Efectes de DPTQ, un nou modulador al·lostèric positiu del receptor de dopamina D1, sobre la freqüència de parpelleig espontània dels ulls i la memòria de treball espacial a la part 1 del primat no humà

Resum

Justificació

La senyalització de dopamina (DA) a través del receptor D1 és integral de múltiples aspectes de la cognició, inclòs el procés bàsic de la memòria de treball. El descobriment de moduladors al·lostèrics positius (PAM) del receptor D1 ha permès modalitats de tractament que poden tenir beneficis alternatius als agonistes D1 ortosterics derivats d'una sinergia d'acció amb la senyalització funcional del receptor D1.

La dopamina és un neurotransmissor que té efectes importants sobre el funcionament del cervell. Té un paper important en la regulació de les emocions, l'alimentació, l'emoció, l'aprenentatge, la memòria i molts altres aspectes. Estudis recents han trobat una forta relació entre la dopamina i la memòria.

Els estudis han demostrat que la dopamina pot millorar la capacitat d'un individu per recordar situacions i esdeveniments. Això es deu al fet que la dopamina regula les interaccions entre les neurones del cervell, fent que la informació rellevant sigui més fàcil d'emmagatzemar i recuperar. Al mateix temps, la dopamina pot enfortir la connexió entre neurones, millorar l'eficiència de transmissió entre neurones i promoure encara més la formació i el manteniment de la memòria.

A la vida real, podem augmentar la secreció de dopamina de diverses maneres per millorar la nostra memòria. Per exemple, fer exercici pot afavorir la secreció de dopamina, de manera que l'exercici físic regular és una manera eficaç de millorar la memòria. A més, alguns aliments com les mongetes, els fruits secs, el pa integral, etc. també poden augmentar la secreció de dopamina i ajudar-nos a millorar la memòria.

En l'estudi i el treball diari, també podem millorar la memòria estimulant el sistema de dopamina del cervell. Per exemple, podem activar el sistema de dopamina fixant-nos objectius, recompensant-nos i aportant feedback periòdic, millorant així la nostra memòria i la comprensió del coneixement que hem après. A més, una actitud positiva i un bon humor també poden afavorir la secreció de dopamina i millorar la memòria.

En resum, hi ha una estreta relació entre la dopamina i la memòria. Mitjançant mètodes científics i una actitud correcta, podem promoure la secreció de dopamina, millorar la nostra memòria i afrontar millor els reptes en l'estudi i el treball. Es pot veure que hem de millorar la memòria, i Cistanche deserticola pot millorar significativament la memòria, perquè Cistanche deserticola també pot regular l'equilibri dels neurotransmissors, com augmentar els nivells d'acetilcolina i factors de creixement. Aquestes substàncies són molt importants per a la memòria i l'aprenentatge. A més, la carn també pot millorar el flux sanguini i promoure el lliurament d'oxigen, cosa que pot garantir que el cervell rebi suficients nutrients i energia, millorant així la vitalitat i la resistència del cervell.

Feu clic a conèixer maneres de millorar la funció cerebral

Objectius

Per investigar aquest potencial, hem estudiat els efectes de la nova D1 PAM DPTQ en una tasca de memòria de treball de resposta retardada espacial en el mico rhesus. Els estudis inicials van indicar que el DPTQ s'uneix al primat D1R amb una gran afinitat i selectivitat i augmenta la taxa de parpelleig espontània dels micos rhesus d'una manera dependent de la dosi d'acord amb les exposicions de lligands plasmàtics i l'activació central de D1.

Resultats

A partir d'aquests resultats, es va provar DPTQ a 2,5 mg/kg IM a la tasca de memòria de treball. No es va observar cap efecte agut 1 h després de la dosificació, però el rendiment es va deteriorar 48 h després. Sorprenentment, aquest defecte va ser seguit immediatament per una millora significativa de la cognició durant els 3 dies següents.

