar amb GDNF exògen mentre que l'altra meitat va servir de control. Els experiments d'inhibició de WNT es van provar primer amb 50-100 ng/ml GDNF i 50-100 µM IWR1 (I{0131-25, Sigma-Aldrich). A partir d'aquests experiments de dependència de la dosi, les concentracions òptimes van ser de 50 ng/ml de GDNF i 75 µM IWR1. Histologia i immunotinció Per als estudis que investigaven el marcador d'interès en seccions de parafina, es van disseccionar ronyons dels embrions o cries de les etapes indicades, seguit del processament i secció de teixits tal com es va descriure anteriorment (Li et al., 2019). En cada anàlisi es van utilitzar un mínim de cinc seccions de cada ronyó i de tres a cinc ronyons diferents per genotip. Els números de mostra exactes es proporcionen a les llegendes de les figures. L'hematoxilina i l'eosina (H&E) i la immunohistoquímica realitzada en seccions de parafina es van completar tal com es va descriure anteriorment (Li et al., 2019). En resum, el teixit dissecat es va arreglar durant la nit amb un 4% de PFA (pH 7,4), seguit de deshidratació i parafinització amb un processador automàtic de teixits (Leica ASP 200). Es van preparar seccions de 5 µm de gruix i es van desparafinar en xilè seguit de rehidratació abans de tacar-se amb Harris H&E o sotmetre's a una recuperació d'antigen induïda per calor en tampó de recuperació d'antigen (citrat 10 mM; pH 6,0). Per a la immunotinció, es va utilitzar un 3 per cent de BSA per al bloqueig (1 h a temperatura ambient) seguit d'un tractament de peròxid d'hidrogen al 0,5 per cent de 30 min per a la tinció cromogènica. A continuació, es van incubar les seccions amb anticossos primaris durant la nit a més 4 graus seguits d'una incubació d'anticossos secundaris específics de l'espècie durant 2 h a temperatura ambient. La detecció cromogènica es va implementar amb el kit EnVision Detection System-HRP (DAB) (Dako).

Fig. 8. La disminució genètica del nivell de Wnt11 rescata parcialment la pèrdua de progenitors de nefrona en Gdnfhyper/hiper ronyons. (A) SIS 2-progenitors positius de nefrona (NP, vermell) són escassos als ronyons E14,5 Gdnfhyper/hiper (una mitjana de 29,8 NPs/punta en 552 puntes analitzades en nou ronyons). (B) Els ronyons Gdnfhyper/hyper; Wnt11 més /- mostren un augment de l'abundància general de NP per nínxol en absència d'un al·lel Wnt11 (mitjana de 40.7 NPs/punta en 107 puntes analitzades en quatre ronyons). ). (C,D) PAX2-cèl·lules positives als ronyons Gdnfhyper/hyper (C) i Gdnfhyper/hyper;Wnt11 més /− (D) mostren patrons i quantitats similars a E14,5. (EH) A P0, la tinció de SIX2 demostra una millora en els nombres de NP mitjançant l'eliminació d'un al·lel Wnt11 (mitjana de 20,3 NPs/tip en 610 Gdnfhyper/hiperconsells versus una mitjana de 30,9 NPs/punta en Gdnfhyper/hyper/; Wnt11 més /-; consells analitzats en sis ronyons/genotip), que es recolza en la tinció de PAX2. La distribució de SIS2-NPs positives (A′,B′,E′,F′) i PAX2- cèl·lules positives (C′,D′,G′,H′) es mostra sense calbindina ( verd), que representa l'epiteli UB a tots els ronyons. Barres d'escala: 200 µm.

Els ronyons E11.5 i E12.5 sotmesos a una tinció d'immunofluorescència de muntatge sencer es van fixar i permeabilitzar amb metanol fred a l'100 per cent durant 10 minuts abans de la incubació durant la nit amb anticossos primaris. La incubació amb els anticossos secundaris específics de l'espècie corresponent es va implementar el segon dia després d'un rentat vigorós amb PBST (0, 1 per cent de Tween 20 en PBS). Els detalls sobre els anticossos primaris i secundaris utilitzats en el present estudi es mostren a la taula S1. Hibridació in situ La hibridació in situ es va dur a terme tal com es va descriure anteriorment (Ihermann Hella et al., 2014). En resum, es va transcriure i hibridar una sonda d'ARN anti-sentit contra exons Gdnf en seccions gruixudes derivades de ronyons P4 (10-15 seccions/ronyó, n=3 ronyons/genotip) incrustades en un 4% d'agarosa de baix punt de fusió. (NuSieve GTG, Lonza). Es va utilitzar BM Purple per a la reacció colorimètrica

Els nivells de proteïna GDNF ELISA als ronyons P7.5 es van mesurar mitjançant ELISA tal com es va informar anteriorment (Kumar et al., 2015). L'immunoassaig GDNF Emax® (Promega) es va utilitzar amb tractament àcid quan es va realitzar l'ELISA. En detall, per a cada genotip, es van lisar tres ronyons immediatament després de ser dissecats. Després de mesurar la concentració de proteïnes amb l'assaig de proteïnes DC (Bio-Rad), es van carregar 25 µg de proteïna total al pou de la placa ELISA. Cada mostra es va analitzar per duplicat.

