Patró d'expressió de -tubulina, inversina i el seu objectiu despeinada-1 i morfologia dels cilis primaris en el desenvolupament normal del ronyó humà i les malalties
Mar 10, 2022
Resum:L'expressió espaciotemporal de -tubulina, inversió i proteïnes desordenades-1 (DVL{-1) associades amb la via de senyalització Wnt i la morfologia dels cilis primaris es van analitzar en el desenvolupamentronyons(setmanes de desenvolupament 14 a 38), postnatal saludable (1.5- i 7-anys) i humans patològicament canviatsronyons,inclòs el displàstic multiquísticronyons(MCDK), glomeruloesclerosi segmentària focal (FSGS) i síndrome nefròtica de tipus finlandès (CNF). L'anàlisi es va realitzar mitjançant doble immunofluorescència, microscòpia electrònica, mètodes semicuantitatius i estadístics. Es va observar la coexpressió citoplasmàtica de -tubulina, inversió i DVL-1 als túbuls contornejats proximals (pct), als túbuls contornejats distals (dct) i als glomèruls (g) dels teixits analitzats. Durantronyódesenvolupament, l'expressió global de -tubulina, inversió i DVL-1va disminuir, mentre que en el període postnatal va augmentar lleugerament. Les expressions més altes de -tubulina i inversió van caracteritzar dct i g, mentre que un alt DVL-1 caracteritzava pct. -Patrons d'expressió de tubulina, inversió i DVL-1 en MCDK, FSGS i CNFronyonsdifereix significativament del control saludable. En comparació amb saludableronyons, patològicament canviatronyonstenia cilis primaris dismòrfics. Dinàmiques d'expressió diferents de -tubulina, inversió i DVL-1 durantronyóEl desenvolupament podria indicar que el canvi entre la senyalització Wnt canònica i no canònica és essencial per a la normalitatronyómorfogènesi. En canvi, la seva expressió alterada en patològicaronyonspodria estar associada amb cilis primaris anormals, que condueixen a crònicsmalalties renals.
Paraules clau:desenvolupament del ronyó humà; -tubulina; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; ronyó, renal
CISTANCHE MILLORARÀ LA MALALTIA RENAL/RENAL
Introducció
El desenvolupament del definitiu o metanèfricronyonscomença durant la cinquena setmana gestacional (GW), que després es diferencia contínuament per formar els ronyons permanents [1,2]. Les interaccions de senyalització entre el mesenquima metanèfric i el brot uretèric garanteixen una correctaronyódesenvolupament durant la nefrogènesi. Breument, el brot uretèric indueix la transició mesenquimal a epitelial (MET) al mesenquima metanèfric, que es condensa i formarenalvesícules, seguits de cossos en forma de coma i en forma de S, i finalment condueixen a la formació de glomèruls [3]. A canvi, el mesènquima indueix una ramificació addicional del brot uretèric. Els ronyons metanèfrics esdevenen unitats excretores funcionals a la 11a setmana de desenvolupament humà. Tanmateix, la nefrogènesi es completa entre la 34a i la 36a setmana del desenvolupament fetal, quan s'han acabat múltiples esdeveniments de ramificació, però el procés de diferenciació posterior dels ronyons continua durant el període postnatal [4,5]. Les interrupcions d'aquestes interaccions complexes donen lloc a diverses anomalies congènites del ronyó i del tracte urinari (CAKUT), inclosa la displàsia, la malaltia renal poliquística, la displàsia multiquística.malaltia de ronyó(MCDK), que en conseqüència condueix a la crònicamalaltia de ronyó(ERC) [6].