En un segon experiment en què es va administrar DPTQ els dies 1 i 5, el deteriorament precoç va ser més petit i no va assolir significació estadística, però es va observar una millora estadísticament significativa del rendiment durant la setmana següent. Les dosis més baixes de 0,1 i 1,0 mg/kg també van ser capaços de produir aquesta millora prolongada sense induir cap deteriorament transitori.

Conclusions

DPTQ exemplifica una classe de D1PAM que poden ser capaços de proporcionar millores a llarg termini a la memòria de treball.

Paraules clau

Modulador al·lostèric positiu · Dopamina · D1 · Parpelleig d'ulls · Memòria de treball · Resposta espacial retardada · AMP cíclic · Plasticitat.

Introducció
La dopamina (DA) està implicada de manera crítica en molts aspectes de la funció cerebral, incloent l'activitat motora, la vigília i la cognició. El receptor D1, en particular, és crucial per mantenir les funcions cognitives d'alt ordre en el primat, com ara l'atenció, la funció executiva i la memòria de treball, i aquest receptor és abundant a l'escorça prefrontal dels primats on la seva senyalització és integral al procés cognitiu bàsic de treball. memòria (Sawguchi i GoldmanRakic ​​1991; Goldman-Rakic ​​et al. 2004).

La memòria de treball és un indicador clau del resultat en pacients amb esquizofrènia i la seva funció es redueix en l'envelliment i els trastorns neurodegeneratius (Bodnar et al. 2008; Rhode i Katz 2017; Zokaei i Husain 2019). Aquestes són àrees d'alta necessitat mèdica no coberta. En particular, se sap que l'esgotament de la transmissió de dopamina (inclosa la senyalització del receptor D1) en l'envelliment contribueix al declivi cognitiu relacionat amb l'edat (Roth i Joseph 1994; Volkow et al. 1998; Karrer et al. 2017).

En conseqüència, la funció del receptor D1 ha estat objecte d'un ampli estudi a nivell conductual, cel·lular i molecular (Muly et al. 1998; Castner et al. 2000; Goldman-Rakic ​​et al. 2000; Dunah i Standaert 2001; Castner i Williams). 2007; Liu et al. 2017).

El desenvolupament d'agonistes D1 per millorar la cognició ha presentat un repte difícil a causa de la resposta de dosi en forma d'U invertida (Williams i Goldman-Rakic ​​1995; Vijayraghavan et al. 2007). A més, l'estimulació prolongada de D1 per agonistes d'alta afinitat/acció llarga pot conduir al desenvolupament de la tolerància (Asin i Wirtshafter 1993; Lewis et al. 1998; Gulwadi et al. 2001; Smith et al. 2002, Ryman-Rasmussen et al. 2007; ).

Per tant, els estudis clínics amb agonistes D1 complets han tingut un èxit limitat (Blanchet et al. 1996; Giardina i Williams 2001; Zang et al. 2009). S'han introduït enfocaments més recents per a l'activació de D1, inclosos els agonistes parcials de la dopamina D1 (Roberts et al. 2010; Balice-Gordon et al. 2020; Kozak et al. 2020; Riesenberg et al. 2020).

Un enfocament alternatiu seria desenvolupar un modulador al·lostèric positiu (PAM) per al receptor D1, basat en la hipòtesi que l'activitat d'un PAM dependria del to dopaminèrgic endogen, potenciant la dopamina quan i on s'allibera. Això oferiria un enfocament més fisiològic que podria proporcionar un millor marge terapèutic, possiblement evitant el desenvolupament de dosi-resposta i tolerància en forma d'U invertida vist amb alguns agonistes D1. Recentment, s'han informat i caracteritzat diversos D1PAM selectius de la classe estructural de la tetrahidroisoquinolina i es va establir la diferenciació farmacològica dels agonistes D1 en una sèrie d'estudis in vitro i in vivo (Svensson et al. 2017; Bruns et al. 2018; Hao et al. 2019; Meltzer et al. 2019 i Svensson et al. 2019).

