Experiment 3 Efecte del glicòsid de feniletanol Cistanche Deserticola en el model perimenopausal de rata Ⅲ

Experiment 3 Efecte del glucòsid de feniletanol Cistanche deserticola en el model perimenopausal de rata

1 Materials experimentals

1.1 Animals d'experimentació

Rates Wistar, grau SPF, femella, proporcionades per Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., número de certificat de rata per a aquest lot: 0017216; número de certificat de laboratori SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Medicaments experimentals

Glucòsid de feniletanol Cistanche deserticolaes va preparar segons el mètode de l'Experiment 1, i el contingut va arribar al 66,47%. Càpsula Gengnian'an, ingredients: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, escorça de peònia, Poria cocos, nacre, curculigo, Schisandra chinensis, magnetita, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, polygonum wflorheatum, flotant . Funcions i indicacions:Nodreix el yin i sotmet el yang, alleujar els problemesi calmar la ment. S'utilitza per a la menopausa, sudoració i sudoració, marejos, tinnitus, irritabilitat i insomni. Especificacions: 0,3 g per càpsula. Ús i dosificació: Oral, 3 càpsules alhora, 3 vegades al dia. Fabricant: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Número de lot de producció: 121104. Número d'aprovació: Núm. d'aprovació nacional de medicaments Z14021848.

Isoflavones de soja i càpsules toves de vitamina E, llista d'ingredients: isoflavones de soja en pols, vitamina E, oli de gira-sol, gelatina, glicerina, aigua, tartrazina, diòxid de titani. Ingredients i contingut icònics: Cada 100 g conté 55,2 mg d'isoflavones de soja (calculades com a genisteïna) i 608,5 mg de vitamina E. Funcions per a la salut: Augmenta la densitat òssia. Instruccions i dosificació: Prendre 1 càpsula 2 vegades al dia amb aigua tèbia. Especificacions: 500 mg × 100 càpsules. Fabricant: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Número de lot de producció: 13070302. Número d'aprovació: National Food Health G20080032.

QUANT TEMPS TREGA A FUNCIONAR CISTANCHE?

1.3 Reactius experimentals

Carboximetilcel·lulosa sòdica, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., número de lot: 20120418; penicil·lina sòdica per a injecció, North China Pharmaceutical Co., Ltd., especificació: 4 milions d'unitats, número de lot de producció: c1206807;

Solució de formaldehid (analíticament pura), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., número de lot de producció: 20130902; Injecció de clorur de sodi al 0,9%, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; especificació: 250 ml, número de lot de producció: 13082405B;

Hidrat de cloral, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, número de lot 20120827; Kit de detecció ELISA Rat E2, R+D Company, número de lot: 20140101A; Rat T ELISA kit de detecció, R+D Company, número de lot: 20140101A; Rat LH ELISA kit de detecció, R+D Company, número de lot: 20140101A; Rat FSH ELISA kit de detecció, R+D Company, número de lot: 20140101A;

