L'òxid nítric exògen estimula la sortida primerenca dels esporozoïts d'Eimeria Tenella de les cèl·lules primàries de ronyó de pollastre in vitro

Per a més informació. contactetina.xiang@wecistanche.com

Resum-La sortida té un paper vital en el cicle de vida dels paràsits apicomplexans, inclosa Eimeria tenella, que ha estat cridant l'atenció de diversos grups de recerca. Molts estudis recents s'han centrat en la sortida primerenca induïda per molècules immunes per desenvolupar un nou mètode d'eliminació de paràsits apicomplexans. En aquest estudi, es va investigar si l'òxid nítric (NO), una molècula immune produïda per diferents tipus de cèl·lules en resposta a l'estimulació de citocines, podria induir una sortida primerenca d'esporozoïts americans in vitro. Els esporozoïts d'Eimeria tenella es van extreure i es van cultivar en cèl·lules primàries de ronyó de pollastre. El nombre d'esporozoïts sortits de cèl·lules infectades es va analitzar mitjançant citometria de flux després del tractament amb NO alliberat per nitroferricianur de sodi (II) dihidrat. Els resultats van mostrar que el NO exògen va estimular la ràpida sortida dels esporozoïts d'E.tenella de les cèl·lules primàries de ronyó de pollastre abans de la replicació del paràsit. També vam trobar que l'emissió depenia dels nivells d'ions de calci (Ca2) intraparàsits i que no es produïa cap dany a les cèl·lules hoste després de la sortida. La virulència dels esporozoïts sortits era significativament menor que la dels esporozoïts frescos. examinant les interaccions entre els paràsits apicomplexans i les seves cèl·lules hostes, així com la depuració de patògens intracel·lulars per part de l'hostesistema immunitari.

Paraules clau: Sortida, esporozoïts d'Eimeria tenella, Òxid nítric.

Cistanche tubulosaés rica enequinacòsidiverbascosid, de manera que té un bon efecte en la millora de la immunitat. Cistanche tubulosa és un material medicinal valuós que pot excitar la glàndula pituïtària i l'escorça suprarenal o tenir un efecte semblant a l'hormona similar a l'escorça suprarenal i regular la funció immune del cos. Està demostrat que els polisacàrids de Cistanche tubulosa poden millorar la funció immune del cos; l'efecte de millora immune depolisacàridcomponents poden tenir un paper important en l'enfortiment i l'efecte tònic de Cistanche tubulosa. Verbasin, un dels ingredients actius de Cistanche tubulosa, ha demostrat per experts que també té efectes positius en la regulació immune. Segons les dades de recerca existents a l'àmbit acadèmic, es pot considerar que la funció immunomoduladora i laxant de la medicina tradicional xinesa Cistanche té una gran importància clínica per millorar la immunitat del cos i la recuperació dels pacients amb COVID{0}}.

Feu clic per aprendre cistanche nootròpics

Introducció

Els membres del fílum Apicomplexan són patògens intracel·lulars obligats i inclouen Toxoplasma Gondi, Plasmodium spp. i Cryptosporidium spp., que infecta molts hostes vertebrats, inclosos els humans, causant malalties greus [9,25,33]. Els paràsits apicomplexans pateixen processos complexos en les seves etapes asexuals, com ara la invasió, la replicació i la sortida [28]. Entre aquests processos, la sortida és un pas vital que permet als paràsits envair una altra cèl·lula hoste per a un desenvolupament posterior [14]. L'emissió generalment dóna lloc a la lisi de les cèl·lules hoste, donant lloc a conseqüències perjudicials [5, 6]. Com que el procés és crucial tant per als patògens d'aquest fílum com per als hostes, s'han realitzat molts estudis en aquest camp [29, 30]. Tanmateix, la majoria d'aquests informes es limiten a Plasmodium spp. i Toxoplasma Gondi [6]. Eimeria spp. és un altre gènere important de paràsits apicomplexans que causa greus impactes negatius a la indústria avícola a tot el món, però se sap poc sobre el procés de sortida d'aquest gènere [11].

Eimeria spp. pot provocar una malaltia intestinal greu en els pollastres, provocant pèrdues de la indústria avícola mundial d'aproximadament 3.000 milions de dòlars anuals [16, 31]. Comprendre la relació entre Eimeria spp. i el seu hoste és de gran interès per al control de la coccidiosi. El nostre estudi anterior va revelar que la secreció d'ions de calci (Ca2t) i de proteïna microneme 2 (EtMic 2) eren crucials per a l'eixida de paràsits eimerians [35, 36].