En aquest estudi, ens vam centrar en l'aspecte dels cilis primaris i la via de senyalització Wnt, que juga un paper important durant la nefrogènesi normal i en laronyóprocés de reparació, després agut o crònicmalaltia de ronyó[7]. L'existència de cilis primaris durant la nefrogènesi i el gran nombre de desenvolupamentronyóEls defectes que es produeixen en pacients amb malaltia ciliar assenyalen que la funció dels cilis primaris genuïns és necessària per a la normalitatronyóorganogènesi [8,9]. El cili primari és un orgànul basat en microtúbuls important per a l'homeòstasi dels teixits, on -tubulina és el component bàsic [10]. La pèrdua de l'acetilació de la tubulina a les cèl·lules immortalitzades desencadena la transició epitelial-mesenquimal (EMT), cosa que implica que la tubulina acetilada és important en l'estabilització dels microtúbuls [11]. Durant el desenvolupament humà, la via principal de Wnt mediada pels cilis permet la proliferació cel·lular, la diferenciació i la morfogènesi dels teixits [12]. Un nombre significatiu de nens amb alteració de la funció dels cilis primaris i la via de senyalització Wnt interrompuda desenvolupen ERC, on congènitarenalels trastorns són responsables de gairebé la meitat dels casos [13]. La malaltia quística congènita més freqüent en nens és la displàstica multiquísticamalaltia de ronyó(MCDK) [14]. Múltiples quists que no es comuniquen [15] i no són normalsrenalEl parènquima són troballes microscòpiques característiques de la MCDK. La glomeruloesclerosi segmentària focal (FSGS) és una de les malalties glomerulars més freqüents que condueixen a l'etapa terminal.malaltia de ronyó[16]. Al principi, el FSGS és característic de ser focal, implicant només una minoria dels glomèruls i segmentari, que implica canvis només en un segment del cercle glomerular [17]. La síndrome nefròtica congènita de tipus finlandès (CNF) és una malaltia autosòmica recessiva heretada poc freqüent.malaltia de ronyórepresentat per un brot prenatal de pèrdua extensa de proteïnes [18], associada a la cistogènesi dels túbuls proximals [19]. Moltes formes de malalties glomerulars primàries desenvolupen proteinúria com a resultat de la danyada la barrera de filtració glomerular [20]. Una quantitat considerable d'estudis implica que la lesió i la disfunció dels podòcits tenen papers intrínsecs en la patogènesi de la proteinúria CKD [21]. L'estudi de Vukojevic et al. mostra un nombre augmentat de podòcits ciliats i poc diferenciats al CNF [22]. Estudis anteriors van indicar que la via de senyalització Wnt/-catenina té un paper fonamental en la moderació de la disfunció dels podòcits amb proteinúria [23]. Hi ha dues vies principals de senyalització Wnt, una coneguda com a dependent de -catenina canònica i una altra no canònica, independent de -catenina. Durant el ratolíronyódesenvolupament, la senyalització canònica de Wnt està activa a les puntes dels brots ureteris i als cossos en forma de S [24]. A més, Wnt mitjançant senyalització canònica té rellevància per mantenir la MET durant la nefrogènesi [25]. És a dir, la unió del complex proteic que conté Dvl al receptor de membrana és obligatòria per a l'activació de la via Wnt, mentre que la desactivació dels components clau d'aquesta via provoca una mortalitat perinatal precoç a causa de l'absència de la zona nefrogènica a laronyó[25].
Es va trobar que una proteïna crucial com a canvi molecular entre les vies de senyalització Wnt canòniques i no canòniques era la inversió [26]. Tot i que s'han detectat interaccions de diverses proteïnes amb inversió, la seva funció exacta encara no s'ha aclarit completament. En elrenalcèl·lules epitelials, la inversió es troba als cilis primaris, actuant com una proteïna ciliar [27]. A més, la inversió forma un complex constant amb tubulina en cultius derenalcèl·lules, i es colocalitzen in vivo [27, 28]. La inversió sembla tenir un paper essencial en la morfogènesi primerenca del sistema pronefric i en la determinació de la simetria esquerra-dreta durant el desenvolupament [29,30]. Un esdeveniment significatiu per a les vies de senyalització Wnt tant canòniques com no canòniques en el reclutament del Dvl citoplasmàtic a la membrana cel·lular. Com que les troballes anteriors van demostrar que la inversió i el Dvl es colocalitzen a les cèl·lules epitelials renals, es pot especular que la inversió també podria tenir un paper en la senyalització no canònica. La desregulació de la senyalització Wnt mediada per la inversió desencadena una proliferació aberrant als túbuls [31]. Les proves genètiques van revelar una mutació DVL-1 en pacients amb síndrome de Robinow autosòmica dominant, que presentava trastorns heterogenis en alguns pacients associats a malalties urogenitals irenalanomalies [32].
