La dissecció de les respostes d'anticossos de subjectes vacunats amb Gam-COVID-Vac suggereix la implicació d'epítops fora de RBD en la neutralització del SARS-CoV-2
Oct 16, 2023
Resum: Milions de persones han estat vacunades amb Gam-COVID-Vac, però les especificitats fines dels anticossos induïts no s'han estudiat completament. Es va obtenir plasma de 12 subjectes convalescents naïfs i 10 amb malaltia de coronavirus 2019 (COVID-19) abans i després de dues immunitzacions amb Gam-COVID-Vac. La reactivitat d'anticossos a les mostres de plasma (n=44) es va estudiar en un panell de proteïnes del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la síndrome respiratòria aguda severa plegada i desplegada recombinant microarrays i 46 pèptids que abasten l'espiga. proteïna (S) i mitjançant assaig immunoabsorbent lligat a enzims (ELISA) de la subclasse d'immunoglobulina G (IgG). La capacitat dels anticossos induïts per Gam-COVID-Vac per inhibir la unió del domini d'unió al receptor (RBD) al seu receptor enzim convertidor d'angiotensina 2 (ACE2) es va investigar en un assaig d'interacció molecular (MIA). La capacitat de neutralització de virus dels anticossos es va estudiar mitjançant la prova de neutralització de virus pseudotipats (pVNT) per a Wuhan-Hu-1 i Omicron. Vam trobar que la vacunació Gam-COVID-Vac va induir augments significatius d'IgG1, però no d'altres subclasses d'IgG contra la S plegada, la subunitat 1 de la proteïna d'espiga (S1), la subunitat de la proteïna de l'espiga 2 (S2) i la RBD d'una manera comparable en ingènus i convalescents. subjectes. La neutralització del virus estava altament correlacionada amb anticossos induïts per la vacunació específics per a RBD plegat i un pèptid nou (és a dir, pèptid 12). El pèptid 12 es va localitzar a prop de RBD a la part N-terminal de S1 i podria estar implicat en la transició de la conformació pre-post-fusió de la proteïna espiga. En resum, la vacunació Gam-COVID-Vac va induir anticossos IgG1 específics de S en subjectes ingènus i convalescents d'una manera comparable. A més dels anticossos específics per a RBD, els anticossos induïts contra un pèptid proper a l'extrem N-terminal de RBD també es van associar amb la neutralització del virus.
Paraules clau: SARS-CoV-2; COVID-19; Gam-COVID-Vac; epítop; anticossos; neutralització de virus; assaig d'interacció molecular; Omicron
Beneficis del suplement de cistanche: augmenta la immunitat
Feu clic aquí per veure els productes Cistanche Enhance Immunity
【Demanar més】 Correu electrònic:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Introducció
Després dels primers casos d'infecció amb la síndrome respiratòria aguda severa Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) a finals de 2019 a Wuhan, Xina, la malaltia del nou coronavirus (COVID-19) es va estendre ràpidament per tot arreu. el món i es va convertir en una pandèmia global [1–4]. El ràpid desenvolupament de vacunes contra la COVID-19 i la introducció de programes mundials de vacunació juntament amb l'aparició de variants menys patògenes del SARS-CoV-2 es consideren factors importants per a la reducció de les morts associades a la COVID-19- i la gravetat de la pandèmia [1,5]. Les primeres vacunes disponibles van ser vacunes genètiques basades en la transferència mediada per adenovirus del gen que codifica la proteïna superficial S del SARS-CoV-2 [6–8]. La proteïna SARS-CoV-2 S consta de la subunitat S1 que conté el domini d'unió al receptor (RBD) que s'uneix al seu receptor ACE2 a les cèl·lules humanes i la subunitat S2 que garanteix la unió del virus a la membrana de la cèl·lula hoste mitjançant la ruptura proteolítica del pèptid de fusió (FP) durant la infecció pel virus [9]. El gen S utilitzat per a la transferència de gens en determinades vacunes basades en adenovirus (p. ex., COVID-19 Vaccine Janssen) es pot modificar per estabilitzar la proteïna i influir en la seva divisió, però aquest no és el cas de les altres [10]. Les cèl·lules humanes que estan infectades per adenovirus que contenen el gen que codifica S produeixen una quantitat variable de l'antigen S que és alliberat i presentat pel complex principal d'histocompatibilitat (MHC) classe II a les cèl·lules T, donant lloc a l'ajuda de les cèl·lules T CD4+. per a la producció d'anticossos específics de S. La proteïna S expressada per les cèl·lules transfectades també es presenta per l'MHC classe I a la superfície de la cèl·lula infectada i desencadena l'activació de cèl·lules T CD8+ citotòxiques S específiques, que poden reconèixer les cèl·lules productores d'antigen S i destruir-les. El principi de vacunació, és a dir, la introducció d'informació genètica que codifica S a les cèl·lules hostes i la posterior producció d'antigen S per part de les cèl·lules infectades, és similar a les vacunes d'àcid ribonucleic missatger (ARNm), tot i que la tecnologia de transferència de gens difereix de l'adenovirus. vacunes a base de Així, les "vacunes genètiques" imiten fins a cert punt una infecció natural per SARS-CoV-2. La identificació d'epítops reconeguts pels anticossos de subjectes vacunats implicats en la neutralització del virus és crucial no només per entendre el mecanisme d'acció de les vacunes existents, sinó també per al desenvolupament d'estratègies refinades de vacunació activa i d'immunització passiva contra COVID-19 [11]. ,12]. La majoria de les vacunes actuals se centren en l'obtenció d'una resposta d'anticossos específica de S amb especial atenció a la resposta d'anticossos específica de RBD perquè s'ha vist que els anticossos específics de RBD estan correlacionats amb una alta activitat neutralitzant contra SARS-CoV-2 [ 13–15]. Tanmateix, el nombre de mutacions adquirides per cada nova variant de preocupació (VOC), indica la importància d'identificar els epítops conservats entre els VOC dirigits per anticossos neutralitzants que es troben no només a RBD sinó també fora de RBD [16]. De fet, hi ha estudis que indiquen la presència d'epítops neutralitzants fora de RBD, que són reconeguts pels anticossos després de la immunització [17–20]. El 2020, la vacuna basada en vectors Gam-COVID-Vac, també anomenada Sputnik-V, va estar disponible per al seu ús en la pràctica clínica i actualment s'ha aprovat per al seu ús en més de 70 països (https://sputnikvaccine.com/about-vaccine). / (consultat el 17 de gener de 2023)). Segons el recurs Our World In Data (OWID), 79 milions de persones a Rússia van rebre almenys una injecció de la vacuna i 72 milions estan totalment vacunades (https://ourworldindata.org/covid-vaccinations?country= RUS (consultat el 22 de març de 2022)). Gam-COVID-Vac consta de dos tipus de vacunes, que es basen en dos vectors d'adenovirus humans diferents (hAd26 i hAd5) que porten la forma nativa de la proteïna S de la soca SARS-CoV{-1 de Wuhan-Hu-1. 