A causa d'una diferència d'espècie en la unió de D1 per als D1PAM, aquests estudis neuroquímics i de comportament es van realitzar en un ratolí transgènic en què el receptor D1 murií es va substituir pel seu equivalent humà (ratolí hD1). En general, les dades van donar suport a un potencial procognitiu per a aquest enfocament (Bruns et al. 2018 i Meltzer et al. 2019). Per al present estudi, hem seleccionat el D1PAM DPTQ (Hao et al. 2019), un anàleg estructural proper de l'eina farmacològica prèviament informada DETQ i el candidat clínic LY3154207 (medallat; Hao et al. 2019; Wilbraham et al. 2021, Biglan). et al 2022 i McCarthy et al 2022).

DPTQ té un EC50 de 76 nM per potenciar l'augment de cAMP induït per la dopamina en cèl·lules clonades D1 humanes transfectades de manera estable i posseeix propietats fisicoquímiques adequades amb una penetració cerebral acceptable després de la dosificació sistèmica (Hao et al. 2019).

Els nostres principals objectius amb aquest estudi van ser establir l'activitat farmacodinàmica central i explorar l'eficàcia potencial sobre la cognició amb un D1PAM en una espècie superior, el mico rhesus. S'ha demostrat anteriorment que els membres de la sèrie D1PAM de tetrahidroisoquinolina tenen una gran afinitat per aquesta espècie, similar als humans (Svensson et al. 2017, Wang et al. 2018 Hao et al. 2019).

Per a les proves farmacodinàmiques inicials, vam seleccionar el model de velocitat de parpelleig espontani dels ulls en el mico rhesus per establir les dosis necessàries per aconseguir una resposta D1 central per a DPTQ en una espècie superior. Se sap que els agonistes D1 augmenten la taxa de parpelleig dels ulls en aquest model (Elsworth et al. 1991; Jutkiewicz i Bergman 2004). A més, els pacients amb malaltia de Parkinson tenen una taxa de parpelleig espontània reduïda (Deuschl i Goddemeier 1998; Karson et al 1982).

Tot i que hi ha molts sistemes de neurotransmissors interactius implicats en la freqüència de parpelleig espontània dels ulls, aquest model es pot utilitzar com a marcador per a l'activació del receptor central de dopamina D1 (Jutkiewicz i Bergman 2004) i també podria reflectir efectes sobre la cognició (Taylor et al. 1999; Jongkees i Colzato 2016). Un estudi anterior amb DETQ va mostrar una taxa de parpelleig espontània millorada, encara que amb una resposta més petita que la que es va observar amb l'agonista D1 SKF82958 (Bruns et al., 2018).

Per a les proves cognitives en el mico rhesus, vam seleccionar la tasca de resposta retardada espacial (Roberts et al., 2010), una mesura translacional molt establerta de la memòria de treball espacial que s'ha demostrat que implica els mateixos circuits neuronals en primats humans i no humans (Jonides). et al., 1993; GoldmanRakic, 1996; McCarthy et al., 1996; Postle et al., 2000).

Mètodes

Prova in vitro en l'assaig d'AMPc

El receptor D1 humà, mico rhesus, gos o ratolí es va clonar al sistema vectorial Jump-In (Life Technologies Corp, CA) i es va transfectar de manera transitòria a les cèl·lules HEK293. Els augments de cAMP per DPTQ (base lliure, Eli Lilly) es van mesurar en presència d'una concentració EC20 de dopamina. Els valors EC50 per a cada espècie juntament amb el % d'estimulació màxima (on l'estimulació màxima de dopamina és igual al 100%) es presenten a la taula 1. Aquests estudis in vitro es van realitzar a Eli Lilly and Company, Indianapolis, als EUA. Per obtenir més detalls sobre la mesura dels efectes sobre l'acumulació d'AMPc en aquestes cèl·lules transfectades de manera transitòria, vegeu Hao et al. (2019).