Molts estudis recents s'han centrat en la sortida inductible estimulada per molècules immunes per desenvolupar estratègies per tractar els paràsits apicomplexans [12,27,37]. Per exemple, la mort cel·lular induïda per interferó-y condueix a una sortida precoç dels taquizoïts de T. Gondi, que poden alterar el cicle de vida de les cèl·lules hostes i promoure l'eliminació d'aquest patogen [26]. Recentment hem informat que l'òxid nítric (NO) podria estimular la ràpida sortida de taquizoïts de T. gondii dels macròfags infectats (cèl·lules immunitàries) i cèl·lules de fibroblasts de prepuci humà (cèl·lules no immunes)[19,34].

El NO és produït per molts tipus de cèl·lules, com ara les cèl·lules dendrítiques, de pal, assassins naturals i fagocítiques, en resposta a l'estimulació de citocines i té un paper important en la protecció mediada immunològicament contra molts tipus de patògens in vitro i en models animals, inclosos els protozous[10]. ,17]. Durant la infecció per protozous com Plasmodium spp. i Toxoplasma Gondi augmenta la producció de NO media la protecció de l'hoste ja sigui matant els paràsits directament o limitant el creixement del paràsit [8]. Estudis anteriors han informat d'una major producció de NO durant la infecció primària per E. tenella, de manera que el NO actua com a efector anticoccidial [1]. Per tant, hem intentat detectar si el NO podria estimular l'eixida primerenca dels esporozoïts d'E. tenella de les cèl·lules hostes in vitro per proporcionar més informació per a l'estudi d'Eimeria spp. sortida i va presentar nous coneixements sobre l'eliminació de patògens intracel·lulars per part dels hostes.

Materials i mètodes

Paràsits, pollastres i cultiu cel·lular

La soca E. tenella M2e, una soca transgènica que expressa de manera estable la proteïna fluorescent groga millorada (EYFP)[21] utilitzada en aquest estudi, es va mantenir propagant-se en polls d'engreix Arber Acres sense coccidis que es van comprar a Beijing Arbor Acres Poultry Breeding Co. , Ltd.; Pequín, Xina. Tots els ocells es van allotjar en aïllants per evitar la contaminació per altres espècies d'Eimeria spp. L'aïllament, la purificació i l'esporulació dels ooquists es van dur a terme segons els protocols establerts [22]. Tots els experiments amb animals es van dur a terme d'acord amb els procediments d'ètica animal aprovats pel Comitè d'Inspecció Ètica Experimental i de Benestar Animal de la Universitat Agrícola de la Xina (aprovació núm. 20160921-2). La purificació d'esporozoïts es va dur a terme tal com es va descriure anteriorment [35]. Els esporozoïts acabats de purificar es van suspendre amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) i es va comptar el nombre de paràsits mitjançant una placa de recompte de cèl·lules sanguínies. Les cèl·lules primàries de ronyó de pollastre (PCK) es van preparar tal com es va descriure anteriorment [12] i es van sembrar en plaques de cultiu de 24-pous complementades amb medi Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) que contenia sèrum boví fetal (10 per cent, v/v), penicil·lina ( 200 U/mL) i estreptomicina (100 ug/mL). La densitat cel·lular es va ajustar a 1 × 10 graus de cèl·lules/pou.

Mesura de la concentració de NO

La concentració de NO alliberat per SNP es va avaluar mesurant el NO,/NO; proporció per reacció de Griess mitjançant un kit d'assaig de NO (Applygen Tech Inc., Beijing, Xina), segons les instruccions del fabricant.

Assaig de sortida induït per NO

Els PCK es van cultivar a 41 graus i un 5 per cent de CO, durant la nit seguits de tres rentats amb PBS per eliminar les cèl·lules no adherents. Després de 2 dies, els PCK es van incubar amb esporozoïts EtM2e amb una multiplicitat d'infeccions (MOI de 2.0(proporció paràsit/cèl·lula de 2:1) a 37 graus durant 12 h. Els esporozoïts no invasius es van eliminar mitjançant el rentat A continuació, les cèl·lules es van incubar amb diverses concentracions (10, 20 i 40 mM) de nitròfer-ricianur de sodi (I) dihidrat (SNP; Sigma) o amb transportador DMEM sol durant diferents temps de tractament (10, 20 i 30). min).Després del tractament, els paràsits sortits es van suspendre en 500 μL de DMEM, i es van analitzar suspensions de 10 ul per citometria de flux (C6, Accuri Cytometers, Inc. Ann Arbor, MI, Estats Units).