73}}. Sputnik-V consta de dues injeccions, una amb hAd26 i una segona amb hAd5 i llum Sputnik, amb només hAd26. Els dos vectors d'adenovirus diferents s'utilitzen per a la primera i la segona immunització per reduir la possibilitat que els subjectes vacunats produeixin immunitat a la proteïna S contra l'adenovirus. De fet, els anticossos específics d'adenovirus limitarien l'eficàcia de les vacunacions de reforç mitjançant la neutralització del vehicle vector de l'adenovirus. Per tant, el 21è dia després de l'administració de la primera dosi d'una vacuna amb rAd26, es realitza el lliurament d'antigen repetit amb el vector rAd5 [8, 21]. Pocs estudis han investigat en una mesura apreciable les respostes d'anticossos específiques de S i RBD i l'activitat de neutralització del virus en sèrums de vacunats Gam-COVID-Vac [10,22,23]. S'han informat augments d'anticossos IgG específics de RBD tres mesos després de l'administració de Gam-COVID-Vac i s'ha demostrat que els anticossos reaccionen creuament amb variants preocupants Alpha, Beta, Delta i Omicron [24-26]. Gam-COVID-Vac també s'ha comparat amb diverses altres vacunes amb llicència contra SARS-CoV-2, que van mostrar una alta neutralització del virus i una alta eficàcia contra la mortalitat relacionada amb la COVID{102}} per Sputnik-V, tot i que una lleugera inferioritat es va trobar a algunes vacunes d'ARNm pel que fa a la neutralització del virus [24]. Finalment, s'ha demostrat que la immunització de pacients amb Gam-COVID-Vac tractats amb teràpia antiretroviral (tractats amb ART) positius pel virus de la immunodeficiència humana (VIH+) mostra una eficàcia epidemiològica contra el tipus salvatge original i la variant Delta del SARS-CoV{{ 113}} [27]. Tanmateix, fins ara no s'ha realitzat una anàlisi detallada del reconeixement d'epítops per anticossos en subjectes vacunats amb Gam-COVID-Vac i es necessiten dades per entendre l'isotip d'immunoglobulina i les respostes de la subclasse d'IgG en subjectes vacunats amb Gam-COVID-Vac. Aquí vam investigar dos grups de subjectes que havien estat vacunats amb Gam-COVID-Vac, un que havia tingut una infecció prèvia per SARS-CoV-2 i un altre grup de subjectes naïfs per SARS-CoV-2. Hem realitzat una anàlisi meticulosa de l'especificitat de l'epítop dels anticossos induïts mitjançant proteïnes i pèptids plegats i desplegats derivats del SARS-CoV-2-de microarrays que abasten la proteïna S completa, inclosa la RBD. A més, es van analitzar les respostes de la subclasse IgG. El nostre estudi revela que els subjectes vacunats amb Gam-COVID-Vac munten anticossos específics de RBD capaços de bloquejar la interacció RBD-ACE2. Curiosament, vam trobar que la neutralització del virus també estava associada amb anticossos dirigits contra un pèptid fora de RBD, que pot estar implicat en la transició de la conformació preto-post-fusió de la proteïna espiga.
cistanche tubulosa: millora el sistema immunitari
2. Resultats
2.1. Els subjectes vacunats amb Gam-COVID-Vac inclouen subjectes naïfs i convalescents de la COVID-19
Els subjectes convalescents van ser infectats per la soca Wuhan-Hu-1 segons la seva prevalença i les dades de seqüenciació obtingudes en el moment de la infecció a la regió de Moscou. Els subjectes naïfs no tenien símptomes de COVID-19 i no tenien anticossos específics del SARS-CoV-2-en el moment del reclutament. Els subjectes de l'estudi van incloure 15 dones i 7 homes amb una edat mitjana de 60 anys (és a dir, 25-70 anys) (taula 1).
Taula 1. Característiques demogràfiques, clíniques i serològiques dels subjectes.
Es va obtenir una mostra de plasma de cadascun dels subjectes en el moment 0 (és a dir, la línia base) (figura 1A), després cada subjecte es va vacunar amb Sputnik-V amb un interval d'aproximadament 21 dies entre el primer i el segon. injecció (punts de temps 1 i 2). Al punt de temps 3 es va recollir una segona mostra de plasma per determinar les respostes d'anticossos induïdes per la vacuna (figura 1A). Els subjectes es van observar durant 120 dies addicionals. El dia 110 després de la vacunació final, un subjecte (és a dir, el subjecte 22) tenia COVID-19, mentre que els altres no havien desenvolupat cap símptoma de COVID-19 (taula 1).
Figura 1. Disseny de l'estudi i respostes d'anticossos específiques del SARS-CoV-2- abans i després de la vacunació amb Sputnik-V. (A) Disseny de l'estudi. Es van obtenir mostres de plasma de subjectes naïfs (n=12) i convalescents (n=10) a la COVID-19-en el moment 0 (línia de base), després els subjectes van rebre dos Sputnik-V vacunacions als punts 1 i 2, respectivament, i es va obtenir una mostra de plasma al punt 3 (és a dir, el dia 80-85 després de la primera vacunació). (B) Nivells d'anticossos IgG específics de la nucleocàpsida (eix y: ISU) en subjectes naïfs i convalescents (eix x) a la línia de base. La línia horitzontal indica el tall per a la positivitat. (C) Nivells d'anticossos IgG (eixos y: ISU) específics per a RBD, S, S1 i S2 en subjectes en el punt temporal 0 i 3 (eixos x). (D) D'esquerra a dreta, els nivells d'anticossos IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 (eixos y: valors OD de densitat òptica) a S (part superior) i RBD (part inferior) als punts de temps 0 i 3 ( eixos x). S'indiquen diferències significatives entre els grups determinats per la prova de Wilcoxon: ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns: no significatiu.
