Descobriment i identificació de potencials constituents actius anti-melanogènics de Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 i Hongjiang Chen1,2*

Resum

Antecedents:Bletilla striata és la medicina principal de moltes fórmules clàssiques per blanquejar la pell en la medicina tradicional xinesa (TCM) i s'utilitza àmpliament a la indústria cosmètica recentment. No obstant això, els seus ingredients actius encara no estan clars i les seves arrels fibroses no s'utilitzen amb eficàcia. L'objectiu del present estudi és descobrir i identificar els seus potencials constituents actius anti-melanogènics mitjançant el model de peix zebra i l'acoblament molecular.

Mètodes:ElantioxidantLes activitats es van avaluar mitjançant l'activitat d'eliminació de radicals 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-etilbentiazolina-6-àcid sulfònic) (ABTS ) activitat eliminadora de radicals i reductor fèrricantioxidantassaig de potència (FRAP). L'activitat anti-melanogènica es va avaluar pertirosinasainhibidoractivitatin vitro i inhibidors de la melanina en el peix zebra. Els perfils químics es van realitzar mitjançant cromatografia líquida d'ultra alt rendiment combinada amb espectrometria de masses en tàndem de temps de vol de quadrupol (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Mentrestant, els potencials constituents actius anti-melanogènics es van identificar temporalment mitjançant l'acoblament molecular.

Resultats:L'extracte d'etanol al 95 per cent d'arrels fibroses de B. striata (EFB) posseïa les activitats inhibidores de DPPH, ABTS, FRAP i tirosinasa més fortes, amb IC50 5,94 mg/L, 11,69 mg/L, 6,92 mmol FeSO4/g, i 58,92 mg/L, respectivament. A més, l'EFB i l'extracte d'etanol al 95 per cent del tubercle de B. striata (ETB) van reduir significativament la síntesi de melanina dels embrions de peix zebra d'una manera dependent de la dosi. Es van identificar provisionalment 39 composicions químiques, inclosos 24 estilbenoides a partir d'EFB i ETB. L'acoblament molecular va indicar que hi havia 83 compostos (inclosos 60 estilbenoides) i 85 (inclosos 70 estilbenoides) que presentaven afinitats d'unió més fortes cap a la tirosinasa i l'adenilat ciclasa.

Conclusió:Les presents troballes van donar suport a la justificació de l'ús d'EFB i ETB com a agents naturals per blanquejar la pell a les indústries farmacèutiques i cosmètiques.

Paraules clau: Bletilla striata, antioxidant, activitat anti-melanogènica, UPLC-Q-TOF-MS/MS, peix zebra, atracament molecular

Feu clic a cistanche efectes secundaris i beneficis per antioxidant

Fons

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. és una planta herbàcia perenne àmpliament distribuïda a Àsia, com la Xina, Corea i Japó [1]. El tubercle sec de B. striata, també conegut com Baiji, registrat per primera vegada al Classic of Materia Medica de Shennong, s'ha utilitzat àmpliament com a medicina tradicional xinesa (TCM) durant milers d'anys a la Xina. Les farmacopees xineses diuen que posseeix la capacitat d'astringència a l'hemostàsia i l'analgèsia, per tant, es va utilitzar àmpliament per al tractament de l'hematemesi, l'hemoptisi, l'hemorràgia traumàtica, les úlceres, la inflor i la pell esquerdada [2, 3]. Els estudis farmacològics van demostrar que B. striata posseïa un ampli espectre d'activitats biològiques, com ara la cicatrització de ferides [4, 5], antiulcerosa [6, 7], hemostàtica [8],anti-inflamació[9], antioxidant[10], antibacterià [11], antigripal viral [12] i antienvelliment [13]. Al mateix temps, B. striata conté diverses classes de composicions químiques, incloentpolisacàrids[14], bibenzils, fenantrens, antraquinones,flavonoides, i 2-isobutilmalats [3, 15], etc.