Freqüència de parpelleig espontània en el mico rhesus

Els animals

A l'estudi es van incloure onze micos rhesus mascles de 5-6-anys (Chengdu Ping, base d'investigació i cria d'animals, província de Sichuan, Xina) amb un pes mitjà de 4,83 kg. Els animals es van dividir aleatòriament en tres grups, el grup de dosi acumulada més alta de DPTQ (n =4); Grup de dosi acumulada més baixa de DPTQ (n=3); i vehicle (20% Captisol (CyDex Pharmaceuticals, Inc., KS) al grup tampó NaPO4) (n=4).

L'agonista D1 SKF82958 es va incloure com a control positiu; els resultats d'aquest compost (no es mostren aquí) es van publicar recentment juntament amb dades d'un D1PAM diferent (DETQ, vegeu Bruns et al. 2018). El bromhidrat d'antagonista selectiu D1 SCH39166 (núm. cat: 2299, lot núm.: 3A/129719) es va comprar a Tocris, MN, i es va preparar en aigua pura Millipore amb un volum d'injecció de 0,2 ml/kg. L'antagonista D1 es va dosificar 15 minuts abans del vehicle o DPTQ (n =4 animals per grup).

Els micos van ser allotjats individualment en un vivari amb clima controlat (22-24 graus) i humitat (40-70%). Hi havia un cicle de 12 h llum/12 h fosc (llum encès de 7 a.m. a 7 p.m.). Els micos tenien accés il·limitat a l'aigua i rebien una quantitat diària de menjar de mico ric en proteïnes, complementat amb fruita cada dia. Abans de l'administració de compostos i durant les hores de prova, els micos no s'alimentaven amb fruites ni aliments.

L'estudi Spontaneous Eye Blink Rate es va realitzar a ChemPartner, Xangai, Xina. L'allotjament dels micos a la instal·lació d'animals grans de Shanghai ChemPartner està totalment acreditat per AAALAC. Els animals es van allotjar socialment en parelles en 2 gàbies interconnectades, permetent la comunicació visual i verbal amb els micos veïns, així com l'autovisió des d'un mirall penjat a cada gàbia. La dimensió de la gàbia per a cada mico era de 0,9 (L) × 0,9 (W) × 2 (H) m, amb una carbassa, una bola d'alimentació o una bola de mastegar a l'interior.

El programa d'enriquiment incloïa programes de televisió 2-3 vegades per setmana i música de fons durant diverses hores cada dos dies. L'estat de salut dels animals va ser verificat periòdicament pel veterinari assistent i diàriament pel personal d'atenció als animals per a la seva (1) aparença, pèl i cua; (2) femta i micció; i (3) comportament brut, consum d'aliments i signes de malaltia. Tots els protocols de formació i proves van ser aprovats pel comitè de polítiques i directrius de l'IACUC de benestar animal institucional de ChemPartner (Xangai, Xina).

Aparell i protocol experimental

La taxa de parpelleig espontània dels ulls es va mesurar durant experiments d'observació realitzats en una cadira de mico especialment construïda (Mason et al. 2019). Es va utilitzar una placa de coll en forma d'U que va ajudar a fixar l'orientació del cap per facilitar l'observació de la resposta de la freqüència de parpelleig dels ulls. Una càmera de vídeo compacta (Panasonic/wv-cp480/CH) en un trípode es va col·locar davant del mico assegut. Dues imatges de càmera es van combinar amb un col·lector de vídeo (sistema Color QUAD) i es van transferir al programari EthoVision (Noldus, Leesburg, VA) a l'ordinador per a la visualització i la gravació en línia.