2.2. La vacunació Gam-COVID-Vac indueix amplies respostes d'IgG a S, incloent S1, RBD i S2
Beneficis del suplement de cistanche: augmenta la immunitat
Hem realitzat una anàlisi detallada de les respostes d'anticossos cap a un gran panell de proteïnes i pèptids SARS-CoV-2 plegats i desplegats amb microarrays que abasten la proteïna S en mostres de plasma de subjectes naïfs i convalescents del SARS-CoV-2- després d'un curs complet d'immunitzacions amb Gam-COVID-Vac (Figura 1A, B; Taula 1). Quan es comparen mostres de plasma del punt temporal 0 i del punt temporal 3 després de la vacunació, es va trobar una inducció significativa de respostes d'IgG contra RBD, S, S1 i S2 plegats però no desplegats (figura 1C). Tres mesos després de la vacunació, els subjectes van mostrar un augment 21-de vegades d'anticossos IgG específics de RBD (p <0.{{20}}001) i un {{ Augment de 18}} vegades dels anticossos IgG específics de S (és a dir, punt de temps 0: mediana 0,291, punt de temps 3: mediana 5,778) (p <0,0001), respectivament. Els anticossos IgG a S1 van augmentar 3.7-vegades (p=0,0023) i els anticossos IgG a S2 van augmentar 2.8-vegades (p {= 0,0094) (figura 1C) ). La vacunació amb Gam-COVID-Vac va induir principalment respostes IgG a S, S1 i RBD plegats de manera comparable en subjectes naïfs i convalescents (figures 1C, S2 i S3), cosa que indica que es pot utilitzar per augmentar el SARS-CoV-2- Respostes d'anticossos específiques també en subjectes convalescents. Es van observar augments significatius dels anticossos IgG contra RBD, S i S1 en subjectes naïfs i convalescents (figura S2) i no hi va haver diferències significatives pel que fa als nivells d'IgG a RBD, S, S1 i S2 en subjectes naïfs i convalescents en el moment 3. (Figura S3).
2.3. La vacunació Gam-COVID-Vac indueix principalment una resposta de subclasse IgG1 a S i RBD
S'ha informat que la immunoteràpia específica d'al·lèrgens (AIT) indueix principalment respostes IgG1 i IgG4 específiques d'al·lèrgens que difereixen no només pel que fa a les seves funcions efectores (la IgG1 pot mediar la citotoxicitat cel·lular dependent d'anticossos (ADCC) i l'activació del complement, mentre que la IgG4 no té aquestes respostes). funcions efectores), però també pel que fa a la seva cinètica (IgG1: inici ràpid i declivi precoç: IgG4: inici lent però nivells sostinguts) [28–30]. Per tant, vam investigar les respostes de la subclasse IgG (és a dir, IgG1-IgG4) a S i RBD en subjectes vacunats amb Sputnik-V. La figura 1D mostra que la vacunació va induir gairebé exclusivament una resposta de subclasse IgG1 a S i RBD. Després de la vacunació es van trobar augments significatius dels nivells d'IgG1 específics per a S i RBD (p=0,0002 i p=0,0071, respectivament). Tanmateix, no es van poder detectar respostes de subclasses IgG2, IgG3 o IgG4 rellevants específiques per a S i RBD (figura 1D).
2.4. Inducció d'anticossos neutralitzadors de virus i anticossos que inhibeixen la interacció RBD-ACE2 mitjançant la vacunació Gam-COVID-Vac
Per a la detecció d'anticossos neutralitzadors de virus, vam utilitzar una prova pVNT, on les partícules semblants a virus es van pseudotipar amb proteïna S de la soca original de Wuhan-Hu-1 i el VOC Omicron descrit recentment. Es van trobar anticossos amb activitat neutralitzant per a la soca Wuhan Hu-1 en tots els 22 subjectes menys un (és a dir, el subjecte 22) (figura 2A, taula 2), mentre que els títols d'anticossos neutralitzants per a Omicron eren significativament inferiors (figura 2B) i es troba només en 17 de 20 subjectes (figura 2A, taula 2). No es va trobar cap neutralització rellevant per als subjectes 6, 7, 10, 11, 15 (figura 2A, taula 2). Els títols de neutralització de virus per a Omicron van ser 25 vegades més baixos que per a WT (mediana 141, 9 i 5, 7 per a Wuhan-Hu-1 i Omicron, respectivament) (figura 2B).
Figura 2. Activitat neutralitzadora de virus al plasma 3 mesos després de la vacunació Sputnik-V i associació amb respostes d'anticossos IgG a pèptids derivats de RBD i S. (A) La neutralització del virus (ID50) (eix y) contra la soca Wuhan-hu-1 (verd) i Omicron (taronja) es va obtenir amb plasma de naïf (blau) i convalescent (vermell) matèries (eixos X). (B) Comparació de la neutralització del virus (eix y: ID50 obtingut per al plasma dels subjectes provats, les barres representen mitjanes amb rang interquartil (IQR) Wuhan Hu-1 (verd) i Omicron (taronja) . La línia horitzontal representa els resultats obtinguts amb plasma d'un subjecte control sa i no infectat (control sa, HC) Les diferències significatives entre les soques es van determinar mitjançant la prova de Mann-Whitney: **** p < 0. {{30}}001. (C) Localització de RBD i pèptids correlacionats amb la neutralització del virus en un esquema de S (S1, S2). (D) Correlacions entre els títols de neutralització del virus per a Wuhan-Hu{{19 }} (WT) o Omicron (eixos y) i nivells d'IgG específics per a RBD i pèptids derivats d'espigues 12, 32 i 46A (eixos x: ISU). Els símbols blaus i vermells indiquen subjectes naïfs i convalescents, respectivament. Asteriscs indiquen correlacions significatives segons la prova no paramètrica de Spearman, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 **** p < 0,0001, ns=no significatiu.
Taula 2. Comparació dels nivells d'IgG específics per a S, S1, S2 i RBD mesurats per microarrays amb inhibicions de la unió de RBD a ACE2 i títols de neutralització de virus (Wuhan-Hu-1, Omicron) determinats per al plasma de la subjectes investigats. El mapatge de calor es va realitzar per a cada paràmetre per separat mitjançant Excel. El nivell més alt es considerava vermell fosc i el més baix era blanc.
El fet que en tots els subjectes menys un (és a dir, el subjecte 22) els anticossos neutralitzadors del virus augmentin després de la vacunació indica que van ser induïts per la vacunació (taula 2). El subjecte 21 ja va mostrar un alt bloqueig de la interacció RBD-ACE2 a MIA i una alta neutralització del virus a la línia de base (taula 2). En particular, les mostres de plasma de subjectes convalescents vacunats amb Gam-COVID-Vac que tenien una malaltia moderada (núm. 1, 2, 17, 18, 21) tenien títols de neutralització del virus més alts que les de subjectes convalescents que tenien malaltia lleu (núm. 22) o sense símptomes. (#4, 5, 7, 9) (Taules 1 i 2). Tanmateix, una troballa clau va ser que la inhibició de la unió de RBD a ACE2 i la neutralització del virus no sempre estaven associades. Una inhibició de més del 25% de la unió de RBD Wuhan Hu-1 a ACE2 només es va produir per a 6 subjectes que també havien mostrat inhibició a la prova de neutralització del virus a causa de la vacunació (és a dir, subjectes 1, 2, 3, 17, 18). , i 19) (Taula 2). Curiosament, es va observar activitat neutralitzant del virus (dosi infecciosa del 50% (ID50) > 100) per a 6 subjectes, tot i que no van mostrar una inhibició de la unió RBD a ACE2 o no van mostrar una inhibició baixa (Taula 2: Subjectes 6, 10, 12, 13, 16, 20) .