2 Mètodes experimentals

2.1 Modelatge i Administració de Medicaments

Mètode de modelatge: agafeu 100 rates Wistar femenines amb un pes corporal de 210 ~ 230 g, seleccioneu aleatòriament 12 rates com a grup en blanc i feu una cirurgia simulada, i les rates restants s'utilitzaran per crear la menopausa. models. Després de pesar les rates, les rates es van anestesiar mitjançant injecció intraperitoneal d'hidrat de cloral al 10% (0, 3 ml/100 g) i es va fixar la posició abdominal. A continuació, es van retallar les rates de sota l'última costella a l'esquena a la intersecció de la línia axil·lar mitjana i a uns 2 cm del costat lateral de la columna i després es van desinfectar. La pell i els músculs de l'esquena estan incisos aproximadament 1 cm, i es pot veure una massa de greix brillant de color blanc lletós al camp de visió de la incisió, i l'ovari s'hi incrusta. Utilitzeu unes pinces petites per agafar suaument la massa de greix i treure-la de la incisió, separar la massa de greix i veureu un grup d'ovaris prims, irregulars i groc-vermells. Quan talleu, primer lligueu la trompa de Fal·lopi (inclòs el greix) sota l'ovari amb un fil prim, traieu completament l'ovari esquerre i traieu el 80% de l'ovari dret. Després de l'operació, es van tornar a posar les banyes uterines a la cavitat abdominal, es van suturar els músculs i la pell i es van extirpar tots dos ovaris de la mateixa manera. Després de l'operació, els animals van ser criats amb cura i es van injectar per via intramuscular 200,000 u/kg de penicil·lina (0,1 ml cadascun) per prevenir la infecció, un cop al dia durant 3 dies consecutius. 5 dies després de l'operació, es va iniciar l'examen de frotis vaginal de rates un per un, una vegada al dia durant 5 dies consecutius. Es van descartar rates amb reaccions estrals al frotis. Es van seleccionar 72 rates completament castrades i es van dividir aleatòriament en 6 grups. Amb finalitats experimentals, són el grup model, el grup Gengnianan, el grup de les isoflavones de soja i el grup de glicòsids de feniletanol Cistanche deserticola a dosis grans, mitjanes i petites.

Mètode de preparació: Mètode de preparació: {{0}},5% CMC Mètode de preparació: Peseu 4 g de carboximetil cel·lulosa sòdica i barregeu-ho amb aigua destil·lada per obtenir 800ml. Les dosis de dosis grans, mitjanes i petites del grup de glicòsids de feniletanol Cistanche deserticola van ser de 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg i 33,33 mg/kg respectivament (volum d'administració 1 ml/100 g). Mètode de preparació: Peseu 1333,3 mg, 666,7 mg i 333,3 mg de flavonoides totals de gerds respectivament, dissoleu-los amb una petita quantitat de CMC al 0,5%, ajusteu el volum a 100 ml, barregeu bé i ja està. Càpsules de Gengniangan (450 mg/kg, barrejades amb aigua destil·lada a 45 mg/ml, 1 ml/100 g, equivalent a 10 vegades la dosi clínica); Mètode de preparació: Agafeu 15 càpsules de Gengniangan, primer dissoleu-les amb una petita quantitat de CMC al 0,5%, després ajusteu el volum a 100 ml i barregeu bé, que és la dosi de Suspensió de càpsules de Gengnianan (450 mg/kg). Càpsules suaus de vitamina E isoflavona de soja (166,67 mg/kg, utilitzeu aigua destil·lada per fer 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, equivalent a 10 vegades la dosi clínica); Mètode de preparació: Agafeu 4 càpsules toves de vitamina E isoflavones de soja, primer dissoleu amb una petita quantitat de CMC al 0,5%, després ajusteu el volum a 120 ml i barregeu bé per obtenir la dosi de suspensió de càpsules toves de vitamina E isoflavones de soja (16,67 mg/kg). ).

Mètode d'administració: els animals de cada grup van rebre els medicaments corresponents l'10dia després de la cirurgia. El grup en blanc i el grup model es van sondar amb el mateix volum de solució de CMC al 0,5% (el volum de sonda va ser d'1 ml/100 g) i el grup de Gengnianan es va donar amb una suspensió de càpsules de Gengnianan (450 mg/kg, equivalent a 10 vegades la dosi clínica). ). ), al grup d'isoflavones de soja se li va administrar per via oral la suspensió de càpsula tova de vitamina E d'isoflavona de soja (166,67 mg/kg, equivalent a 10 vegades la dosi clínica) i la dosi gran, mitjana i petita.Glucòsid de feniletanol Cistanche deserticolaels grups es van administrar oralment segons el grup. Dosis grans, mitjanes i petites de glucòsid de feniletanol Cistanche deserticola (les dosis són de 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg i 33,33 mg/kg, respectivament, el volum de dosificació és d'1 ml/100 g), administrada una vegada al dia per administració intragàstrica de forma continuada . medicament durant 30 dies.