Dues setmanes abans de la prova, els micos van ser entrenats diàriament perquè s'asseuen a la cadira de micos durant períodes de dues 2-hores amb una recompensa alimentària. Durant les sessions de proves posteriors a l'entrenament realitzades entre les 9:00 del matí i les 4:30 de la tarda cada dia, es va estudiar cada mico durant nou components de 15-minuts consecutius. Cada bloc de 15-minuts constava d'un període d'habituació de 10-minuts seguit d'un període de 5-minuts durant el qual es comptava el parpelleig dels ulls.

The video was displayed on a computer screen to allow continual observation of the subject. Observers blind to the treatment conditions later scored each 5-minute videotaped session. An eye blink was defined as a visible, rapid opening and closing of the eyelid. Two observers independently confirmed the measurement with reliability>90%.

Proves farmacològiques

Els efectes de diferents lligands D1 sobre la velocitat de parpelleig espontània dels ulls es van estudiar mitjançant un procediment de dosificació acumulada (Jutikiewicz i Bergman 2004). Es va administrar un compost actiu o vehicle (Captisol 20% p/v tampó NaPO4) després d'obtenir dos enregistraments de parpelleig d'ulls de referència. El lligand es va donar en ordre aleatori a diferents micos de cada grup tal com es descriu anteriorment. Per estudiar la dosi-resposta i el curs temporal, es van administrar dosis incrementals de DPTQ al final dels components de 15-minuts de cada sessió de prova.

Productes químics

DPTQ (base lliure, vegeu Hao et al. 2019) va ser subministrat per Eli Lilly Company. Captisol (núm. de lot: NC04A{-05034) es va preparar de la següent manera: Captisol 20% p/v tampó NaPO4 25 mM, pH 8. El volum d'injecció de DPTQ va ser de 0,5 ml/kg IM. DPTQ a 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg i 1 mg/kg es van dosificar com a solució clara, mentre que les dosis de 5 mg/kg i 10 mg/kg es van formular com a suspensions fines.

La solució del vehicle anterior es va emmagatzemar a 4 graus en una nevera i es va restaurar a temperatura ambient abans d'utilitzar-la. Quan es preparava DPTQ fresc diàriament, es va afegir una porció del vehicle (20% de Captisol) al compost i es va agitar per mullar-lo, seguit de l'addició de la resta del vehicle i es va barrejar fins que la solució es va fer homogènia. A continuació, la suspensió es va sonicar en un bany de gel durant 40 minuts per reduir la mida de les partícules. Els animals es van dosificar mentre estaven a la cadira.

Anàlisi de dades per a la taxa de parpelleig dels ulls

Els resultats de cada mico es van expressar com la velocitat de parpelleig dels ulls (parpelleig per minut) mitjana durant cada època de prova de 5-minut. Els efectes del vehicle i el D1 PAM sobre el parpelleig dels ulls es van promediar per a cada grup de micos i es van expressar com a mitjana ± SE. Els efectes de DPTQ i vehicle es van analitzar amb ANOVA bidireccional (D1 PAM i temps) seguit de la prova post hoc Bonferroni (GraphPad Prism, San Diego CA).

Tasca de memòria de treball espacial

Els animals

Setze rhesus i un macac de cua van participar en l'estudi (detalls que es proporcionen a continuació) que es va realitzar a la Universitat de Yale, New Haven CT, EUA. Els animals es van utilitzar i es van cuidar d'acord amb les directrius i polítiques IACUC de la Universitat de Yale, a més de totes les polítiques i regulacions federals dels EUA. Els micos van ser alimentats amb la seva dieta normal cada dia, incloses galetes nutritives adequadament i múltiples fruites i verdures per enriquir-los. Les proves i qualsevol formació es van produir just abans del seu plat principal.
Aquest menjar consistia en galetes que s'entregaven cada dia, i tots els animals tenien accés total a l'aigua ad libitum durant 24-hores. La participació en les proves cognitives es va garantir mitjançant l'enriquiment de l'estimulació ambiental i el subministrament dels aliments preferits dels animals com a recompenses en la tasca, incloent iogurt, panses, ametlles, raïm, bucles de fruites i molts altres aliments (Roberts et al. 2010).