2.5. La neutralització del virus en subjectes vacunats amb Gam-COVID-Vac està fortament correlacionada amb les respostes d'IgG a RBD i al pèptid 12 derivat de la S
Com s'ha indicat abans, el plasma de diversos subjectes vacunats amb Gam-COVID-Vac (per exemple, en els subjectes 6, 10, 12, 13, 16, 20; Taula 2) va mostrar activitat neutralitzadora del virus, però no va inhibir la interacció RBD-ACE2. Per tant, vam analitzar la reactivitat dels anticossos IgG als pèptids que abasten la proteïna S mitjançant l'anàlisi de xips basat en microarrays [13] (figura S4 i figura 2C) i correlacionem respostes IgG específiques de pèptids amb la neutralització del virus de Wuhan-Hu {{19} } soca i Omicron (figura 2D). Les respostes d'IgG a tres pèptids (és a dir, pèptids 12, 32, 46A), com ara les respostes d'IgG a RBD plegat, es van correlacionar significativament amb la neutralització de la soca Wuhan-Hu-1 (figura 2C, D). El pèptid 12 va destacar perquè les respostes d'anticossos al pèptid 12 desplegat (figura S1), però no als pèptids desplegats 32 i 46A van ser augmentades significativament per Gam-COVID Vac en subjectes ingènus (figura 3A) i també es van correlacionar significativament amb la neutralització d'Omicron (figura 2D). ). No es va observar cap augment significatiu dels subjectes convalescents als pèptids 12, 32 o 46A (figura 3A). La seqüència del pèptid 12 està altament conservada entre les soques de SARS-CoV-2 (figura 4) i resideix a S1 prop de l'extrem N-terminal de RBD i, per tant, denota una regió que pot ser rellevant per a la transició de la pre- a la conformació post-fusió de la proteïna S (figura 3B).
Figura 3. Nivells mitjans d'anticossos IgG (eixos y: ISU) a pèptids derivats de S (P12, P32, P46A) en subjectes naïfs i convalescents vacunats en els punts temporals 0 i 3 (eixos x) (A) . S'indiquen diferències significatives entre els grups determinats per la prova de Wilcoxon: * p < 0.05, ns=no significatiu. (F) (B) Figura 3. Nivells mitjans d'anticossos IgG (eixos y: ISU) a pèptids derivats de S (P12, P32, P46A) en subjectes naïfs i convalescents vacunats en els punts temporals 0 i 3 (x -eixos) (A). S'indiquen diferències significatives entre els grups determinats per la prova de Wilcoxon: * p < 0,05, ns=no significatiu. (B) Visualització dels pèptids 12, 32 i 46A a la representació superficial del trímer de proteïna espiga SARS-CoV-2 (vista lateral, conformació prèvia a la fusió) generada amb PyMOL. El pèptid 12 es destaca al model S-trímer en vermell, el pèptid 32 en blau i 46A en taronja. Els hidrats de carboni es mostren en gris clar.
Figura 4. Alineació de la seqüència de proteïnes de Wuhan-Hu-1 (a dalt) i Omicron (a sota) de la proteïna S del SARS-CoV-2. RBD està acolorit de groc clar i els pèptids 12, 22, 25, 32, 33, 46A i 47 estan subratllats. La seqüència de proteïnes S de Wuhan correspon a l'aïllat WA1 (núm. d'accés GeneBank: BCN86353.1), la seqüència de proteïnes S d'Omicron Omicron és el clade GRA, llinatge B.1.1.529 BA.1 basat en la base de dades GISAID ( https://www.gisaid.org/ (consultat el 15 de març de 2022)). Les substitucions d'aminoàcids estan codificades per colors segons les seves propietats d'hidropatia i càrrega (rosa=hidròfoba, verd=neutre, blau clar=bàsic hidròfil i vermell clar=àcid hidròfils).
3. Discussió
La vacuna basada en vectors Gam-COVID-Vac també anomenada Sputnik-V, va ser una de les primeres vacunes contra el SARS-CoV-2 que va estar disponible per utilitzar-la en la pràctica clínica. Tanmateix, hi ha relativament poca informació disponible sobre les especificitats fines de les respostes d'anticossos en subjectes que han estat vacunats amb COVID-19. En aquest estudi, hem realitzat una anàlisi detallada de les respostes d'anticossos cap a proteïnes i pèptids SARS-CoV-2 plegats i desplegats amb microarrays que abasten la proteïna S en mostres de plasma de subjectes naïfs i convalescents del SARS CoV-2- després un curs complet d'immunitzacions amb Gam COVID-Vac. Gam-COVID-Vac va induir principalment IgG1, però cap altra subclasse d'IgG, a S, S1, S2 i RBD plegats d'una manera comparable en subjectes naïfs i convalescents, cosa que indica que es pot utilitzar per augmentar el SARS-CoV-2- Respostes d'anticossos específiques també en subjectes convalescents. Igual que altres vacunes genètiques, la resposta d'anticossos induïda per Gam-COVID-Vac residia principalment a la subclasse IgG1 que té una semivida més curta en comparació amb una resposta de subclasse IgG4 que és més sostenible. Per exemple, les respostes específiques de la subclasse d'IgG4 s'associen amb una protecció a llarg termini durant la immunoteràpia específica d'al·lèrgens, mentre que les respostes específiques d'IgG1 s'acumulen ràpidament però s'esvaeixen al cap d'uns quants mesos [28–30]. En conseqüència, seran necessàries injeccions de reforç freqüents de Gam-COVID-Vac i altres vacunes genètiques per mantenir les respostes d'anticossos neutralitzants a un alt nivell. La vacunació amb Gam-COVID-Vac indueix una resposta d'anticossos que imita en gran mesura la que es troba després de la infecció natural amb SARS-CoV-2 [13]. A més, les respostes d'anticossos després de la infecció natural pertanyen principalment a la subclasse IgG1 i es dirigeixen contra S, S1, S2 i RBD plegats [13]. La troballa nova i interessant del nostre estudi va ser que el plasma de diversos subjectes vacunats amb Gam-COVID-Vac (per exemple, en els subjectes 6, 10, 12, 13, 16, 20; Taula 2) mostrava activitat neutralitzadora del virus, però no va inhibir la Interacció RBD-ACE2. Per tant, vam analitzar la reactivitat dels anticossos IgG als pèptids que abasten la proteïna S completa mitjançant l'anàlisi de xips basat en microarrays [13] (figures 2D i S4) i les respostes IgG específiques de pèptids correlacionades amb la neutralització del virus de Wuhan-Hu {{62} } soca i Omicron BA.1 (Figura 2D). Les respostes d'IgG a tres pèptids (és a dir, pèptids 12, 32, 46A), com ara les respostes d'IgG a RBD, es van correlacionar significativament amb la neutralització de la soca Wuhan-Hu-1 (figura 2C, D). Tanmateix, el pèptid 12 era únic perquè les respostes d'anticossos només al pèptid 12, però no als pèptids 32 i 46A es van augmentar significativament per la vacunació (figura 3A) i també es van correlacionar significativament amb la neutralització d'Omicron (figura 2D). La magnitud de l'augment de les respostes IgG induïda per la vacuna al pèptid 12 va ser modesta però significativa en subjectes naïfs i força comparable a l'augment dels anticossos IgG dirigits a S i S1. Tanmateix, els anticossos IgG contra el pèptid desplegat aïllat (figura