CISTANCHE MILLORARÀ LA DIÀLISI RENAL/RENAL
El patró d'expressió de desenvolupament de -tubulina, inversió i DVL-1 s'ha investigat en diferents models animals. Així, la seva expressió en pronefros de Xenopus laevis s'ha confirmat mitjançant microscòpia intravital [31], mentre que es van trobar en línies cel·lulars derivades de cèl·lules tubulars proximals murines mitjançant microscòpia confocal i espectrometria de masses [33]. A més, la microscòpia de llum i la doble immunofluorescència van revelar la seva presència en seccions de ratolinsronyons[34]. Els estudis sobre ratolins knockout per inversió van informar de quists ampliats i difusos alrenalmedul·la i còrtex associats a la inversió visceral del situs [35]. En humans, la mutació d'inversió es va presentar amb nefronoftisi infantil que va provocar la interrupció de l'embaràs [36]. Malgrat els nombrosos estudis sobrerenal-tubulina, inversió i patró d'expressió i funció DVL-1, segons el que sabem, encara no s'ha investigat un patró d'expressió d'aquestes proteïnes en el teixit humà fetal i postnatal humà i s'ha produït una correlació. A més, no s'han informat proves que considerin l'expressió d'inversió i DVL-1 en el desenvolupament humà primerenc. Per tant, aquest estudi pretenia analitzar el patró d'expressió espacial i temporal de -tubulina, inversió i DVL-1 durant les etapes fetals i postnatals de l'ésser humà sa.ronyons, així com enronyóteixits de MCDK, FSGS i CNFronyonsper tal d'establir un possible enllaç perdut entre aquestes entitats. És a dir, proposem que els patrons d'expressió alterats de les proteïnes -tubulina, inversió i DVL-1 podrien ser el procés de cistogènesi subjacent i una funció anormal dels cilis primaris que condueix a la crònica.malalties renals.
Resultats
L'anàlisi del desenvolupament i postnatalronyóteixits es va realitzar en estructures clarament diferenciades de laronyó:túbuls contornejats proximals (pct), túbuls contornejats distals (dct) i glomèruls (g). Durant les etapes de desenvolupament analitzades i en el postnatalronyóteixits, -tubulina, inversió i DVL-1 van mostrar patrons d'expressió positius però amb diferències d'intensitat, distribució i quantitat. L'anàlisi del patològicteixit renalde MCDK, FSGS i CNF es va realitzar amb el recompte complet d'imatges de les cèl·lules positives en comparació amb el control del teixit renal sa.
2.1. Microscòpia de llum, microscòpia electrònica i immunohistoquímica (-tubulina) de teixit renal humà postnatal sa i alterat patològicament
2.1.1. Llum renal postnatal saludable
microscòpia del postnatalronyóel teixit es mostra ben definitronyóestructures, amb una diferència clara entre la medul·la i l'escorça i la formació del pct, dct i g a la regió cortical. La tinció immunohistoquímica de -tubulina revela la presència d'un cili primari al centre de la superfície cel·lular apical de cada cèl·lula tubular i en 0.018% ± 0,00014% SD a la superfície de les cèl·lules glomerulars. La microscòpia electrònica mostra la presència d'un sol cili primari que sorgeix del cos basal a la superfície cel·lular apical del túbul (figura 1a).
2.1.2. CNF
La majoria dels g analitzats són més petits i lobulats (80 per cent), mentre que la minoria són de mida normal o hipertròfics (20 per cent, n=100). Es troba esclerosi segmentària o global de g, mentre que pct i dct estan parcialment dilatades i recobertes d'epiteli atròfic. Ultraestructuralment, s'observa pèrdua de microvellositats i disminució de l'alçada cel·lular amb multifragmentació dels nuclis. En els podòcits, els processos del peu es perden de manera difusa. Els cilis primaris tubulars estan desorganitzats, especialment als quists dels túbuls proximals, mostrant canvis de longitud i posició citoplasmàtica (figura 1b).
2.1.3. MCDK
Al teixit renal es poden trobar g immadurs i madurs esporàdics.Ronyóel teixit està ple de nombrosos quists ovals. Les cèl·lules epitelials columnars cobreixen els quists i estan envoltades de teixit connectiu solt. La tinció immunohistoquímica de -tubulina mostra múltiples cilis primaris llargs i desorganitzats a la superfície de les cèl·lules epitelials (figura 1c).