Imatge La immunocoloració i la hibridació in situ de les seccions es van fer imatges mitjançant un Zeiss AxioImager equipat amb la font de llum de fluorescència HXP 120V, una càmera Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT B/N i una càmera en color Zeiss AxioCam 105. , o amb un Leica DM5000B equipat amb una font de llum d'halogenurs metàl·lics Leica EL 6000 i una càmera sCMOS Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2. La tinció d'immunofluorescència de muntatge complet es va fer imatges mitjançant un Zeiss AxioImager amb l'aplicació Zeiss ApoTome. La imatge de muntatge complet per mesurar la mida del ronyó intacte es va realitzar mitjançant una Leica MZFLIII equipada amb una càmera Leica DFC7000T. Anàlisis quantitatives basades en immunotinció i imatge La quantificació de la densitat glomerular es va calcular a partir de les seccions seqüencials dels ronyons E18.5 i P7. Es van seccionar els ronyons i es van escollir seccions per a la quantificació glomerular cada 125 µm per evitar el recompte d'iteració dels glomèruls. Es va comptar manualment el nombre de glomèruls de cada secció i es va mesurar l'àrea de cada ronyó amb el programari Fiji ImageJ (V1.51) mitjançant l'esquema manual del contorn. Per calcular les densitats glomerulars, el nombre total de glomèruls

Fig. 9. Esquema dels efectes de l'excés de GDNF en el desenvolupament dels ronyons de ratolí. (A) En els ronyons embrionaris en creixement actiu, les cèl·lules progenitores de la nefrona (NPC, vermell) reben senyals d'orientació secretades (p. ex. Wnt11 i Wnt9b) de les puntes dels brots ureteris (UBT, blau fosc) per controlar l'equilibri de la proliferació de NP i l'auto-renovació. i la seva diferenciació en agregats peritubulars (PA, cúmul de cèl·lules rosades). (B) En els ronyons postnatals, es perd la identitat de la punta de la UB (UB, blau clar), com demostra molecularment la disminució de l'expressió de, per exemple, Wnt9b, Wnt11, Crlf1 i Etv4/5, indicada per lletres vermelles primes. La pèrdua gradual dels factors secretats derivats de la UB (Wnt9b, Wnt11 i Crlf1) contribueix a la disminució de la proliferació i l'auto-renovació de la NP. Paral·lelament, els nivells de GDNF i FGF disminueixen, cosa que coincideix amb la diferenciació accelerada de NP. Aquests junts esgoten ràpidament el conjunt de NP, donant lloc a la cessació de la nefrogènesi. ( C ) L'excés de GDNF als ronyons embrionaris indueix una morfologia UBT anormal i augmenta l'expressió de les molècules reguladores secretades derivades del brot (Crlf1, Sign, Wnt11 i Wnt9b). L'excés d'expressió de molècules secretades derivades dels brots té un efecte inhibidor sobre el cicle cel·lular de NP, donant lloc a una proliferació reduïda i una auto-renovació. Els números generals de NP disminueixen la diferenciació de PA, tal com es detecta per la disminució de l'expressió Wnt4. (D) Als ronyons postnatals, la morfologia UBT i, per tant, el nínxol que proporciona a l'NPS, es normalitzen malgrat l'expressió superior a la WT dels objectius secretats derivats del brot (Crlf1, Etv4/5 i Lama1). Juntament amb Wnt9b i Wnt11 normalitzats (no mostrats), aquests canvis moleculars subvencionen la proliferació, l'autorenovació i la diferenciació normals de NP, com ho demostra el manteniment d'una gran població de NP, una expressió Wnt4 més alta i una quantitat similar de precursors de nefrones (cúmuls rosats). de cèl·lules) com en els ronyons embrionaris WT. Mitjançant aquests mecanismes, l'excés constitutiu de GDNF sota el seu propi promotor permet que el programa nefrogènic continuï fins a P7. Text gris fosc, expressió sense canvis; text vermell, expressió disminuïda; text verd, expressió augmentada.