S1) poden representar només una part dels anticossos dirigits contra el pèptid 12 a la proteïna plegada. A més, no només són importants els nivells sinó també l'avidesa dels anticossos. La seqüència de pèptids 12 està altament conservada entre la soca Wuhan-Hu-1 i BA.1 Omicron VOC (figura 4) i es deriva d'una regió que pot ser rellevant per a la transició de la pre a la post-fusió. conformació de la proteïna S (figura 3B). A més, la comparació de noves variants mutants d'Omicron (BA.1, BA.2, BA.4/5, BA.2.12.1, BA.2.75, BQ.1), mostra que el pèptid 12 (284–313 aa. ) es manté sense canvis pel que fa a la seqüència d'aminoàcids, en contrast amb, per exemple, el pèptid 32 (https://covariants.org/shared-mutations, (consultat el 28 de novembre de 2022)). En particular, s'han descrit anticossos monoclonals amb capacitat de neutralització de virus dirigits a la regió del domini N-terminal (NTD) de la qual el pèptid 12 forma part [31], i es va informar que també altres vacunes poden induir una resposta d'anticossos dirigida contra aquesta regió. [18–20,32], cosa que indica que la regió definida pel pèptid 12 pot ser important per induir anticossos neutralitzants. Per tant, es pot suposar que els anticossos induïts per la vacunació Gam-COVID-Vac poden neutralitzar el SARS-CoV-2 mitjançant dos mecanismes, un simplement inhibint la interacció RBD-ACE2 i un altre dirigint-se a la regió que conté el pèptid 12 de l'S- proteïna que pot estar implicada en canvis estructurals (és a dir, transició de la prefusió a la conformació de fusió de S). El nostre estudi té limitacions. Per exemple, hem utilitzat un assaig de neutralització basat en lentivirus pseudotipats, però aquests assajos s'utilitzen àmpliament i són fiables [33]. També és una limitació del nostre estudi que els pèptids de la nostra micromatriu es van desplegar i, per tant, poden haver identificat només una fracció d'anticossos neutralitzants que reconeixien els pèptids desplegats, mentre que una fracció encara més gran d'anticossos podria haver-se unit a epítops conformacionals en els identificats. regió. A més, és una limitació del nostre estudi que només hem analitzat un nombre reduït de subjectes. Tanmateix, el nostre estudi indica clarament que els anticossos amb diferent especificitat d'epítop poden contribuir a l'efecte protector de la vacunació Gam COVID-Vac. A més, l'estudi mostra una resposta a un pèptid potencialment conservat que es pot utilitzar per crear anticossos neutralitzants àmpliament.
Beneficis del suplement de cistanche: com enfortir el sistema immunitari
4. Materials i Mètodes
4.1. Estudiar la població i la declaració ètica
Els subjectes sans amb (n {{0}}) o sense (n=12) infeccions prèvies de SARS-CoV-2 es van inscriure a l'estudi el desembre de 2020 a l'Institut Nacional de Recerca de Immunologia de l'Agència Federal de Biologia Mèdica de Rússia (número d'ètica: #12-1, 29 de desembre de 2020). Tots els participants van donar el consentiment informat per escrit. La infecció anterior per SARS-CoV-2 es va confirmar per una prova PCR positiva anterior i símptomes de COVID{-19 o per la presència d'anticossos específics de SARS-CoV-2- dirigits a l'antigen de la nucleocàpsida i/o Antigen RBD i/o S tal com es descriu [13]. Tots els subjectes van ser immunitzats per via intramuscular amb dues dosis de Sputnik-V (Gam-COVID-Vac, Biocard, Moscou, Rússia) a un interval de tres setmanes. Les mostres de sang es van obtenir un dia abans de la primera vacunació (T0, figura 1A) i de 80 a 85 dies després de la primera vacunació (T3, figura 1A).
4.2. Detecció de respostes específiques d'anticossos del SARS-CoV-2-
Es va avaluar la resposta d'immunoglobulina de subjectes convalescents naïfs i COVID{{0}} en mostres de plasma abans i després de la immunització amb Sputnik-V (figura 1A). La IgG específica d'un panell complet de proteïnes SARS-CoV-2 i 46 pèptids (25-30 mers) que abasta la proteïna S es va mesurar en mostres de plasma diluïdes 1: 50 mitjançant la tecnologia de xips de microarrays com anteriorment. descrit [13]. Les seqüències d'aminoàcids, el nombre d'aminoàcids i el pes molecular de tots els pèptids sintètics del xip de microarrays es presenten a la taula 3. Per als pèptids 12 i 32 i RBD expressats en Escherichia coli (E. coli) (desplegat) i al ronyó embrionari humà 293 (HEK293) es proporcionen espectres de dicroisme circular (CD) de cèl·lules (plegades) (figura S1). Els pèptids 12 i 32 no van revelar cap estructura secundària específica determinada pel dicroisme circular (CD), tal com es mostra a la figura S1. En detall, es van activar làmines de vidre que contenien microarrays envoltats d'un marc epoxi (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Alemanya) amb un polímer orgànic complex reactiu amb amines, MCP-2 (Lucidant Polymers, Sunnyvale, CA , EUA) per tal de facilitar la unió de proteïnes i pèptids. Els antígens/pèptids SARS-CoV-2 es van detectar amb una concentració de 0,5-1 mg/ml en (75 mM de Na2HPO4, pH=8,4) per triplicat mitjançant un SciFlexArrayer S12 (Scienion AG, Berlín, Alemanya) [13]. L'expressió i la purificació de proteïnes i la síntesi de pèptids es descriuen a [13]. La reactivitat dels anticossos IgG als antígens de microarrays es va mesurar rentant primer els microarrays durant 5 min amb solució salina tamponada amb fosfat amb 0,5% de Tween 20 (PBST) i assecant-los per centrifugació amb una centrífuga Sigma 2–7 i MTP-11113 rotor (tots dos Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Alemanya). A continuació, es van afegir alíquotes de 35 µL de mostres de plasma diluïdes 1:50 (diluent de la mostra, Thermofisher, Waltham, MA, EUA) i es van incubar durant 2 h a 22 ◦ C. Després d'un altre pas de rentat, es van aplicar 30 µL d'anticossos secundaris (IgG anti-humà marcats DyLight 550 (Pierce, Rockford, IL, EUA) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA)) i es van incubar durant 30 min a 22 ◦ C RT. Els xips es van rentar, assecar i, posteriorment, escanejar amb un escàner làser confocal (Tecan, Männedorf, Suïssa). L'anàlisi d'imatges es va realitzar mitjançant el programari d'adquisició i anàlisi d'imatges de microarrays MAPIX (Innopsys, Carbonne, França) i es va realitzar la conversió d'unitats de fluorescència mesurades a unitats estandarditzades ISAC (ISU) tal com es descriu [13]. Els nivells d'anticossos específics s'expressen en unitats estandarditzades ISAC (ISU). Les respostes d'anticossos IgG1–4 específiques de S i RBD es van mesurar en mostres de plasma (diluïdes 1:50) per duplicat mitjançant ELISA tal com es va descriure anteriorment [13] amb una variació de<5% for their average values.