B. striata és el medicament principal de moltes fórmules clàssiques per blanquejar la pell en TCM [16] i s'ha utilitzat àmpliament a la indústria cosmètica recentment [17]. Tanmateix, els seus ingredients actius encara no estan clars i fins i tot alguns resultats de la investigació van ser contraris. Per exemple, els resultats de la investigació donats per Chenet al. va indicar que l'extracte d'etanol del 95 per cent de B. striata posseïa una activitat inhibidora de la tirosinasa més alta que els del seu extracte d'aigua amb una taxa d'inhibició del 68,36 per cent in vitro[18], mentre que el resultat de Huang et al. va demostrar que l'activitat inhibidora de l'extracte d'aigua de B. striata sobre la tirosinasa era més forta que la de l'extracte d'etanol del 95 per cent amb una taxa d'inhibició del 62 per cent in vitro [19]. Els resultats de la investigació de Luetal.[20] i Linghuetal.[21] van demostrar que tant l'aigua com l'extracte d'etanol al 95 per cent de B. striata, especialment el seu fraccionament amb cloroform, podrien inhibir el creixement de les cèl·lules B16 i induir la seva apoptosi de manera dependent de la concentració.

Com que les proves in vitro d'inhibició de la tirosinasa i les línies cel·lulars de melanoma no van implicar les complexes condicions fisiològiques in vivo i l'absorció, el metabolisme, la distribució i l'excreció de la mostra de prova, moltes de les mostres van mostrar una activitat inhibidora significativa contra la tirosinasa i les línies cel·lulars de melanoma. vitro, tanmateix, va mostrar una eficàcia dèbil o fins i tot ineficaç in vivo [22, 23]. La glabridina va mostrar una activitat inhibidora de la tirosinasa significativa amb IC50 0.43μmol/L, que era 176 vegades més forta que la de l'àcid cògic. No obstant això, va tenir efectes no inhibidors sobre la pigmentació del peix zebra in vivo [24].

Mentrestant, les arrels fibroses de B. striata (FB) van ser els subproductes generats durant el processament de B. striatatuber (TB). Les investigacions modernes van indicar que el FB conté compostos similars amb TB i amb un contingut més alt de fenòlics [25]. A més, les activitats antibacterianes [26], antioxidants i antitirosinases de l'extracte de FB eren més fortes que les de l'extracte de TB [25]. Tanmateix, els recursos de FB no es van utilitzar eficaçment i es van abandonar a les terres de conreu, la qual cosa va provocar el malbaratament de recursos de FB i la contaminació ambiental [27].

El peix zebra (Danio rerio), un petit peix tropical d'aigua dolça, és un model animal emergent per a la farmacologia

i investigació de toxicologia in vivo, amb molts avantatges, com ara baix cost, cicle de vida curt, alta transparència, fàcil de mantenir, alta fertilitat i requerien menys mostres de prova [28, 29]. A més, el peix zebra té pigments de melanina a la superfície, cosa que permet una simple observació del procés de pigmentació i es va utilitzar àmpliament en l'estudi anti-melanogènic [28, 30].

En el present estudi, es van comparar les activitats antioxidants i inhibidores de la tirosinasa de polisacà-ride cru i extracte d'etanol del 95 per cent de TB i FB in vitro, i activitats anti-melanogèniques en el model de peix zebra. Mentrestant, els potencials components actius anti-melanogènics es van identificar temporalment mitjançant l'acoblament molecular. Hem descobert que el 95 per cent d'extracte d'etanol de TB (ETB) i FB (EFB) posseeix activitats significativament antioxidants i anti-tirosinases i pot reduir la síntesi de melanina dels embrions de peix zebra de manera dependent de la dosi. Així, ETB i EFB es poden utilitzar com a agents naturals per blanquejar la pell a les indústries farmacèutiques i cosmètiques.

Mètodes

Productes químics i reactius

La tirosinasa, la 3-(3,4-dihidroxifenil)-L-alanina (L-DOPA) i l'arbutina es van comprar a la companyia de reactius Aladdin (Xangai, Xina).2,2-difenil{{8 }}picrilhidrazil (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-etilbentiazolina-6-àcid sulfònic) (ABTS),6-hidroxi{-2,5,7 ,8-tetrametilcroman-2-àcid carboxílic (Trolox) i 2,4,6-tris ({2-piridil)-s-triazina (TPTZ) es van comprar a Sigma-Aldrich (Sant Louis, MO, EUA). L'acetonitril i el metanol (grau HPLC) es van comprar a Tedia (Fairfield, OH, EUA). L'aigua desionitzada es va preparar pel sistema d'aigua Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, EUA).

Procediment de recollida i extracció de plantes

B. striata es va recollir de Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, Xina). Els exemplars de val es van dipositar a l'Herbarium of Zhejiang Pharmaceutical College (núm. d'adhesió 190615). Tota la planta es va dividir en tubercles i arrels fibroses. Posteriorment, es tallaven en trossos petits i es van assecar per liofilització al buit, respectivament.