Prova cognitiva

La resposta retardada espacial és una mesura translacional establerta de la memòria de treball espacial que s'ha demostrat que implica els mateixos circuits neuronals en primats humans i no humans (McCarthy et al. 1996). El circuit implicat en aquesta resposta és gairebé exclusivament el "corrent dorsal" que implica l'escorça prefrontal dorsolateral, particularment l'àrea 46, i el solc intraparietal lateral (GoldmanRakic ​​1996). Per obtenir una descripció completa de la tasca utilitzada aquí, vegeu Roberts et al. (2010). Els animals es van provar en una habitació atenuada acústicament que incorporava una cambra de proves. En aquesta tasca, una de les diverses ubicacions dels pous s'esquer amb menjar donat a l'animal i després es cobreixen els pous amb plaques idèntiques.

A continuació, es baixa una persiana opaca durant un dels 5 retards variables i després s'aixeca per permetre que l'animal faci una resposta a una de les ubicacions del pou per recuperar el menjar. Cada llargada de retard es va repetir 4 vegades en una distribució semialeatoria en els 20 assaigs de cada sessió de prova. Cada animal es va estabilitzar abans de començar qualsevol administració augmentant gradualment el nombre de pous (a partir de només 2) i la durada del retard. Les 5 longituds de retard variables es van establir en 0, 1, 2, 3 i 4 s multiplicat per un factor "N". Així, N es va incrementar en 1 fins a un màxim de 10 fins que el subjecte va realitzar un 80% o més en 3 sessions de prova consecutives, després de les quals el nombre de pous es va incrementar en 1.

Aquest procés es va repetir per a cada individu fins a aconseguir un rendiment estable (65-75% ± Menys o igual al 2,5% correcte). Aquest nivell normalitzat de rendiment permet la detecció sensible de qualsevol deteriorament o millora produïda per les condicions experimentals. Per a les dades de referència d'aquest estudi, vam prendre 7 o més punts de dades consecutius que s'havien recollit en setmanes anteriors que es trobaven dins dels límits estables de la prova. Per al grup total de 17 animals que van participar en aquest estudi, el nombre de pous mitjà va ser de 4 (rang 2-7) i el valor mitjà de N va ser de 3 (rang 1-7). Els animals es van provar normalment de 2 a 3 dies a la setmana.

Administració composta

DPTQ (base lliure, Eli Lilly & Co.) es va preparar tal com es descriu anteriorment per a la prova de parpelleig espontània. Els animals (4 mascles i 6 femelles, edat mitjana =22,1 ± 1,7 anys) es van assignar originalment per rebre vehicle o DPTQ 2,5 mg/kg IM en un disseny semi-aleatori. Un animal va rebre un vehicle però no va rebre la dosi de DPTQ. Aquest mateix grup d'animals es va utilitzar posteriorment en un estudi de dosis repetides amb DPTQ 2,5 mg/kg vs. vehicle. Després d'un període de rentat prolongat de diversos mesos, vam provar les dosis més baixes de 0,1 mg/kg i 1,0 mg/kg en ordre ascendent.

Aquest grup de 10 animals n'incloïa 3 de l'estudi anterior (3 mascles i 7 femelles (incloent un macac de cua de soca d'edat); edat mitjana =22,6±1,7 anys). L'animal més jove d'aquest estudi tenia 17,3 anys. Cap dels animals era ingenu i tots havien estat utilitzats en estudis anteriors amb altres compostos. Se'ls va donar un extens rentat de setmanes o mesos abans d'aquest estudi i es va establir per tenir un rendiment de referència normal en la tasca.