2.2 Elements d'observació i mètodes de detecció

Les puntuacions de moviment horitzontal-vertical de rates de cada grup es van mesurar 29 dies després de l'administració. 2 hores després de l'última administració gàstrica (dejú durant 15 hores), retireu els globus oculars per recollir sang, separeu el sèrum iplasma, i mesurar els continguts d'E2, T, LH, FSH, GnRH i BGP al sèrum, i el contingut de -EP al plasma; es van disseccionar les rates. Traieu el tim, la melsa, l'úter i el 20% restant del teixit ovàric, peseu-ne el pes humit i calculeu l'índex d'òrgans del tim, la melsa i l'úter (índex d'òrgans=pes humit d'òrgans mg/pes de rata g) , i després treure el cervell Per a l'hipotàlem i la glàndula pituïtària, es van preparar homogeneïtats de teixit a partir de l'hipotàlem, la glàndula pituïtària i 1/2 de l'úter, i el contingut dels receptors d'estrògens a l'hipotàlem, la hipòfisi i els homogeneïtats del teixit uterí i els andrògens. Es va determinar el contingut de receptors en els homogeneïtats de teixit hipotalàmic. El tim, la melsa, l'úter i l'ovari es van fixar en una solució de formaldehid al 10%, es van incrustar en parafina, es van seccionar i es van tacar amb HE. Elcanvis histomorfològicsen cada grup es van observar al microscopi de llum.

2.2.1 Prova del mètode de camp obert

El dispositiu experimental és una caixa cúbica oberta amb una alçada de 40 cm i una llargada i amplada de 80 cm. Les parets circumdants i el fons són negres. La part inferior està composta per 25 blocs d'àrea igual, dividits per línies blanques. Durant l'experiment, la rata es va col·locar al quadrat al centre de la caixa oberta i la puntuació d'activitat horitzontal del nombre de blocs que la rata va creuar a la part inferior en 5 minuts (es poden comptar els quadrats amb les quatre potes introduïdes), i el nombre de vegades que les extremitats posteriors es van posar dretes (dues potes davanteres estaven a l'aire). (o aferrat a una paret) puntuació d'activitat vertical. Les femtes s'han d'eliminar completament després de cada experiment, i cada rata es mesura una vegada 2 hores després de l'administració. Aquest experiment es va dur a terme en una habitació tranquil·la.

2.2.2 Mètode de determinació del kit

Obtenir mostres de sèrum: Utilitzeu provetes lliures de pirògens i endotoxines. Eviteu qualsevol estimulació cel·lular durant l'operació. Després de recollir la sang, centrifugueu-la a 3000 rpm durant 10 minuts per separar ràpidament i amb cura el sèrum i els glòbuls vermells. Obtenir mostres de plasma: anticoagulades amb tubs d'anticoagulant d'heparina. Centrifugar a 3000 rpm durant 30 minuts i agafar el sobrenedant. Obtenir mostres d'homogeneïtat de teixit: afegiu una quantitat adequada de solució salina fisiològica al teixit i tritureu-lo. Centrifugar a 3000 rpm durant 10 minuts i agafar el sobrenedant.

El mètode de determinació del kit ELISA d'estradiol (E2) de rata (rata) és el mateix que l'experiment 2. Les concentracions dels estàndards (S0-S5) són 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pmol/L.