Les mostres seques i en pols (TB i FB) es van extreure per reflux amb etanol al 95 per cent durant tres vegades (1,5 h per cada vegada). L'extracte es va filtrar amb un paper de filtre What man (núm. 1). El filtrat es va concentrar a la sequedat en un evaporador rotatiu (Hei-VAP, Heidolph, Alemanya) a 50 graus i es va assecar posteriorment amb un assecador de congelació al buit. Els rendiments d'extracció amb etanol de TB (ETB) i FB (EFB) van ser del 5,21 i del 6,53 per cent, respectivament. Les escombraries es van utilitzar per extreure el polisacàrid brut dispersant en aigua a 80 graus durant 4 hores i precipitant-lo amb etanol [31]. Els rendiments de polisacàrids de TB (PTB) i FB (PFB) van ser del 14,75 i del 6,45 per cent, respectivament.

extracte de cistanche

Anàlisi química

L'anàlisi química es va realitzar en una cromatografia líquida d'ultra alt rendiment combinada amb espectrometria de masses en tàndem de temps de vol de quadrupol (UPLC-Q-TOF-MS/MS). La separació cromatogràfica es va realitzar en un sistema Waters Acquity UPLC (Waters Corp., Milford, MA, EUA) amb una columna WatersBEH Shield RP C18 (100×2,1 mm, 1,7 μm) a 3{ {43}} grau . La fase mòbil estava formada per un 0,1% d'àcid fòrmic en aigua (A) i acetonitril (B), amb un gradient lineal: 0-3min, 5-16% B; 3–8 min, 16–30 per cent B; 8–10 min, 30–35 per cent B; 10–15 min, 35–55 per cent B; 15–18 min, 55–80 per cent B;18–19 min, 80–5 per cent B; 19-20 min, 5 per cent B. El cabal era de 0,3 ml/min i el volum d'injecció era de 2 μL.

Els experiments TOF-MS/MS es van realitzar mitjançant una espectrometria de masses AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, CA, EUA) equipada amb ionització per electrospray (ESI). La detecció de MS es va dur a terme mitjançant el mètode d'ionització negativa. Els paràmetres es van establir de la següent manera: la temperatura de la font i la desolvació eren de 100 graus i 450 graus respectivament; el cabal de gas de desolvació era de 900 L/h; la tensió capil·lar era de 2 kV; la tensió del con era de 40 V; l'energia de col·lisió va ser de 22 eV; i l'espectre d'exploració complet va ser de 100 a 2000 Da.

Assajos d'antioxidants Activitat eliminadora de radicals DPPH

L'activitat d'eliminació de radicals DPPH es va determinar d'acord amb Ali et al. amb lleugeres modificacions [32]. Breument, es va barrejar 50 μL de solució de mostra de prova amb 150 μl de solució d'etanol LDPPH (0,2 mM) en plaques de 96-pous i es va mantenir a la foscor durant 30 minuts . L'absorbància de la mescla a 517 nm (A1) es va avaluar mitjançant un espectrofotòmetre de microplaques (Thermo Fisher Scientific, Amèrica). La solució en blanc sense mostra de prova barrejada amb solució de DPPHetanol es va establir com a grup positiu (A0). La solució en blanc sense DPPH barrejada amb la solució de mostra de prova es va establir com a grup en blanc (A2). Tots els experiments es van executar per triplicat. La taxa d'eliminació de radicals DPPH es va calcular mitjançant la fórmula següent:

Taxa d'eliminació de radicals de DPPH (per cent) {{0}} [A0-(A{1-A2)]/A0 × 100 per cent .

Activitat d'eliminació radical de l'ABTS

La capacitat d'eliminació de radicals ABTS es va mesurar mitjançant el mètode descrit per Ali et al. [32]. Breument, es va barrejar una solució aquosa de 7 mMABST amb persulfat de potassi 2, 45 mM en una proporció d'1: 1 (v / v) i es va incubar a temperatura ambient a la foscor durant 16 h per obtenir la solució d'absorció ABST més. La solució de reserva es va diluir amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) per ajustar l'absorbància de (0.72±0.2) a 734 nm. Es van barrejar a fons mostres de prova de 20 μL a diferents concentracions amb 180 μL de solució ABTS més. Les mescles reactives es van mantenir a la foscor durant 5 minuts i posteriorment es van mesurar l'absorbància (B1) a 734 nm. L'absorbància de les mescles sense mostra de prova i ABST plus es van establir com a B i B, respectivament. Tots els experiments es van executar per triplicat. La taxa d'eliminació de radicals ABTS es va calcular segons la fórmula següent:

Taxa d'eliminació de radicals ABTS (per cent) {{0}} [B0-(B{1-B2)]/B0 × 100 per cent .