2.1.4. FSGS
En el 90% de g, es troba una esclerosi segmentària extensa (n=100), associada a fibrosi intersticial i signes de dany tubular. La disminució de l'alçada de les cèl·lules epitelials amb pèrdua de microvellositats es troba al microscopi electrònic, mentre que les cèl·lules endotelials i les regions mesangials tenen ultraestructura regular. Al microscopi electrònic, el cili extremadament llarg i dislocat (descentralitzat) s'observa a la superfície de la cèl·lula tubular distal (figura 1e). Els podòcits mostren una pèrdua difusa dels processos del peu amb un extens teixit de microvellositats. La tinció immunohistoquímica de a-tubulina mostra múltiples cilis primaris llargs i desorganitzats a la superfície de les cèl·lules epitelials (figura 1c).
2.2. Tinció immunohistoquímica de 心tubulina, inversió i DVL-1- i anàlisi estadística de ronyons humans postnatals en desenvolupament i sans
In the 14th, 15th and 16th gestational weeks, the ronyóEl teixit es presenta amb diferents estadis de desenvolupament de la formació de nefrones: a partir de copes metanefriques,renalles etapes de les vesícules per comandar les nefrones en forma de S, formant així la zona nefrogènica a l'escorça externa (figura 2). La diferenciació de pct, dct i g es pot observar a les regions corticals més properes a laronyómedul·la. Durant el 22 GW, parts de la medul·la i l'escorça es van fer clarament distintives, mentre que al 38 GW,ronyóles estructures apareixen com a molt diferenciades, que contenen formes madures de pct, dct i g
2.2.1. a-Tubulina
Durant el desenvolupament, la a-tubulina s'expressa fortament en tots els desenvolupamentsronyóestructures, visualitzant principalment la forma dels cilis primaris a les superfícies de les cèl·lules epitelials parietals de la càpsula de Bowman, g, pct i dct. Dinsronyóteixit, el 82-97 per cent de les cèl·lules PCt expressen a-tubulina, mentre que en dct l'expressió baixa del 99 per cent al 72 per cent en el 38è GW (vegeu la figura 3, taula 1). Entre les diferents etapes de desenvolupament, l'expressió més forta de a-tubulina es troba a la g del 16è GW.ronyons, que conté el 93 per cent de cèl·lules positives. el 14è, 15è i 22è GW (vegeu la figura 3a, b, taula 1), al voltant del 70 per cent de les cèl·lules g expressen a-tubulina, mentre que la menor expressió s'observa al 38è GW (p < 0,01)="" amb="" el="" 34="" per="" cent="" de="" les="" cèl·lules="" positives="" (figura="" 3c).="" en="" el="">ronyóteixit (1.5-anys i 7-anysronyons), la immunoreactivitat més forta a a-tubulina s'observa a la superfície cel·lular apical del pct i dct (figura 3d-f). L'expressió a-tubulina també està present al citoplasma perinuclear del dct i a les cèl·lules epitelials parietals de la càpsula de Bowman. a-tubulina les taca totrenalestructures amb una mitjana del 50 per cent de cèl·lules positives en pct, 94 per cent en dct i 85 per cent en g (figura 3f). Les taques de Dct són significativament diferents de les de PCT (p <0,0001). totes="" les="" estructures="" investigades="" tenen="" taques="" positives="" per="" a="" a-tubulina,="" amb="" un="" 77="" per="" cent="" de="" cèl·lules="" positives="" en="" pct,="" un="" 72="" per="" cent="" en="" dct="" i="" un="" 58="" per="" cent="" en="" g="">
Figura 3. Tinció d'immunofluorescència de -tubulina i DAPI en els teixits renals humans en desenvolupament i postnatals (a–e). Ronyons de 14è, 15è/16è, 38è GW (a–c);ronyonsde nens d'1.5- i 7-anys (d,e). La tinció positiva de -tubulina (fletxes) es mostra a cada estructura de l'escorça a través de les fases de desenvolupament i postnatals (a–e), túbuls contornejats proximals (pct), túbuls contornejats distals (dct) i glomèruls (g). Els detalls dels cilis primaris en pct (d) i dct (a–c, e) es mostren com a insercions de major ampliació (caixa blanca). Ampliació × 40, barra d'escala 100 µm. La distribució de cèl·lules positives de -Tubulina per estructura al llarg de les diferents etapes de desenvolupament i en el període postnatal es mostra al gràfic (f). El gràfic (g) (nombre total de cèl·lules positives per a proteïnes a les estructures observades) mostra l'expressió de proteïnes relacionada amb el temps de desenvolupament (regressió lineal) i la interrelació de -Tubulina amb DVL-1 mitjançant el desenvolupament i la maduració (ANOVA bidireccional seguida de prova posthoc de SIDAK). Les dades es mostren com a mitjana ± SD.