El mètode d'assaig de Rat (Rat) Testosterona (T) ELISA Kit és el mateix que el mètode d'assaig del Estradiol ELISA Kit. Les concentracions dels estàndards (S{{0}}S5) són {{10}}, 2{{2{0}}, 40, 80, 160 i 320 pg /mL. El mètode de determinació del kit de detecció ELISA de l'hormona luteïnitzant (LH) de rata (rata) és el mateix que el mètode de determinació del kit de detecció ELISA d'estradiol. Les concentracions dels estàndards (S0-S5) són 0, 3, 6, 12, 24 i 48 ml/ml. El mètode d'assaig del kit ELISA de l'hormona estimulant del fol·licle (FSH) de rata (rata) és el mateix que el mètode d'assaig del kit ELISA d'estradiol. Les concentracions dels estàndards (S0-S5) són 0, 0,75, 1,5, 3, 6 i 12 UI/L. El mètode de determinació del kit de detecció ELISA de l'hormona alliberadora de gonadotropina (GnRH) de rata (rata) és el mateix que el mètode de determinació del kit de detecció ELISA d'estradiol. Les concentracions dels estàndards (S0-S5) són 0, 5, 10, 20, 40 i 80 mlU/ml.

El mètode de determinació del kit de detecció ELISA d'osteocalcina de rata (rata) (BGP/OCN) és el mateix que el mètode de determinació del kit de detecció ELISA d'estradiol. Les concentracions dels estàndards (S{{0}}S5) són 0, 0,75, 1,5, 3, 6 i 12 ng/ml. El mètode de determinació del kit de detecció ELISA de rata (Rat) -endorfina (-EP) és el mateix que el mètode de determinació del kit de detecció ELISA d'estradiol. Les concentracions dels estàndards (S0-S5) són 0, 3, 6, 12, 24 i 48 pg/mL. El mètode de determinació del kit de detecció ELISA del receptor d'estrògens (ER) de rata (rata) és el mateix que el mètode de determinació del kit de detecció ELISA d'estradiol. Les concentracions dels estàndards (S{{20}}S5) són 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pg/mL. El mètode de determinació del kit de detecció ELISA del receptor d'andrògens (AR) de rata (rata) és el mateix que el mètode de determinació del kit de detecció ELISA d'estradiol. Les concentracions dels estàndards (S0-S5) són 0, 25, 50, 100, 200 i 400 pg/mL.

2.3 Mètodes de tractament estadístic

Per a l'anàlisi de dades, es va utilitzar el paquet estadístic mèdic SPSS17.0 per al processament estadístic de dades. Les dades de mesura es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard (-x±s). Es va utilitzar l'anàlisi unidireccional de la variància per a la comparació entre grups. Es va utilitzar el mètode LSD per provar l'homogeneïtat de les variàncies. , es va utilitzar la prova de Games-Howell per a les variacions desiguals i la prova de Ridit per a les dades de qualificació.

Es pot veure a la taula 11 i la figura 14 que, en comparació amb el grup en blanc, l'índex de tim, l'índex de melsa i l'índex uterí de les rates del grup model es van reduir significativament (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Efectes sobre els nivells d'índex bioquímic de la sang en rates model perimenopàusiques

Els continguts sèrics d'E2, T, LH, FSH, GnRH i BGP i els continguts de plasma -EP de rates de cada grup es mostren a les taules 12 ~ 13 i figures 15 ~ 17.

Es pot veure a les taules 12 ~ 13 i les figures 15 ~ 18 que, en comparació amb el grup en blanc, els nivells sèrics d'E2 i T de rates del grup model es van reduir significativament (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Taula 14 Efecte del glucòsid de feniletanol de Cistanche deserticola sobre els nivells sèrics de GnRH i plasma -EP en el model de perimenopausa de rata (-x±s)

Es pot veure a la taula 14 i a les figures 19-20 que, en comparació amb el grup en blanc, el nivell de GnRH sèric de rates del grup model va augmentar significativament i el nivell de EP en plasma es va reduir significativament (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Efectes sobre els continguts d'ER i AR en teixits de rates model perimenopàusiques

Els continguts d'ER i AR en teixits rellevants de rates de cada grup es mostren a les taules 16 ~ 17 i figures 22 ~ 23.