Durant l'estudi, els animals es van rentar en funció de les propietats PK conegudes (vida mitjana) d'aquest fàrmac, així com del rendiment inicial de cada animal. És a dir, calia que el rendiment tornés a la línia de base abans de començar qualsevol altra condició i normalment s'utilitzava un període de rentat d'almenys dues setmanes. Les proves cognitives es van dur a terme 1 h després de la injecció per coincidir amb el temps d'efecte màxim observat a l'estudi original de parpelleig d'ulls.

Anàlisi de dades cognitives

L'efecte de l'administració del vehicle i de cada dosi de DPTQ es va analitzar mitjançant una 1-anàlisi de la variància (ANOVA) seguida de comparacions post hoc basades en la taxa de descobriment fals (FDR), mitjançant el pas en dues etapes. mètode up de Benjamini et al. (2006; GraphPad Prism 9.1). Aquesta metodologia es va escollir tenint en compte l'elevat nombre de grups (dies) i el limitat nombre de proves (animals).

Es va utilitzar un nivell de 0,05 per determinar la significació estadística. Després de les proves inicials per assegurar-se que no hi ha efectes significatius del vehicle (vegeu "Resultats" a continuació), es van realitzar comparacions amb la línia de base (promig durant diverses sessions) com a control.

Anàlisi de l'exposició de lligands plasmàtics

Les mostres de plasma es van recollir en tubs d'EDTA a {{0}}, 0.25, 0.50, 1, 2, 4, 8, 12 i 24 h després d'un bolus Injecció IM i emmagatzemat a -70C fins a una anàlisi posterior per LC/MS (per a més detalls, vegeu Hao et al. 2019). Per a la dosi més baixa de 0, 1 mg / kg, IM, es van recollir mostres de plasma de tres dels animals que participaven en la tasca de memòria de treball espacial a la Universitat de Yale, aproximadament 1, 5 h després de la dosificació (~ 30 min després de completar la sessió de prova de comportament).

Els animals es van aclimatar a seure lliurement en una cadira personalitzada i tenir una cama subjectada per tallar el cabell (si calia), netejar-se amb alcohol al 70% i punció venosa safena amb un tub BD Vacutainer dins d'un suport de seguretat. Per a la dosi IM de 5 mg/kg, es van recollir mostres de plasma en un estudi separat en tres micos macacs adults mascles a Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN. La recollida i l'emmagatzematge de mostres van seguir el procediment descrit anteriorment, i l'anàlisi dels nivells de lligand D1 es va dur a terme a Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, EUA, mitjançant cromatografia líquida i espectrometria de masses en tàndem.

Resultats

Efectes de DPTQ sobre l'acumulació d'AMPc en quatre espècies

El DPTQ es va provar en cèl·lules HEK293 que expressaven de manera transitòria receptors D1 de dopamina humana, gos, mico rhesus i ratolí. Els valors del potenciador EC50 i Emax per als receptors D1 del gos i del mico rhesus eren similars als del receptor D1 humà (taula 1). Tanmateix, el potenciador EC50 per al receptor D1 del ratolí es va desplaçar cap a la dreta uns 14- a 23- vegades en comparació amb el mico rhesus i l'ésser humà, respectivament. A més, l'Emax del receptor D1 del ratolí era només del 41%, en comparació amb el 77-88% de les altres tres espècies.