La distribució de les cèl·lules positives de -tubulina per estructura al llarg de les diferents etapes de desenvolupament i en el període postnatal es mostra al gràfic (f). El gràfic (g) (nombre total de cèl·lules positives per a proteïnes a les estructures observades) mostra l'expressió de proteïnes relacionada amb el temps de desenvolupament (regressió lineal) i la interrelació de -tubulina amb DVL-1 mitjançant el desenvolupament i la maduració (ANOVA bidireccional seguit de prova post hoc de Sidak). Les dades es mostren com a mitjanes ± SD.
2.2.2. Tinció d'immunofluorescència doble a inversió i tinció DVL-1 i DAPI nuclear en ronyons postnatals en desenvolupament i sans Expressió d'inversió en teixit renal en desenvolupament i postnatal
Al GW 14, 15 i 16, la inversió mostra una forta expressió granular en g i una expressió granular lleu al citoplasma de pct i dct (figura 4a, b), mentre que al 22 i 38 GW (vegeu la figura 4c), la forta s'observa una expressió positiva en g (taula 1). Entre el 14 i el 22 GW, al voltant del 50 per cent de les cel·les expressen versió. Al 16è GW, les cèl·lules PCt expressen inversió en el 73 per cent de les cèl·lules, mentre que disminueixen al 29 per cent de les cèl·lules (p <0, 05)="" al="" 38è="" gw="" (vegeu="" la="" figura="" 4f).="" l'expressió="" positiva="" de="" la="" inversió="" es="" troba="" en="" aproximadament="" el="" 80-90="" per="" cent="" de="" les="" cèl·lules="" dct="" i="" g="" del="">ronyóteixits del 14è i 16è GW, amb l'expressió més baixa en dct del 38è GW (p <{3}}.05, p=""><0, 0001,="" respectivament)="" on="" el="" 66="" per="" cent="" de="" les="" cèl·lules="" eren="" positives.="" en="" el="">ronyons, pct es taca fortament a la membrana cel·lular apical, mentre que dct es taca principalment a la membrana cel·lular basal i al citoplasma perinuclear (figura 4d, e). En aquesta etapa, vam trobar expressió d'inversió en tots els investigatsrenalestructures, incloses pct, dct i g, amb una expressió mitjana de cèl·lules positives del 92 per cent per a pct, 88 per cent per a dct i 9 0 per cent per a g (figura 4f). No vam observar una diferència significativa en la força del senyal de l'expressió d'inversió entre estructures. L'expressió més alta d'inversió es troba a g, amb una mitjana del 94 per cent de cèl·lules positives (figura 4f). Es troba una diferència significativa comparant la tinció de g (on el 94 per cent de les cèl·lules es tenyeixen positivament) amb el PCT, on el 58 per cent de les cèl·lules es tenyeixen positivament (p < 0,01)="" i="" amb="" el="" dct,="" on="" el="" 49="" per="" cent="" de="" les="" cèl·lules="" són="" positiu="" (p=""><0,0001, figura="">
Expressió DVL-1 en el teixit renal en desenvolupament i postnatal
S'observa una expressió lleu a forta de DVL{{0}} al citoplasma de pct, dct i g en el període fetal (vegeu la figura 4a–c, taula 1). En PCT, el 76–86 per cent de les cèl·lules expressen DVL-1 al 14è al 22è GW, mentre que al 38è GW, hi ha un 57 per cent de cèl·lules positives (figura 4g). A la dct del 14è i el 15è GW, el 68-70 per cent de les cèl·lules expressen DVL-1, al 16è i 22è GW, el nombre de cèl·lules positives cau a 42-5{{41} } per cent, mentre que a l'expressió GW número 38 (p < 0,001),="" s'observa="" en="" el="" 19="" per="" cent="" de="" les="" cèl·lules="" dct.