Assaig de poder antioxidant reductor de fèrric (FRAP)

L'activitat reductora del ferro fèrric es va determinar segons els procediments de Kosakowska et al. [33]. Es van barrejar 30tampó d'acetat 0 mM, TPTZ 10 mM (2,4,6-tris ({2-piridil)-s-triazina) i FeCl3 20 mM a (v/v/v) proporció de 10:1:1 per preparar el reactiu de treball. Es van barrejar 100 μL de cada solució de mostra de prova amb 100 μL de reactiu de treball TPTZ, es van incubar a 37 graus durant 20 min i es va determinar l'absorbància a 593 nm. Mentrestant, es van utilitzar una sèrie de solucions estàndard de FeSO4 en els intervals de concentració de 0 a 1000 ug/mL per preparar la corba de calibratge. La capacitat reductora fèrrica es va calcular en la formació d'un complex blau Fe2 més -TPTZ intens. Els resultats es van expressar com a Fe2 més capacitat antioxidant (mmol FeSO4/g d'extracte).

Activitat inhibidora de la tirosinasa

Les activitats inhibidores de la tirosinasa es van determinar mitjançant un mètode espectrofotomètric utilitzant L-DOPA com a substrat [34]. Breument, es van barrejar solucions de mostra de 50 μL a diferents concentracions amb 50 μL de tirosinasa (200 unitats/mL, dissolta en tampó fosfat de pH 6,8) al pou 96- plaques i incubar durant 15 minuts a 25 graus. A continuació, es va iniciar la reacció amb l'addició de L-DOPA (50 μL). Després d'incubar 30 min a 25 graus, es va determinar l'absorbància a 490 nm (Aa) mitjançant un espectrofotòmetre de microplaques cel·les multiskan (ThermoFisher Scientific, Amèrica). De la mateixa manera, es va detectar al mateix temps l'absorbància dels pous de mostra sense tirosinasa (Ab) i dels pous de control amb enzim però sense mostra (Ab). L'activitat inhibidora de la tirosinasa es va calcular amb l'equació següent:

Taxa inhibidora de la tirosinasa (per cent)=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 per cent.

L'IC50 es va calcular mitjançant l'equació GraphPad Prism de la següent manera:

Y=min més (màx − min)/1 més 10(x−logIC50)×Pendent del turó

X representava la concentració d'inhibidor; Y representava les dades d'inhibició (per cent) juntament amb els seus valors mínims (min) i màxims (màxim); El pendent del turó és el factor de pendent.

Cistanche inhibeix l'activitat de la tirosinasa.

Inhibició de la melanina en el peix zebra

El peix zebra de la línia AB de tipus salvatge (proporcionat per Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, província de Zhejiang) es va allotjar a l'aigua dels peixos (0,2 per cent de sal oceànica instantània en aigua desionitzada, pH 6,9-7,2, conductivitat 48{ {18}}–510 mS/cm, i duresa 53,7–71,6 mg/L CaCO3) en un fotoperíode clar/fosc de 14/10 h a una temperatura constant de 28 ± 0,5 graus, i s'ha alimentat amb salmorra viva dues vegades al dia. Els embrions de peix zebra es van obtenir a partir de la posta natural i es van recollir en 30 minuts. L'assaig de peix zebra va ser acreditat per l'Associació per a l'avaluació i l'acreditació de la cura dels animals de laboratori (AAALAC). El present estudi va ser aprovat per l'IACUC (Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals) de Hunter Biotechnology, Inc. i el número d'aprovació de l'IACUC era 001458.

Els embrions a l'etapa de 6 hores després de la fecundació (hpf) es van tractar cada extracte a sis concentracions (10, 30, 62,5,125, 250 i 500 mg/L) durant 72 h per avaluar la concentració màxima no letal (MNLC). ). Com a resultat, els MNLC de tot l'extracte eren de més de 62,50 mg/L. Es van col·locar 10 embrions en 6-pou i es van exposar mostres envasades a concentracions de 10 i 30 mg/L de 6 hpf a 54 hpf (exposició de 48 h). ). Es van utilitzar DMSO (0, 05 per cent, v/v) i arbutina (10 i 30 mg/L) com a control normal i positiu, respectivament.