Videomicroscòpia

Les PCK es van tractar amb SNP 40 mM després de 12 h d'incubació amb esporozoïts EtM2e a un MOI de 2,0. La progressió de la sortida es va registrar mitjançant un microscopi de llum (Carl Zeiss, Olympus).

Detecció de l'efecte en l'etapa de desenvolupament del paràsit

Abans del tractament amb SNP 40 mM durant 30 min, es va permetre que es desenvolupessin esporozoïts en PCK durant 24 o 36 h, que és l'etapa de trofozoït d'aquest paràsit. Després del tractament, els paràsits sortits es van suspendre en 500 µL de DMEM i es van analitzar suspensions de 10 µL mitjançant citometria de flux.

Determinació de la viabilitat de la cèl·lula hoste

Els PCK es van rentar després de la sortida induïda per NO, la invasió d'esporozoïts, el tractament amb SNP i en el grup no tractat, respectivament, i es va mesurar la viabilitat cel·lular mitjançant iodur de propidi (PI; eBioscience). Breument, els PCK de cada grup es van rentar amb PBS i es van tripsinitzar suaument després del tractament, i les cèl·lules individuals es van tacar amb PI, segons les instruccions del fabricant. El percentatge de cèl·lules viables es va analitzar mitjançant citometria de flux.

Assaig d'inhibició

Per a assajos d'inhibició, es van utilitzar el quelant intra Ca2 més BAPTA-AM (Sigma, St. Louis, MO, Estats Units) i l'inhibidor de fosfolipasa C específic de fosfoinosítid U-73122(Sigma) per avaluar l'efecte de Ca2 plus sobre els esporozoïts. sortida. En un altre experiment, es va utilitzar la citocalasina D (CyoD; MerckDarmstadt. Germany) per bloquejar la motilitat dels paràsits. Els PCK infectats es van tractar prèviament amb BAPTA-AM 10 μM. U-73122.o CytoD preparat en dimetil sulfòxid (Sigma) durant 30 min. A continuació, els cultius cel·lulars es van incubar amb SNP 40 mM durant 30 min. i el nombre d'esporozoïts sortits es va avaluar tal com es descriu anteriorment.

Virulència dels paràsits sortits

Els PCK es van incubar amb esporozoïts durant 12 h seguits d'un tractament amb SNP 40 mM durant 30 min. El medi de cultiu cel·lular que contenia paràsits lliures després del tractament amb SNP es va recollir i es va rentar tres vegades amb PBS. i es va provar la viabilitat del paràsit utilitzant un 4% d'exclusió de colorant blau tripà. Els paràsits sortits es van comptar mitjançant plaques de recompte de cèl·lules sanguínies. Per detectar la virulència, es van provar la reinvasió i les capacitats reproductives dels paràsits sortits després del tractament amb 40 mM de NO durant 30 min. Els PCK es van incubar amb paràsits sortits a

Virulència dels paràsits sortits

Els PCK es van incubar amb esporozoïts durant 12 h seguits d'un tractament amb SNP 40 mM durant 30 min. El medi de cultiu cel·lular que contenia paràsits lliures després del tractament amb SNP es va recollir i es va rentar tres vegades amb PBS. i es va provar la viabilitat del paràsit utilitzant un 4% d'exclusió de colorant blau tripà. Els paràsits sortits es van comptar mitjançant plaques de recompte de cèl·lules sanguínies. Per detectar la virulència, es van provar la reinvasió i les capacitats reproductives dels paràsits sortits després del tractament amb 40 mM de NO durant 30 min. Els PCK es van incubar amb paràsits sortits i es van utilitzar com a control. Per avaluar la capacitat reproductiva de l'amfitrió, es van inocular 2 × 10" esporozoïts acabats de preparar i una quantitat igual de paràsits sortits a pollastres de graella AA d'3-setmanes d'edat per la ruta cloacal i tots els ocells es van allotjar en aïllants [13]. La producció total d'ooquists per ocell es va mesurar mitjançant una cambra de recompte d'ous McMaster 6-9 dies després de la infecció [15].