i el nombre de glomèruls a l'escorça es va comptar per separat. A continuació, es va calcular l'àrea renal total mitjana i els nombres globals i corticals de glomèruls per a cada mostra. La densitat glomerular mitjana es va calcular dividint el nombre glomerular mitjà per l'àrea mitjana mesurada. La mitjana dels glomèruls corticals dins de tota l'àrea mitjana es va calcular dividint el nombre glomerular cortical mitjà per l'àrea total mitjana mesurada. Només es van registrar glomèruls amb formes intactes. Quantificació del total de SIS2-NPS positius a E11,5 (n=4 per WT, n=5 per Gdnfhyper/hyper) i E12,5 (n{=10 ronyons/ tractament, tres experiments independents) es van basar en la tinció d'immunofluorescència de muntatge complet. Les imatges es van capturar amb l'aplicació de Zeiss ApoTome i després es van processar amb Imaris Software (Bitplane) mitjançant el seguiment puntual. Totes les imatges es van processar amb protocols d'anàlisi idèntics. Per tal de normalitzar la variació entre les camades, la quantitat mitjana de SIS2-NP positius als ronyons WT dins de cada camada es va establir al 100% i la quantitat de SIS2- NP positius al Gdnfhyper /hiper ronyons es va comparar amb la quantitat mitjana dels ronyons WT dins de la camada. L'índex mitòtic de SIS2-NPS positius en ronyons E12,5 (n=10 ronyons/tractament, tres experiments independents) cultivats amb GDNF exògen es va calcular de manera similar per normalitzar la variació entre camades.

La proporció mitjana de SIX {{0}}NP positius proliferants als ronyons WT i els ronyons cultivats sense GNDF exògena dins de cada camada es va establir en un 1{{00 per cent i la proporció de SIX{{2 proliferants. }} NPs positius en presència d'excés de GDNF (Gdnfhyper/hyper ronyons i aplicació exògena) de la mateixa camada es van representar a la figura després de comparar-los amb els companys de camada WT. L'índex mitòtic de SIS2-NPS positius en ronyons E11,5 cultivats amb GDNF exògen es va representar com a dades/valor originals. El càlcul de la mitjana de SIS 2-NPS positius per nínxol nefrogènic (E14,5 i P0) i nínxols nefrogènics amb progenitors (P{3-P6) es va realitzar mitjançant tinció d'immunofluorescència en seccions de parafina. El nombre de SIS2-NPS positius es va comptar amb el programari Fiji ImageJ (V1.51) a cada secció seleccionada per a l'anàlisi mitjançant l'anàlisi de partícules i el nombre de consells es va comptar manualment a les seccions corresponents. El nombre de mostres analitzades a E14.5 va ser de tres ronyons per a WT i Gdnfhyper/hyper i dos ronyons per a Gdnfhyper/hyper; Wnt11 més /−. El nombre de consells analitzats a E14.5 va ser de 207 a WT, 431 a Gdnfhyper/hyper i 107 a Gdnfhyper/hyper; Wnt11 més /− ronyons. El nombre de mostres analitzades a P0 va ser de tres ronyons per genotip, i un nombre de puntes analitzades, que es presenta a les xifres corresponents, varia de 10 a 315, sent la més baixa en els ronyons WT P6, en els quals les puntes són poques vegades presents. Les mesures de punta UB es van realitzar mitjançant el programa LAS X del sistema operatiu del microscopi Leica després de 48 h de cultiu en presència de productes químics especificats i visualització de les puntes amb anticòs E-cadherina (taula S1). Les puntes es van mesurar a partir de sis ronyons en cada condició de dos conjunts independents d'experiments en què el nombre de puntes mesurades va ser: 101 per a GDNF, 131 per a IWR1 i 115 per a 75 µM IWR1 més 50 ng/ml GDNF. Les mesures de la mida del ronyó en experiments que avaluaven l'efecte de la supressió de Wnt11 al fons Gdnfhyper/hyper es van realitzar amb el programari Fiji ImageJ (V1.51) en imatges de muntatge complet mitjançant el traçat manual del contorn del ronyó. Anàlisi estadística Tots els valors es presenten com a mitjana ± sem excepte l'anàlisi dels efectes principals de Gdnf i Wnt11 sobre la mida del ronyó, que es mostra com a mitjana ± sd La significació estadística es va establir a P<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

Agraïments Agraïm al personal de les Unitats d'Imatge i Microscòpia Lluminosa de Biomedicum de l'Institut de Ciències de la Vida d'Hèlsinki (HiLIFE) per la seva valuosa ajuda en l'anàlisi d'imatges i tècniques relacionades amb la quantificació. Els ratolins Wnt11 van ser amablement proporcionats pel professor Seppo Vainio (Universitat d'Oulu, Finlàndia) i enviats al Centre d'Animals de Laboratori de HiLIFE, Universitat d'Hèlsinki.