="" l'expressió="" de="" dvl-1="" augmenta="" en="" g="" al="" llarg="" de="" les="" etapes="" fetals:="" al="" 14è="" gw,="" és="" del="" 6="" per="" cent,="" mentre="" que="" al="" 15è,="" 16è="" i="" 22è="" gw,="" augmenta="" fins="" al="" 10="" per="" cent="" (p="">< 0,01).="" en="" els="" 38="" gw,="" el="" 14="" per="" cent="" de="" les="" cèl·lules="" g="" expressen="" dvl-1="" (figura="" 4="" g).="" en="" el="" període="" postnatal,="" la="" immunoreactivitat="" dvl-1="" es="" dispersa="" al="" citoplasma="" (taula="" 1)="" tant="" de="" pct="" com="" de="" dct="" (figura="" 4d,="" e).="" el="" senyal="" es="" troba="" a="" totes="" les="" estructures="" investigades="" però="" sobretot="" al="" citoplasma="" perinuclear.="" la="" intensitat="" de="" l'expressió="" dvl-1="" és="" significativament="" més="" alta="" en="" pct="" en="" comparació="" amb="" dct="" i="" g="" (p=""><0,01). el="" 39-45="" per="" cent="" de="" les="" cèl·lules="" del="" pct="" i="" el="" dct="" expressen="" dvl-1,="" mentre="" que="" en="" g,="" el="" 21%="" de="" les="" cèl·lules="" són="" positives="" (figura="" 4="" g).="" no="" hem="" trobat="" una="" diferència="" significativa="" entre="" el="" percentatge="" de="" cèl·lules="" immunoreactives="" en="">renalestructures. El percentatge de cèl·lules immunoreactives DVL-1 és del 34% en PCT, 36% en dct i 27% en g, respectivament (figura 4g).
Figura 4. Tinció d'immunofluorescència doble d'inversió (verd), DVL-1 (vermell) i DAPI (blau) en els teixits renals en desenvolupament i postnatals (14-38 GW, 1.5- i {{6) }}teixits renals d'anys). La tinció positiva (fletxes) es mostra a cada estructura durant totes les fases del desenvolupament (a–c) i el període postnatal (d, e). Micròfons fusionats juntament amb estructures d'interès a l'escorça: túbuls contornejats proximals (pct), túbuls contornejats distals (dct) i glomèruls (g). La colocalització d'inversió/DVL-1 (punta de fletxa) es mostra a les microfotografies combinades. Les tincions de control negatiu es mostren com a insercions en inversió i DVL-1 (a). Els eritròcits es poden veure com a cèl·lules fortament tenyides a prop dct. Els detalls es mostren com a insercions de major ampliació. Ampliació × 40, barra d'escala 100 µm. En els gràfics (f,g) es mostra la distribució cel·lular positiva dinàmica d'inversió i DVL-1 a les estructures renals (pct, dct, g) al llarg de les etapes de desenvolupament i postnatals. El gràfic (h) mostra l'expressió de proteïnes (nombre total de cèl·lules positives a les estructures) relacionada amb el temps de desenvolupament (regressió lineal) i la interrelació de la inversió a DVL-1 mitjançant el desenvolupament i la maduració (ANOVA bidireccional seguit de la prova post hoc de Sidak). ). Les dades es mostren com a mitjanes ± SD.
La coexpressió d'inversió i DVL-1 s'observa al citoplasma del ronyó g, dct i pct durant el desenvolupament (vegeu la figura 4a-c, fusió). En el període postnatal, la coexpressió d'inversió i DVL-1 caracteritza diferents compartiments cel·lulars de cèl·lules tubulars en pct i dct, mentre que la coexpressió en g es caracteritza per la forta prevalença de l'expressió d'inversió (vegeu la figura 4d, combinació). ). En els 7-anys postnatals dels ronyons, s'observa la coexpressió d'inversió i DVL-1 a les cèl·lules tubulars de dct i pct, i en g on l'expressió d'inversió preval lleugerament en comparació amb DVL-1 (Figura 4e, fusionar).