Anàlisis estadístics

Es va utilitzar el programari SPSS 20.0 (SPSS Inc.) per analitzar les diferències entre els grups de tractament i control. Totes les altres anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant el programari GraphPad Prisma 5.01 (Graphpad Software). Les dades s'expressen com a mitjanes ± error estàndard de la mitjana (SEM). Els grups experimentals es van comparar mitjançant una anàlisi de variància unidireccional (ANOVA).

La significació estadística es va avaluar a nivells de p < 0,05 (significatiu) i p<0.01 (highly="">

Resultats

Sortida exògena d'esporOzoïts d'E. tenella estimulada pel NO

Abans de realitzar assajos de sortida, vam comprovar si la concentració de NO alliberat de SNP es podia mantenir estable quan es dissolva en DMEM en 30 minuts per reacció de Griess (Fig. 1A). A continuació, vam incubar cultius cel·lulars infectats amb esporozoïts amb diferents concentracions de SNP durant diferents durades, tal com es descriu anteriorment. El nombre d'esporozoïts lliures va augmentar quan els PCK infectats es van incubar amb SNP (Fig. 1B). També vam observar el procés de sortida de paràsits mitjançant gravació de vídeo (Fig. 1C).

Efecte de l'etapa de desenvolupament paràsit sobre la sortida estimulada per NO

Ens interessava si la sortida induïda per NO podria estar influenciada per les etapes de desenvolupament d'aquest paràsit en PCK. Abans de tractar amb 40 mM SNP durant 30 min, vam permetre que els esporozoïts es desenvolupessin a les cèl·lules hostes durant 24 o 36 h, respectivament, que és l'etapa de trofozoïts d'aquest parasit. Sorprenentment vam trobar que el nombre de paràsits sortits es va reduir significativament amb l'extensió del temps de desenvolupament del paràsit (Fig. 2), cosa que indica que l'etapa de desenvolupament del paràsit és un element important de l'eixida induïda pel NO.

Sortida de paràsits depenent del Ca2 plus paràsit i de la mobilitat

Un estudi anterior va demostrar que el Ca2 intraparasitari va tenir un paper vital durant l'eixida dels esporozoïts d'E. tenella [12, 34]. Hem realitzat experiments per determinar la importància del Ca2t en la sortida induïda per NO del paràsit. Tal com es mostra a les figures 3A i 3B, l'eixida induïda per NO es va bloquejar mitjançant un pretractament amb BAPTA-AM i U-73122, cosa que indica el paper vital del Ca2 plus intraparasitari i que la font de Ca2 plus en el

reticle endoplasmàtic (RE). A més, el pretractament amb Cyto-D per bloquejar la mobilitat del paràsit va mostrar resultats similars (Figs. 4A i 4B), cosa que indica que la mobilitat del paràsit és un altre factor important per a la sortida d'esporozoits.

La sortida de paràsits no està associada amb danys a la cèl·lula hoste

Per investigar la possibilitat que la sortida induïda per NO fos tòxica per a les cèl·lules hostes, es va mesurar la viabilitat cel·lular mitjançant la tinció de PI. Els resultats van mostrar que el percentatge de cèl·lules PI va augmentar després del tractament amb SNP, i no hi havia cap diferència entre els grups no infectats i els infectats, cosa que indica que la incubació de SNP va provocar danys cel·lulars, però no la sortida de paràsits (Figs. 5A i 5B).

La virulència del paràsit es redueix després de la sortida induïda per NO

Egressed parasites were collected and shown to remain viable by trypan blue exclusion (>85 per cent de viabilitat). A continuació, vam afegir els paràsits sortits als PCK o els vam inocular a pollastres d'engreix AA de 3-setmanes d'edat individualment per la ruta cloacal. Ambdues eficàcia invasiva (pàg<0.01)(fig.6a)and productivity="" in="" chickens=""><0.01)(fig.6b)of the="" parasites="" after="" no-induced="" egress="" decreased="" dramatically="" compared="" to="" that="" of="" freshly="" prepared="">

Discussió

En aquest estudi, vam trobar que el NO exògen estimulava la sortida primerenca dels esporozoïts d'E. tenella dels PCK infectats en un procés depenent del Ca2-. L'emissió de paràsits no va provocar danys a les cèl·lules hostes i la capacitat reinvasiva i la virulència dels paràsits sortits van disminuir significativament. En conjunt, aquests resultats suggereixen un nou model per estudiar el mecanisme de sortida del paràsit eimerian i proporcionen un nou mètode, mediat per NO, per reduir els patògens intracel·lulars a les cèl·lules hostes.