Freqüència de parpelleig espontània dels ulls

Les taxes de parpelleig oculars inicials mitjanes abans de la dosificació no van superar 10 parpelleig/min, i les taxes de parpelleig oculars van ser relativament estables en les sessions de prova en subjectes individuals després de la injecció del vehicle. DPTQ es va provar en dos règims de dosis acumulades (Fig. 1). La dosi acumulada més alta de DPTQ (0,5 mg/kg, 5 mg/kg i 10 mg/kg, IM) va donar lloc a les taxes més altes de parpelleig d'ulls. L'efecte de transcurs del temps després d'aquestes dosis més altes va mostrar que es van produir augments significatius de la freqüència de parpelleig dels ulls post-DPTQ als 30 min (p<0.01), 45 min (p<0.001), 60 min (p<0.01), and 75 min (p<0.05) (Fig. 1). The lower cumulative dose of DPTQ (0.1 mg/ kg, 1 mg/kg and 5 mg/kg, resulted in small but significant (p < 0.05) increases in rates of eye blinking only at the 45-min and 60-min time points (Fig. 1). During recording and observation, some vehicle group monkeys fell asleep or became drowsy in the monkey chair as time went by. In contrast, all of the DPTQ-treated monkeys remained alert throughout the test period of close to 2.5 hours.

Tant les dosis acumulades altes com les més baixes de DPTQ van donar lloc a un cert grau de moviment oral, com ara la protrusió de la llengua (dades no mostrades). Tanmateix, només la dosi acumulada més alta va mostrar un efecte clar als 30 min després de l'administració de DPTQ en comparació amb el grup de vehicles. Això és coherent amb una activació del moviment de la llengua després de l'estimulació del receptor D1 reportada en micos (Bédard i Boucher 1989).

L'administració de l'antagonista selectiu D1 SCH39166 (0,03 mg/kg, IM) sol va induir una breu reducció de la freqüència de parpelleig dels ulls i les observacions visuals van indicar que els animals estaven lleugerament sedats. Aquest efecte va durar uns 15 min (Fig. 2). Els animals pretractats amb SCH39166 només van mostrar un petit i no significatiu (pàg<0.05) increase in eye blink rate induced by higher accumulated doses (0.5, 5, 10 mg/kg) of DPTQ (Fig. 2; compare to Fig. 1).

Anàlisi dels nivells plasmàtics de DPTQ en el mico

En el primer estudi, es van recollir mostres de plasma en diversos moments de tres animals durant un màxim de 24 h després d'una dosi de 5 mg/kg IM (Fig. 7). Es van mesurar nivells plasmàtics totals elevats de DPTQ durant les 2 h inicials que van des d'uns 9000 a 1800 nM amb concentracions plasmàtiques no lligades estimades de 674 a 125 nM. A partir de les dades que el DPTQ té una proporció de concentració cerebral no lligada versus plasma no lligada d'aproximadament 0,3 i una fracció de lligand no lligat de 0,068 (J. Cramer, dades no publicades), les concentracions cerebrals no lligades projectades per a DPTQ després d'una injecció de 5 mg/kg oscil·larien entre 202 fins a 38 nM durant les primeres 2 hores posteriors a la dosi. Aquestes concentracions es troben dins de l'interval del valor de EC50 de hD1 per a DPTQ a l'assaig d'AMPc que es va informar que era de 76 nM (Hao et al. 2019) i a l'EC50 del mico D1 de 38 nM que es va informar aquí utilitzant cèl·lules expressades de manera transitòria (taula 1) o per sobre (taula 1) .

En el segon estudi, es van recollir mostres després de la dosi baixa de {{0}}, 1 mg/kg, IM de tres animals a ~ 1, 5 h després de la dosi a l'estudi de cognició. Com es mostra a la figura 3, la dosi baixa de 0,1 mg/kg IM va donar lloc a uns nivells plasmàtics de DPTQ 50 vegades més baixos. Les concentracions plasmàtiques totals de D1 PAM van oscil·lar entre 56 i 91 nM (Fig. 7). Utilitzant les mateixes hipòtesis anteriors per a la fracció de lligand no lligat i la proporció de cervell no lligat vs. plasma no lligat, les concentracions estimades de lligand no lligat al cervell serien d'1 a 2 nM a 1,5 h després de la dosi IM de 0,1 mg/kg. Aquests nivells estan molt per sota dels valors d'EC50 del mico i humà per a la potenciació de l'activació de cAMP induïda per la dopamina en l'assaig in vitro.

For more information:1950477648nn@gmail.com