Taula 3. Pèptids sintètics derivats de proteïnes d'espiga SARS-CoV-2 §.
4.3. Espectres de dicroisme circular (CD) UV llunyà
Per als pèptids, P12 i P32, així com RBD expressats a E. coli i cèl·lules HEK293, es va realitzar una anàlisi de CD mitjançant un espectropolarimetre Jasco J-180 (Japan Spectroscopic Co., Tòquio, Japó) descrit anteriorment [34]. Els espectres CD de pèptids i proteïnes (figura S1) es van mesurar a una concentració de 0,1 mg/ml en 10 mM de NaH2PO4 (pH 8,0), que es va utilitzar per detectar els antígens.
4.4. Assaig de neutralització de virus basat en pseudovirus (PVT)
L'activitat de neutralització de virus en mostres de plasma es va determinar mitjançant un assaig de neutralització de virus basat en pseudovirus, tal com es va descriure anteriorment [35]. Per produir partícules semblants a virus de punta del SARS-CoV-2 (VLP), les cèl·lules HEK293T es van co-transfectar amb 3 plasmidis: plasmidi d'envasament lentiviral pCMV∆8.2R (Addgene, Teddington, Regne Unit), pUCHR-GFP i un El plasmidi pCAGGS-S∆19 que codifica la proteïna espiga SARS-CoV-2 de tipus salvatge (idèntica als aïllats de referència Wuhan-Hu{-1 i WA1) o el plasmidi pCAGGS-S∆19-Om que codifica la proteïna d'espiga Omicron del SARS-CoV-2 (regal amable d'Andrey Gorchakov, Laboratori d'Immunogenètica, Institut de Biologia Molecular i Cel·lular, Branca de Sibèria de l'Acadèmia Russa de Ciències, Novosibirsk, Rússia). Abans d'utilitzar-los en pVNT, els VLP es van valorar limitant la dilució i es van incubar durant 4 dies amb cèl·lules HEK293T transfectades amb hACE2-. Es va seleccionar una dosi de partícules virals que donava un 50% de cèl·lules positives per a la proteïna fluorescent verda (GFP) per utilitzar-la a la prova. Per a pVNT, totes les mostres de plasma es van inactivar per calor durant 30 min a 56 ◦ C abans de l'ús. El quart dia, es van tornar a suspendre les cèl·lules posteriors a la infecció i es va mesurar el percentatge de cèl·lules positives per GFP mitjançant citometria de flux. Els valors ID50 es van calcular mitjançant una corba sigmoïdal (programari GraphPad Prism 9.2.0, Sigmoidal, 4PL), reconstruïda pel percentatge de neutralització a les diferents concentracions plasmàtiques indicades.
4.5. Assaig d'interacció molecular (MIA)
Detectar la capacitat de les mostres de plasma de subjectes convalescents o naïfs de COVID{{{0}} (taula 1), abans i després de la immunització Sputnik-V, per inhibir la unió de 5{{0 ng/mL de RBD-hu-1 al receptor ACE2 es va realitzar un assaig d'interacció molecular (MIA) tal com es descriu [13,36–39]. Aquest assaig pot mesurar la inhibició de l'RBD marcat a l'ACE2 unit a la placa ELISA per anticossos o altres inhibicions de compostos de la interacció RBD-ACE2 [38]. En resum, es va recobrir ACE-2 recombinant (GenScript, Piscataway, NJ, EUA) durant la nit (2 µg/mL) sobre plaques NUNC Maxisorb de 96 pous (Thermofisher). A continuació, es van realitzar tres cicles de rentat amb tampó de rentat i després es van bloquejar les plaques durant 3 h a RT amb tampó de bloqueig. Les mostres de sèrum es van diluir 1:2 en PBS, 0, 05% Tween 20, 1% BSA i es van pre-incubar durant 2 h amb RBD recombinant etiquetat amb His de 50 ng (GenScript). A continuació, les mostres de sèrum pre-incubades es van afegir a les plaques que contenien ACE-2 durant 3 h i les plaques es van rentar i incubar durant la nit amb un anticòs monoclonal anti-His de ratolí diluït 1:1000 (Dianova, Hamburg, Alemanya) . Després de 3 passos de rentat, es va afegir un anticòs IgG1 anti-ratolí lligat a HRP 1:1000 diluït (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA) durant 2 hores i es va realitzar la detecció amb ABTS. Els valors mitjans de densitat òptica (OD) corresponents al RBD lligat es van mesurar a 405 nm i 492 nm (referència) en un lector TECAN Infinite F5 ELISA amb el programari integrat i-control 2.0 (Tecan Group Ltd., Männedorf, Suïssa). El control de la memòria intermèdia (superposició sense RBD) es va restar de cada resultat. Les determinacions es van realitzar per duplicat i els resultats es mostren com a valors mitjans amb una variació de<5%.
Beneficis del suplement de cistanche: com enfortir el sistema immunitari
4.6. Visualització de pèptids a l'estructura de la proteïna Spike
La representació superficial de la proteïna d'espiga del SARS-CoV-2 es va generar en PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, versió 2.5.0a0, Schrödinger, LLC, Nova York, NY, EUA) basat a l'entrada PDB 6XR8.
4.7. Anàlisi estadística
L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant GraphPad Prism (versió 9.2.0 GraphPad Software, La Jolla California). La prova de Wilcoxon (figures 1C, D i 3A), la prova de Mann-Whitney (figures 2B i S3) i la prova de Friedman (figura S2) es van utilitzar per a la comparació entre dos o diversos grups. p < 0.05 es va considerar estadísticament significatiu. La correlació entre els dos grups es va determinar mitjançant la prova de rang de Spearman (figura 2D). Es va realitzar una regressió no lineal normalitzada mitjançant el programari GraphPad Prism (Sigmoidal 4PL). Les dades es presenten com a mediana ± IQR. Els asteriscs indiquen diferències significatives entre grups, * p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ns—no significatiu.