Es pot veure a la taula 17 i la figura 23 que, en comparació amb el grup en blanc, el nivell d'AR a l'hipotàlem del grup model era significativament més baix (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Efectes sobre la morfologia dels teixits d'òrgans en rates model perimenopàusiques

Els resultats de l'observació patològica i histològica de l'úter, el tim i la melsa de rates de cada grup experimental són els següents. Les fotos patològiques es mostren a l'Apèndix 1 per a les fotos patològiques de rates model perimenopàusiques.

5.1 Efecte sobre la morfologia del teixit uterí en rates model perimenopàusiques

Segons els diferents graus de canvis en l'endometri, les glàndules i el miometri de les rates de cada grup experimental, es van utilitzar estàndards semiquantitatius per dividir la morfologia del teixit patològic en quatre nivells, i els úters de les rates de cada grup experimental van ser mesurat. Els resultats de l'observació es mostren a la taula 18.

"-" Les cèl·lules epitelials de l'endometri, les glàndules, el miometri i la serosa són totes normals; "+" les cèl·lules i glàndules epitelials de l'endometri estan atrofiades, i el miometri i la serosa són normals; "++" l'epiteli endometrial Les cèl·lules i les glàndules estan parcialment atrofiades, la capa muscular està lleugerament atrofiada i la serosa és normal; Les cèl·lules i glàndules epitelials endometrials "+++" estan significativament atrofiades i la serosa és normal.

Després de la prova de Ridit, es pot veure a la taula 18 que, en comparació amb el grup en blanc, l'úter de rates del grup model va mostrar lesions tisulars patològiques significatives (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Efecte sobre la morfologia del teixit ovàric en rates model perimenopàusiques

Segons els diferents graus de canvis en els fol·licles, el cos luti, les cèl·lules de la granulosa i els vasos sanguinis als ovaris de rates de cada grup d'experiments, es van utilitzar estàndards semicuantitatius per dividir la morfologia del teixit patològic en quatre nivells. Es van mesurar i observar els ovaris de rates de cada grup d'experiments. Els resultats es mostren a la taula 19.

Taula 19 Efecte del glucòsid de feniletanol Cistanche deserticola sobre els canvis patològics ovàrics en rates model perimenopausa Unitat: només

"-" pot mostrar fol·licles en creixement, fol·licles madurs i cos luti a tots els nivells. El cos luti està ben desenvolupat, amb moltes capes de cèl·lules de la granulosa, líquid fol·licular ric i vasos sanguinis rics; "+" pot mostrar fol·licles en creixement, fol·licles madurs i cos luti, però el nombre de fol·licles madurs i cos luti és petit. , els fol·licles són més petits i les cèl·lules de la granulosa són menys estratificades; "++" pot mostrar fol·licles madurs i el cos luti, amb més cos luti, menys cèl·lules de la granulosa i menys vasos sanguinis; "+++" no té fol·licles, més cos luti, i l'ovari Atròfic, avascular.

Després de la prova de Ridit, es pot veure a la taula 19 que, en comparació amb el grup en blanc, els ovaris de les rates del grup model mostraven lesions tisulars patològiques significatives (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Efectes sobre la morfologia del timus i el teixit de la melsa en rates model perimenopàusiques

Amb un micròmetre, mesureu el gruix de les parts més gruixudes i estretes de l'escorça tímica de cada rata de cada grup experimental per obtenir la mitjana; utilitzeu la línia de base del micròmetre per caure sobre els nòduls esplènics, mesureu el gruix dels nòduls esplènics a banda i banda. amb l'artèria central com a centre, i calcular la mitjana. Els resultats mesurats es mostren a la Taula 20 i la Figura 24.

Es pot veure a la taula 20 i la figura 24 que, en comparació amb el grup en blanc, el gruix de l'escorça del tim i el volum de nòduls esplènics del grup model es van reduir significativament (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).