2.2.3. Diferències en l'expressió de -tubulina, inversió i DVL-1 entre diferents estadis de desenvolupament renal i ronyons postnatals
El nombre de cèl·lules positives per a -tubulina en el percentatge de teixit renal fetal va ser estadísticament significativament més alt en comparació amb el teixit renal dels nens de 7-anys (13è (p < 0.0{)="" {11}}1),="" 15è="" (p=""><0.0001) i="" 16è="" (p=""><0,00001) gw).="" dct="" de="" les="" primeres="" etapes="" fetals="" (13è,="" 15è,="" 16è="" i="" 22è="" gw)="" tenia="" més="" cèl·lules="" positives="" en="" comparació="" amb="" el="" teixit="" renal="" dels="" nens="" de="" 38è="" gw="" i="" 1.5-anys="" (p=""><0,0001, respectivament,="" figura="" 3f).="" quan="" es="" van="" comparar="" diferents="" estadis="" de="" desenvolupament,="" vam="" trobar="" nivells="" més="" baixos="" d'expressió="" d'inversió="" en="" el="" pct="" del="" 13è="" (p=""><0,0001), el="" 15è="" (p=""><0,00001), el="" 22è="" (p=""><0,001) i="" el="" 38è="" (p=""><0,0001) gw="" en="" comparació="" amb="">renalteixit del nen d'1.5-any. A dct, es va trobar una expressió menor estadísticament significativa d'inversió comparant el teixit renal del 16è GW amb el 38è GW (p <0.0001). a="" més,="" es="" va="" observar="" una="" expressió="" més="" baixa="" d'inversió="" en="" dct="" en="" el="" teixit="" renal="" infantil="" de="" 7-anys;="" comparant="" el="" teixit="" renal="" dels="" dies="" 13="" i="" 15="" (p="">< 0,001,="" tots="" dos),="" 16="" i="" 1,5-any="" amb="" el="" dct="" del="" teixit="" renal="" d'7-anys="" (p=""><0,00001, respectivament,="" figura="" 4f).="" el="" senyal="" observat="" d'expressió="" dvl-1="" a="" través="" de="" les="" diferents="" etapes="" va="" revelar="" que="" el="" 13è="" (p="">< 0,01),="" el="" 15,="" el="" 16="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">
2.2.4. Relació entre expressions de -tubulina i inversió a DVL-1 en el teixit renal en desenvolupament i postnatal
-Les expressions de tubulina i inversió es van comparar amb l'expressió DVL-1 al llarg de les etapes de desenvolupament i al teixit renal postnatal. -tubulina tenia una expressió estadísticament més alta en totes les etapes observades, en comparació amb l'expressió de DVL-1 (p <0.001, figura="" 3g).="" a="" través="" de="" totes="" les="" etapes="" observades,="" la="" inversió="" va="" tenir="" una="" expressió="" més="" alta="" en="" comparació="" amb="" dvl="" -1="" (p=""><0, 0001,="" figura="" 4="">
2.2.5. Comparació de la tinció immunohistoquímica amb -Tubulina, versió i DVL-1- i anàlisi estadística del teixit renal alterat patològicament (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulina La diferència de tinció de -tubulina en MCDK, FSGS i CNF va ser estadísticament significativa en comparació al teixit renal postnatal sa com a grup control (p <0,0001, respectivament).="" els="" teixits="" renals="" displàstics="" tenien="" una="" expressió="" significativament="" més="" alta="" en="" comparació="" amb="" el="" grup="" control,="" mentre="" que="" fsgs="" i="" cnf="" van="" mostrar="" una="" expressió="" significativament="" menor="" de="" -tubulina="" en="" comparació="" amb="" el="" control="" sa="" (figura="">
Inversió
La inversió s'expressa al citoplasma de cèl·lules epitelials desorganitzades i túbuls de MCDK (figura 5a). A CNF, l'expressió d'inversió caracteritza g i dct, mentre que es mostra de manera menys intensa en els quists PCT (figura 5b). A FSGS, la inversió s'expressa fortament en g i dct, però de manera menys intensa en els quists PCT (figura 5c). L'expressió espacial d'inversió va mostrar una taxa de tinció més alta estadísticament significativa en teixits renals sans (figura 5g) en comparació amb MCDK, FSGS i CNF (p <{4}}, 0001,="">