Els embrions sincronitzats es van recollir i observar en un estereomicroscopi (SZX7, Olympus, Japó) equipat amb una càmera digital (VertA1, Xina). L'acumulació de melanina, directament correlacionada amb les àrees de pigmentació del peix zebra, es va calcular mitjançant el programa de manipulació GNUImage (GIMP versió 2.10.2) i es va expressar com a percentatge respecte al control negatiu (acumulació de melanina al 100 per cent) [28, 30].

Estudi de l'acoblament molecular

158 compostos aïllats de B. striata a la literatura[2], inclosos 19 glicòsids, 28 bibenzils, 19 fenan-trenes, 18 bifenantrens, 23 dihidrofenantrens, 5 antocians, 11 esteroides, 8 triterpenoides, 12-5-quinoles, 12 àcids esteroides. i 10 compostos més, es van utilitzar com a lligands. Les estructures 3D van ser dibuixades per ChemBio3D i es van optimitzar mitjançant MM2 i Autodock Tools. L'estructura cristal·lina 3D de la tirosinasa (PDBID: 5M8N) i l'adenilat ciclasa (PDB ID: 5IV3) es van recuperar del Banc de dades de proteïnes RCSB (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Totes les molècules d'aigua i els heteroàtoms es van eliminar de les estructures cristal·lines mitjançant Chimera i MGL Tools. Finalment, Autodock

La vina es va utilitzar per acoblar la proteïna receptora amb els lligands de molècules petites. Els paràmetres del lloc d'acoblament de proteïnes del receptor es van establir com a -36,700, 7,034, -19,104 i -17,467, -22,807, 2,786, respectivament, segons el lligand mimosina original i LRE1 [35]. Per tal d'aconseguir una major precisió computacional, es van generar 20 paràmetres d'exhaustivitat per a cada receptor i es va seleccionar la conformació amb més afinitat com a conformació d'acoblament final i es va visualitzar a Pymol2.3. Mentrestant, els lligands originals mimosina i LRE1 es van prendre com a control positiu [36].

Predicció ADMET in silico

Els 3 èxits principals de B. striata posseïen una millor afinitat d'unió amb la tirosinasa i l'adenilat ciclasa, van ser sotmesos a l'anàlisi ADMET. QikProp a Schrodingersuite es va utilitzar per calcular les seves propietats físiques i les característiques relacionades amb els fàrmacs, inclòs el pes molecular (MW), el coeficient de partició octanol/aigua previst (QPlogPo/w), la solubilitat aquosa prevista (QPlogS), la cèl·lula Caco-2 aparent prevista. permeabilitat per a la barrera intestinal-sang (QPPCaco), coeficient de partició cerebral/sang previst (QPlogBB), permeabilitat de la pell prevista (QPlogKp), IC50 previst per al bloqueig dels canals HERGK plus (QPlog HERG) i absorció oral humana prevista. Les propietats es van avaluar segons la regla de cinc de Lipin-ski i la literatura [37, 38].

Simulació de la dinàmica molecular

Per tal d'examinar l'estabilitat i les fluctuacions dinàmiques del complex lligand-proteïna en un entorn biològic simulat i validar encara més els resultats de l'acoblament, els compostos blestrin D (75) es van escollir com el lligand per a l'estudi de simulació de dinàmica molecular (MD), basat en el resultat d'acoblament molecular. El complex de blestrina D amb tirosinasa i adenilat ciclasa es van realitzar simulacions MD i es van executar durant 100 ns, utilitzant el mode d'aigua TIP3P. Es van calcular els valors de la desviació quadrada mitjana (RMSD) dels àtoms de la columna vertebral de proteïnes en relació amb l'estructura inicial per examinar l'estabilitat de la proteïna al llarg del període de simulació [39].

Resultats

Composició química

A la figura 1 es van mostrar els cromatogrames típics del cromatograma de pic de base d'ETB i EFB. Per identificar els components es va utilitzar el programari PeakView. La fórmula molecular es va assignar amb precisió amb un error de massa de 10 ppm. El pes molecular exacte i les fragments es van utilitzar per identificar els components segons la bibliografia i la base de dades d'estructura química lliure, com ChemSpider i Massbank. Com a resultat, es van identificar provisionalment 39 composicions químiques, incloent 24 estilbenoides (bibenzils, fenantrens i els seus derivats), 6 glicòsids, 4 àcids fenòlics, 3 quinones, 1 esteroide i 1 altre compost a partir de l'EFB i l'ETB. Al mateix temps, la seva semiquantificació relativa es va realitzar mesurant les àrees pics de cada compost en mode MS mitjançant els cromatogrames iònics extrets [40]. concentració) es van resumir a la taula 1.