5. Conclusions
En resum, el nostre estudi és el primer a estudiar en profunditat l'epítop i l'especificitat de la subclasse IgG dels anticossos induïts per Gam-COVID-Vac i a revelar diferents mecanismes de neutralització del virus induït per Gam-COVID-Vac per anticossos. En particular, vam obtenir proves que els anticossos dirigits a un pèptid (és a dir, el pèptid 12) situat a prop però fora de RBD a la part N-terminal de S1 estan associats amb la neutralització del virus. La potencial activitat neutralitzadora del virus dels anticossos específics del pèptid 12-podria ser deguda a la seva capacitat d'interferir amb la transició de la conformació pre- a la post-fusió de la proteïna espiga. Suggerim que es consideri la inclusió de la regió definida pel pèptid 12 en forma immunogènica a les vacunes per induir anticossos contra aquesta àrea d'epítop i per provar anticossos induïts per aquestes vacunes per a la neutralització del virus. En el cas que es pugui millorar la neutralització del virus de les vacunes, la inclusió d'un pèptid immunogènic 12 epítops pot millorar l'eficàcia de les vacunes COVID-19. A més, es pot considerar el desenvolupament d'anticossos contra l'epítop definit per a pèptids 12-per a la immunització passiva. Com que l'epítop 12-definit pel pèptid es conserva en les variants de SARS-CoV-2 conegudes actualment, les vacunes i els anticossos dirigits al pèptid 12 poden protegir de manera creuada contra les variants de SARS-CoV-2. Per tant, proporcionem coneixements nous que poden ser útils per al desenvolupament de noves estratègies de vacunació activa i passiva per a la COVID-19.
Referències
1. Rodríguez-Coira, J.; Sokolowska, M. Vacunes candidates SARS-CoV-2: composició, mecanismes d'acció i etapes de desenvolupament clínic. Al·lèrgia 2021, 76, 1922–1924. [CrossRef] [PubMed]
2. Sharma, A.; Ahmad, FI; Lal, SK COVID-19: una revisió sobre l'evolució, la transmissió, la detecció, el control i la prevenció de la nova malaltia del coronavirus. Virus 2021, 13, 202. [CrossRef] [PubMed]
3. Arshad, B.; Iqbal, T.; Bhatti, KP Review-Insights in Off-Label terapèutiques estratègies contra la infecció lleu i greu per COVID-19. Pak. J. Pharm. Ciència. 2021, 34, 1469–1484. [CrossRef] [PubMed]
4. Zaman, W.; Saqib, S.; Ullah, F. COVID-19: els enfocaments filogenètics poden ajudar a trobar recursos per a una cura natural. Phytother. Res. 2020, 34, 2783–2785. [Ref creuat]
5. Rubio-Casillas, A.; Redwan, EM; Uversky, VN SARS-CoV-2 Virulència intermitent com a resultat de la selecció natural. COVID 2022, 2, 1089–1101. [Ref creuat]
6. Logunov, DY; Dolzhikova, IV; Zubkova, OV Seguretat i immunogenicitat d'una vacuna heteròloga de primer impuls COVID-19 basada en vectors rAd26 i rAd5 en dues formulacions: dos estudis de fase 1/2 oberts i no aleatoris de Rússia. Lancet 2020, 396, 887–897, Correcció a Lancet 2021, 397, 98. [CrossRef]
7. Folegatti, PM; Ewer, KJ; Aley, PK Seguretat i immunogenicitat de la vacuna ChAdOx1 nCoV-19 contra SARS-CoV-2: informe preliminar d'un assaig controlat aleatoritzat, simple cec i de fase 1/2. Lancet 2020, 396, 467–478, Correcció a Lancet 2020, 396, 1884. [CrossRef]
8. Logunov, DY; Dolzhikova, IV; Shcheblyakov, DV Seguretat i eficàcia d'una vacuna heteròloga heteròloga d'impuls primer COVID-19 basada en vectors rAd26 i rAd5: anàlisi provisional d'un assaig de fase 3 controlat aleatoritzat a Rússia. Lancet 2021, 397, 671–681, Correcció a Lancet 2021, 397, 670. [CrossRef]
9. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mecanismes d'entrada del SARS-CoV-2 a les cèl·lules. Nat. mossèn Mol. Biol cel·lular. 2022, 23, 3–20. [Ref creuat]
10. Heinz, FX; Stiasny, K. Característiques distintives de les vacunes actuals contra la COVID-19: coneixements i desconeguts de la presentació de l'antigen i els modes d'acció. Vacunes NPJ 2021, 6, 104. [CrossRef]
11. Lim, HX; Masomian, M.; Khalid, K.; Kumar, AU; MacAry, PA; Poh, CL Identificació d'epítops de cèl·lules B per obtenir anticossos neutralitzants contra la proteïna Spike SARS-CoV-2 mitjançant la bioinformàtica i l'orientació d'anticossos monoclonals. Int. J. Mol. Ciència. 2022, 23, 4341. [CrossRef]
12. Moroy, G.; Tuffery, P. Estratègies basades en pèptids contra l'atac del SARS-CoV-2: una perspectiva actualitzada in silico. Davant. Droga. Discov. 2022, 2, 899477. [CrossRef]
13. Gattinger, P.; Niespodziana, K.; Stiasny, K. La neutralització del SARS-CoV-2 requereix anticossos contra els epítops del domini d'unió del receptor conformacional. Al·lèrgia 2022, 77, 230–242. [Ref creuat]
14. Niu, L.; Wittrock, KN; Clabaugh, GC Un paisatge estructural d'anticossos neutralitzants contra el domini d'unió al receptor SARS-CoV-2. Davant. Immunol. 2021, 12, 647934. [CrossRef]
15. Shan, S.; Mok, CK; Zhang, S. Un anticòs neutralitzant humà potent i protector contra les variants del SARS-CoV-2. Davant. Immunol. 2021, 12, 766821. [CrossRef]
16. Bajpai, P.; Singh, V.; Chandele, A. Els anticossos àmpliament neutralitzants contra el SARS-CoV-2 proporcionen noves idees sobre la neutralització de variants i altres coronavirus humans. Davant. Cèl·lula. Infectar. Microbiol. 2022, 12, 928279. [CrossRef]