La sortida és un procés important que permet als paràsits eimerians sortir de les cèl·lules hoste i envair les cèl·lules veïnes per començar un nou cicle de vida intracel·lular; per tant, la sortida té un paper crucial en la patogènesi dins de l'hoste. Els nostres informes anteriors es van centrar en estudis mecanicistes preliminars de la sortida de paràsits eimerians [35, 36]. En aquest estudi es va incloure NO. Vam trobar que el NO podria induir la sortida dels paràsits poc després de la finalització de la invasió i molt abans de l'aparició de la sortida de mero-zoït madur, que va interrompre el cicle de vida d'aquest patogen. En el present estudi, els PCK infectats no van patir cap dany durant la sortida, cosa que difereix dels informes de necrosi de cèl·lules hoste en estudis similars de sortida de taquizoïts de T. Gondi [19, 20]. Una explicació plausible d'aquesta diferència és que els esporozoïts no es van replicar abans de dur a terme l'assaig de sortida. Per tant, no més de dos paràsits habitaven a les cèl·lules hostes, un valor molt inferior al dels taquizoïts informat en estudis anteriors [19, 32]. Una altra possible explicació és que, a diferència dels taquizoïts de T.gondi o dels merozoïts eimerians, el paràsit no té una proteïna específica per destruir les cèl·lules hoste per a la sortida natural en l'etapa d'esporozoit. Tanmateix, no hem trobat cap evidència directa que recolzi aquestes hipòtesis. Els nostres resultats van mostrar una reducció significativa de la virulència dels esporozoïts egressats, en contrast amb els taquizoïts de T. Gondi, que mantenen una virulència normal després de la sortida [27, 37]. Suposem que el paràsit s'havia anat desenvolupant d'esporozoïts a esquizonts quan es va realitzar l'assaig de sortida i que l'expressió gènica que regulava les proteïnes específiques de l'etapa del paràsit podria haver canviat. En contrast amb els esporozoïts eimerians, els taquizoïts de T. Gondi experimenten una fissió binària a les cèl·lules hostes, mantenint així una virulència normal. Per tant, vam pensar que si hi hagués certs estimuladors que poguessin induir la sortida d'Eimeria spp. després de la invasió, els paràsits sortits no podien mantenir la seva virulència normal in vivo, com els experiments in vitro. Aquesta sortida mediada per la immunitat pot interrompre el cicle de vida del paràsit i, finalment, promoure l'eliminació del paràsit per part de les cèl·lules immunitàries.

Estudis recents han revelat el paper crucial del Ca2 en la sortida de patògens apicomplexans [7,18]. El missatger secundari inositol 1,4,5-trifosfat (IP3) estimula l'alliberament de Ca2 de l'ER al citoplasma mitjançant la unió al receptor IP3 [3]. S'ha demostrat que IP3 indueix l'alliberament de Ca2 des de les piscines intracel·lulars tant a T.gondi [24] com a Plasmodium falciparum [2]; tanmateix, se sap poc de la presència genòmica dels receptors IP3 en paràsits apicomplexans [4, 23]. En el present estudi, es van bloquejar les vies intracel·lulars de Ca² i IP3 mitjançant BAPTA-AM i U-73122 per provar si l'emissió d'esporozoïts induïda per NO depèn de Ca plus i per determinar la font del Ca2t. Els nostres resultats van mostrar que l'eixida va ser restringida tant per BAPTA-AM com per U-73122, cosa que indica que el Cap intracel·lular té un paper vital en la sortida d'esporozoits d'E. tenella. Tot i que vam demostrar que el Ca2 plus intracel·lular és vital per a l'eixida de paràsits, la via i la funció de les proteïnes relacionades requereixen un estudi addicional mitjançant mètodes més avançats i precisos.

En resum, els resultats d'aquest estudi indiquen que el NO pot estimular la sortida primerenca dels esporozoïts d'E. tenella dels PCK infectats i proporcionar informació preliminar sobre el mecanisme d'aquesta sortida. En estudis futurs, buscarem identificar molècules immunes addicionals que indueixin l'emissió primerenca d'esporozoïts d'E. tenella i investigar si el NO pot induir una sortida primerenca de paràsits eimerians de cèl·lules epitelials intestinals de pollastre in vitro i in vivo.