Capacitat antioxidant

És ben sabut que la irradiació ultraviolada A (UVA) pot induir la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i mediar una melanogènesi excessiva a les cèl·lules de la pell. El polifenol natural era els inhibidors de la generació de ROS i podria ser responsable de l'activitat anti-melanogènica dels extractes de plantes [41]. , 42]. Així, en el present estudi, es va avaluar la capacitat antioxidant mitjançant DPPH, activitat d'eliminació de radicals ABTS i assaig FRAP. Els resultats (Taula 2 i Fig. 2) van mostrar que l'EFB (IC50=5.94mg/L) posseeix l'activitat d'eliminació de radicals DPPH més forta in vitro en comparació amb el PTB (IC{{50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285,81 mg/L) i ETB(IC{{50=65,25 mg/L). Es va observar una tendència similar a l'assaig ABTS i FRAP. Els extractes etanòlics del 95 per cent de TB i PB tenien una activitat antioxidant més forta in vitro que els seus polisacàrids bruts. A més, l'EFB presenta una activitat antioxidant més forta que l'ETB, que era coherent amb els resultats de la investigació anterior [25].

Activitat inhibidora de la tirosinasa

La tirosinasa va ser l'enzim clau limitant la velocitat en la via de la melaninbiosíntesi i es va utilitzar àmpliament per identificar el potencial dels productes naturals amb efecte anti-melanogènesi [43]. Els resultats (Fig. 3) van mostrar que l'ETB i l'EPB tenien una activitat inhibidora de la tirosinasa més forta que la PTB i PPB in vitro, la qual cosa era coherent amb els resultats d'investigacions anteriors [25]. EFB va mostrar una activitat d'inhibició de la tirosinasa més forta de manera dependent de la dosi (entre 20 i 200 mg/L) amb IC50=58.92mg/L que ETB (IC{{50=75.44mg/L) i el compost positiu arbutina (IC{{ {11}},02 mg/L).

Inhibició de la melanina en el peix zebra

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), que indica que el vehicle al 0,05 per cent de DMSO no va afectar la producció de melanina en embrions de peix zebra. No obstant això, després de l'exposició a les mostres provades i l'arbutina durant 48 hores, els embrions de peix zebra van mostrar diferents graus de deposició de melanina (Figs. 3B, 4), excepte el grup PFB de 10 mg/L. Es nota que els continguts relatius de melanina en els grups ETB 10 mg/L (78,38 per cent) i 30 mg/L (64,72 per cent) van ser significativament inferiors als grups de PTB 10 mg/L (93,06 per cent) i 30 mg/L (82,02 per cent) (p).<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Acoblament molecular

La tirosinasa és l'enzim que limita la velocitat en la biosíntesi de melanina: hidroxilació de la tirosina a 3,4-dihidroxi-fenilalanina (DOPA) i oxidació de la DOPA, topaquinona. Per tant, la tirosinasa s'ha considerat com un objectiu crític per al desenvolupament d'inhibidors de la melanogènesi [44]. A més, l'adenilateciclasa és l'enzim clau de la melanogènesi induïda per cAMP. La unió del polipèptid alfa de melanotropina (-MSH) als receptors MC1R va induir l'activació de l'adenilat ciclasa, l'augment del nivell d'AMPc, l'expressió augmentada del gen de la tirosinasa i, posteriorment, augmentar la síntesi de melanina [45]. Per tant, vam realitzar un estudi d'acoblament molecular dels 158 compostos aïllats de B. striata anteriorment [2], amb tirosinasa i adenilat ciclasa. Les energies d'unió dels lligands estudiats amb tirosinasa i adenilateciclasa es van resumir a la taula S1. Hi havia 83 compostos (inclosos 60 estilbenoides) i 85 (inclosos 70 estilbenoides) que presenten afinitats d'unió més fortes cap a la tirosinasa i l'adenilat ciclasa, comparant amb els dels lligands originals mimosina (−6,4 kcal/mol) i LRE1 (−8,5 kcal/mol) /mol). 1,8-bis(p-hidroxibenzil)-4-metoxifenantrè{-2,7-diol (56), blestrina D (75) i 2,7-dihidroxi -1,6-bis(p-hidroxibenzil)-4-metoxi{-9,10-dihidrofenantrè (93) van ser els tres lligands principals cap a la tirosinasa, amb energia d'unió −10,2, 10,0 i 9,7 kcal/mol, respectivament. Mentre que la blestrina D(75), la blestrina B (73) i el 3,3′-dihidroxi-5-metoxi{-2,5′,6-tris(p-hidroxibenzil) bibenzil (42) eren els tres principals lligands cap a l'adenilat ciclasa, amb energia d'unió -12,1, -11,9 i -11,6 kcal/mol, respectivament. Les seves afinitats d'unió teòriques i les interaccions lligand-aminoàcid es van resumir a la taula 3.