17. Vishwakarma, P.; Yadav, N.; Rizvi, ZA Síndrome respiratori agut greu Coronavirus 2 Els epítops nous basats en proteïnes indueixen potents respostes immunitàries in vivo i inhibeixen la replicació viral in vitro. Davant. Immunol. 2021, 12, 613045. [CrossRef]
18. Garrett, ME; Galloway, JG; Wolf, C. La caracterització exhaustiva de les respostes d'anticossos a la proteïna Spike del SARS-CoV-2 troba epítops addicionals induïts per la vacuna més enllà dels de la infecció lleu. eLife 2022, 11, e73490. [Ref creuat]
19. Peng, M.; Dou, X.; Zhang, X. Epítops antigènics protectors revelats per immunosignatures després de tres dosis de vacuna SARS-CoV-2 inactivada. Davant. Immunol. 2022, 13, 938378. [CrossRef]
20. Polvere, I.; Parrella, A.; Zerillo, L. Diversitat de resposta immune humoral a diferents vacunes COVID-19: implicacions per a la política del "Pass verd". Davant. Immunol. 2022, 13, 833085. [CrossRef]
21. Tukhvatulin, AI; Dolzhikova, IV; Shcheblyakov, DV Un assaig de fase 1/2 obert, no aleatoritzat, sobre la seguretat, la tolerabilitat i la immunogenicitat de la vacuna d'una sola dosi "Sputnik Light" per a la prevenció de la infecció per coronavirus en adults sans. Lancet Reg. Salut Eur. 2021, 11, 100241. [CrossRef] [PubMed]
22. González, S.; Olszevicki, S.; Salazar, M. Efectivitat del primer component de Gam-COVID-Vac (Sputnik V) sobre la reducció de les infeccions confirmades per SARS-CoV-2, hospitalitzacions i mortalitat en pacients de 60 a 79 anys: un estudi de cohort retrospectiu a l'Argentina. EClinicalMedicine 2021, 40, 101126. [CrossRef] [PubMed]
23. Gushchin, VA; Dolzhikova, IV; Shchetinin, AM Activitat neutralitzant de sèrums de persones vacunades amb Sputnik V contra variants preocupants (VOC: B.1.1.7, B.1.351, P.1, B.1.617.2, B.1.617.3) i SARS endèmic de Moscou -CoV-2 Variants. Vacunes 2021, 9, 779. [CrossRef] [PubMed]
24. Voko, Z.; Petó, Z.; Surjan, G. Efectivitat nacional de cinc vacunes SARS-CoV-2 a Hongria: l'estudi HUN-VE. Clin. Microbiol. Infectar. 2022, 28, 398–404. [CrossRef] [PubMed]
25. Jeewandara, C.; Fernando, S.; Pushpakumara, PD Respostes immunitàries després de la primera dosi de l'Sputnik V (Gam-COVID-Vac). Ciència. Rep. 2022, 12, 1727. [CrossRef]
26. Ikegame, S.; Siddiquey, MNA; Hung, CT Activitat neutralitzant dels sèrums de la vacuna Sputnik V contra variants del SARS-CoV-2. Nat. Commun. 2021, 12, 4598. [CrossRef]
27. Gushchin, VA; Tsyganova, EV; Ogarkova, DA Sputnik V protecció contra la COVID-19 en persones que viuen amb el VIH sota teràpia antiretroviral. EClinicalMedicine 2022, 46, 101360. [CrossRef]
28. Shamji, MH; Valenta, R.; Jardetzky, T. El paper de les IgE, IgG i IgA específiques d'al·lèrgens en la malaltia al·lèrgica. Al·lèrgia 2021, 76, 3627–3641. [Ref creuat]
29. Eckl-Dorna, J.; Weber, M.; Stanek, V. Dos anys de tractament amb la vacuna recombinant d'al·lèrgia al pol·len d'herba BM32 indueix una resposta IgG4 específica de l'al·lèrgen en augment contínua. EBioMedicine 2019, 50, 421–432. [Ref creuat]
30. Shamji, MH; Kappen, JH; Akdis, M. Biomarcadors per al seguiment de l'eficàcia clínica de la immunoteràpia amb al·lèrgens per a la rinoconjuntivitis al·lèrgica i l'asma al·lèrgica: un document de posició EAACI. Al·lèrgia 2017, 72, 1156–1173. [Ref creuat]
31. Tortorici, MA; Beltramello, M.; Lempp, FA Els anticossos humans ultrapotents protegeixen contra el desafiament SARS-CoV-2 mitjançant múltiples mecanismes. Science 2020, 370, 950–957. [Ref creuat]
32. Cia, G.; Pucci, F.; Rooman, M. Anàlisi de l'activitat neutralitzadora d'anticossos dirigits a conformacions de proteïnes d'espiga SARS-CoV-2 obertes o tancades. Int. J. Mol. Ciència. 2022, 23, 2078. [CrossRef]
33. Meng, B.; Datir, R.; Choi, J. El domini N-terminal d'espiga del SARS-CoV-2 modula l'entrada viral i la fusogenicitat depenent de TMPRSS2-. Cell Rep. 2022, 40, 111220. [CrossRef]
34. Resch, Y.; Weghofer, M.; Seiberler, S. Caracterització molecular de Der p 10: Un marcador de diagnòstic per a una àmplia sensibilització en l'al·lèrgia als àcars de la pols. Clin. Exp. Al·lèrgia 2011, 41, 1468–1477. [Ref creuat]
35. Byazrova, M.; Yusubalieva, G.; Spiridonova, A. Patró de secreció d'anticossos específics del SARS-CoV-2-circulant i generació de cèl·lules B de memòria en pacients amb COVID-19 agut. Clin. Trad. Immunol. 2021, 10, e1245. [Ref creuat]
36. Gattinger, P.; Borochova, K.; Dorofeeva, Y. Els anticossos en sèrum de pacients convalescents després de COVID lleu-19 no sempre impedeixen la unió al receptor del virus. Al·lèrgia 2021, 76, 878–883. [Ref creuat]
37. Gattinger, P.; Tulaeva, I.; Borochova, K. Omicron: una variant del SARS-CoV-2 de veritable preocupació. Al·lèrgia 2022, 77, 1616–1620. [Ref creuat]
38. Gattinger, P.; Ohradanova-Repic, A.; Valenta, R. Importància, aplicacions i característiques dels assajos que mesuren anticossos neutralitzants del SARS-CoV-2. Int. J. Mol. Ciència. 2023, 24, 5352. [CrossRef]
39. Gattinger, P.; Kratzer, B.; Tulaeva, I.; Niespodziana, K.; Ohradanova-Repic, A.; Gebetsberger, L.; Borochova, K.; Garner-Spitzer, E.; Trapin, D.; Hofer, G.; et al. Una vacuna basada en la proteïna de fusió del domini d'unió al receptor plegat-PreS amb el potencial d'induir immunitat esterilitzant a les variants del SARS-CoV-2. Al·lèrgia 2022, 77, 2431–2445. [Ref creuat]