Val la pena assenyalar que la blestrina D (75), un compost de bifenantrè, va entrar a la butxaca d'unió de la tirosinasa i l'adenilat ciclasa (Fig. 5), i va mostrar afinitats d'unió significatives cap a la tirosinasa i l'adenilat ciclasa. Les interaccions de Van der Walls contribueixen al valor global d'interacció energètica, mentre que el grup hidroxil produeix enllaços d'hidrogen amb residus d'aminoàcids Glu 451, Arg114 de tirosinasa i Val 167 de l'adenilat ciclasa, respectivament (Taula 3 i Fig. S1). cap a la tirosinasa mitjançant la formació de 6 enllaços d'hidrogen amb residus d'aminoàcids Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 i Gln236.

Predicció ADMET in silico

Els valors previstos de diversos paràmetres importants juntament amb el seu rang acceptable es van resumir a la taula 4. A part del QPlogS de 3,3′,5-trimetoxibibenzil, blestrina B i blestrina D, i QPlogBBde 3,3′,{{6} }trimetoxibibenzil, totes les altres propietats ADMET calculades dels tres primers èxits estaven dins dels intervals esperats, mentre que el QPlog HERG de tots els tres primers èxits eren inferiors a -5, cosa que indica que eren potencials farmacològics per a ús humà. El QPlog Kp de tots els tres primers èxits tant per a la tirosinasa com per a l'adenilatciclasa, excepte el 3,3′,5-trimetoxibibenzil, es trobaven en el rang favorable, cosa que indica que aquests compostos poden penetrar fàcilment a la pell.

Simulació dinàmica molecular

La trama RMSD va mostrar que els valors RMSD del complex proteïna-lligant no van fluctuar significativament durant tot el període de simulació. Els valors RMSD (Fig. 6A) de la blestrina D amb el complex de tirosinasa i adenilat ciclasa es van determinar entre 1,5 i 2,8Å i de 2,0 a 3,6Å, respectivament. El valor de l'RMSF que reflecteix la flexibilitat de cada simulació de residus. Els residus amb valors RMSF més alts van revelar que eren més flexibles (Fig. 6B). Es va trobar que els valors RMSF dels residus d'aminoàcids a les regions del bucle fluctuaven molt. Mentre que, els residus de lloc actius van mantenir un valor RMSF petit (menys d'1.0Å), com ara Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 i Arg230in tirosinasa i Val167, Leu102, Phe45, Lys95 i Leu166ase in adenylate cyclase. indicant que les butxaques d'enquadernació es van mantenir estables. Les interaccions moleculars de la blestrina D amb la tirosinasa i l'adenilat ciclasa es van mostrar a la figura 7.

Les energies lliures d'unió es van calcular mitjançant el mètode de la superfície nascuda generalitzada per la mecànica molecular (MM-GBSA) [39]. L'energia lliure d'unió prevista de la blestrina D amb tirosinasa i adenilateciclasa era de -96,94 kcal/mol i -139,69 kcal/mol, respectivament, la qual cosa implica que les interaccions d'unió eren responsives (taula 5). A més, les contribucions a favor de la unió de lligands van ser la interacció de solvació no polar, van der Waals i la interacció electroestàtica.

Val la pena assenyalar que els tipus i continguts dels components químics a EFB eren més que a ETB. Les àrees màximes de tots els compostos identificats a l'EFB eren aproximadament el doble de les d'ETB. La mili-tarina va ser els compostos més abundants tant en EFB com en ETB, que posseïen importants activitats antioxidants, antiinflamatòries i neuroprotectores, i va ser escollit com a marcadors químics per al control de qualitat de B. striata a l'edició de la Farmacopea xinesa 2020 [46]. L'àrea màxima relativa de l'inEFB militar (38,39 × 106) va ser lleugerament superior a la de l'ETB (30,48 × 106). La gastrodina és un compost conegut en moltes herbes medicinals xineses, com ara Gastrodia elata, que presenta efectes inhibidors de la tirosinasa i eliminació radicals [30]. L'àrea màxima relativa de gastrodina a EFB (1,43 × 106) era lleugerament inferior a la de l'ETB (2,17 × 106).

Els extractes etanòlics del 95 per cent de TB i PB tenien una activitat d'antioxidació més forta in vitro que els seus polisac-càrids bruts. A més, l'EFB presenta una activitat antioxidant més forta que l'ETB, que era coherent amb els resultats de la investigació anterior [25]. Aquest fenomen es pot atribuir al fet que l'EFB conté un nivell més alt de compostos antioxidants, com ara militars i estilbenoides (polifenols vegetals naturals). Per exemple, l'àrea màxima relativa del 4,8,4′,8′-tetrametoxi-[1,1′-bifenantrè]-2,7,2′,7′-tetrol, un bifenantrè amb quatre grups hidroxil fenòlics, era de 9,15×106 en FB, mentre que era de 0,01×106 inTB.

En el present estudi, PPB i PTB van mostrar una lleugera activitat inhibidora de la tirosinasa de manera dependent de la dosi. No obstant això, va demostrar que no es va detectar cap activitat a l'extracte aquós de PB (conté PPB) [25]. Aquest fenomen pot ser degut a la diferent preparació de la mostra. L'extracte aquós de PB es va utilitzar per avaluar l'activitat inhibidora de la tirosinasa en l'experiment de Jiang [25], mentre que en el present estudi, l'extracte aquós es va precipitar amb etanol per obtenir el polisacàrid brut.

Recentment, el model de peix zebra s'ha utilitzat àmpliament en l'avaluació de l'efecte anti-melanogènesi in vivo [47, 48]. Arbu-tin, un compost de glucòsid d'hidroquinona existent en diverses plantes, que s'ha utilitzat comercialment a la indústria cosmètica, es va establir com a control positiu. Les activitats anti-melanogènesi d'ETB i EFB eren més fortes que les de l'arbutina, cosa que indica que ETB i EFB es poden aplicar com a agents per aclarir la pell a la indústria cosmètica.

L'àrea màxima relativa de la blestrina D a EFB (1,91 × 106), és aproximadament quatre vegades superior a la de l'ETB (0,46 × 1{0 ). L'àrea màxima relativa del compost 56 (8,73 × 106) i 93 (0,64 × 106) a EFB també és significativament superior a la de l'ETB (menys de 0,01 × 106 i 0,10 × 106). Aquesta pot ser una de les raons per les quals EFB presenta efectes anti-melanogènics més forts que l'ETB. És interessant assenyalar que els tres lligands principals de la tirosinasa i l'adenilat ciclasa pertanyen tots als estilbenoides (bibenzils, fenantrens i el seu derivat). Els estilbenoides són els polifenols naturals de les plantes, que ha despertat un gran interès en els últims anys per les seves notables bioactivitats com l'activitat antiinflamatòria, antimicrobiana i antioxidant [49]. El resveratrol és l'estilbenoide més comú. La investigació anterior va indicar que el resveratrol i els seus derivats poden inhibir significativament l'activitat catalítica, l'expressió gènica i les modificacions postraduccionals de la tirosinasa. Així, es van mostrar potencialment útils com a agents il·luminadors i antienvelliment en cosmètics [41, 50].

Cistanche es va mostrar potencialment útil com a agent per alleugerir la pell i antienvelliment en cosmètics.

Per a més informació, feu clic a la imatge.

Conclusions

En aquest estudi, es va investigar sistemàticament l'activitat antioxidant i anti-melanogènica del polisacàrid brut de B. striatatuber (PTB) i arrels fibroses (FPB) i el 95% d'etanolextract de B. striata tuber (ETB) i arrels fibroses (EFB). . Els resultats van mostrar que l'EFB posseïa l'activitat més forta de DPPH, l'activitat d'eliminació de radicals ABTS i l'activitat reductora del ferro fèrric. A més, l'ETB i l'EFB poden reduir significativament l'activitat de la tirosinasa in vitro i la síntesi de melanina dels embrions de peix zebra de manera dependent de la dosi. L'acoblament molecular va indicar que hi havia un gran nombre de compostos, la majoria pertanyien a estilbenoides, que presentaven afinitats d'unió més fortes cap a la tirosinasa i l'adenilat ciclasa, en comparació amb l'afinitat d'unió del lligand original. Les troballes actuals van donar suport a la raó per a l'ús d'ETB i EFB com a agents naturals per blanquejar la pell a les indústries farmacèutiques i cosmètiques.