Figura 5. Tinció de doble immunofluorescència d'inversió (verd), DVL-1 (vermell) i DAPI (blau) en teixits renals patològics en MCDK (a), CNF (b) i FSGS (c): túbuls (t) , glomèruls (g), quist PCT (c), l'alçada de cèl·lules epitelials PCT (*). L'estructura i la colocalització cel·lular de la inversió i DVL-1 (punts de fletxa) es mostren a les seccions combinades amb detalls en insercions d'ampliació més alta. Les tincions de control negatiu es mostren com a insercions en inversió i DVL-1 (a). Ampliació ×40, barra d'escala 10{{20}} µm. Relació de -tubulina (d) i inversió (e) amb l'expressió DVL-1 en MCDK, FSGS i CNF (ANOVA bidireccional seguit de la prova post hoc de SIDAK). La diferència en l'alçada de les cèl·lules epitelials (f) de FSGS, CNF i MCDK pct en comparació amb el control saludable (ANOVA unidireccional seguit de la prova post hoc de Tukey, n=50). La diferència en el percentatge global de cèl·lules positives de -tubulina, inversió i DVL-1 en MCDK, CNF i FSGS en comparació amb el control saludable (g–i), ANOVA unidireccional seguit de la prova post hoc de Tukey). Les dades es mostren com a mitjanes ± SD. Les diferències significatives s'indiquen mitjançant el valor p (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl{-1="" s'expressa="" molt="" suaument="" només="" en="" túbuls="" desorganitzats="" de="" mcdk,="" mentre="" que="" en="" cnf,="" la="" seva="" expressió="" caracteritza="" dct="" i="" g="" (figura="" 5a,="" b).="" a="" fsgs,="" dvl-1="" s'observa="" com="" una="" reactivitat="" lleu="" en="" g,="" dct="" i="" pct="" (figura="" 5c).="" els="" teixits="" renals="" sans="" tenyits="" de="" dvl-1="" van="" mostrar="" una="" taxa="" de="" tinció="" significativament="" més="" alta="" (figura="" 5="" h)="" en="" contrast="" amb="" mcdk="" i="" fsgs="" (p=""><0, 0001,="" tots="" dos),="" mentre="" que="" no="" es="" va="" trobar="" cap="" diferència="" significativa="" per="" a="">
2.2.6. Relació entre expressions de -tubulina i inversió a DVL-1 en teixit renal alterat patològicament (MCDK, CNF, FSGS)A MCDK, FSGS i CNF, -tubulina es tenyeix significativament més alta que DVL-1 (p <0.0001, respectivament,="" figura="" 5d).="" la="" inversió="" es="" va="" tacar="" significativament="" més="" alta="" en="" comparació="" amb="" dvl="" -1="" a="" mdck="" (p=""><0,0001) i="" a="" fsgs="" (p=""><0,01, figura="">
2.2.7. Diferències en l'alçada de les cèl·lules epitelials dels túbuls contornejats proximals entre el control saludable i el teixit renal alterat patològicament (MCDK, CNF, FSGS)Es va comparar l'alçada de les cèl·lules epitelials PCt (n {{0}} per grup) entre les cèl·lules dels túbuls en teixits renals sans i els teixits renals alterats patològicament (figura 5b, c, f). L'alçada mitjana de les cèl·lules epitelials en HC va ser de 12,91 µm ± 1,847 µm i va ser significativament més alta en comparació amb CNF i FSGS (p <0,0001, respectivament).="" l'alçada="" mitjana="" de="" les="" cèl·lules="" en="" cnf="" pct="" va="" ser="" de="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" mentre="" que="" a="" fsgs="" va="" ser="" de="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" les="" cèl·lules="" epitelials="" pct="" de="" mcdk="" no="" van="" mostrar="" canvis="" significatius="" d'alçada="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" en="" comparació="" amb="">
2.2.8. Diferències en la longitud dels cilis primaris entre el control saludable i el teixit renal alterat patològicament (MCDK, CNF, FSGS)
Es va comparar la longitud del cili primari (n=50 per grup) entre HC i teixits renals alterats patològicament (figura 6c). Els teixits renals sans i MCDK es van tenyir amb -tubulina per assegurar l'especificitat de la tinció de -tubulina cilium (figura 6a, b). En teixits renals sans, el cili primari era de 5,065 µm ± 1,229 µm de llarg, mentre que en MCDK, CNF i FSGS eren significativament més llargs (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>
Discussió
L'objectiu del nostre estudi va ser investigar una expressió immunohistoquímica d'a-tubulina, inversió i DVL-1 en fetus.renalteixit i teixit renal postnatal. A més, volíem explorar si l'expressió i el patró de tinció de la tubulina a, la inversió i el DVL-1 es veuen alterats en diferents malalties renals en comparació amb el control saludable. És a dir, malgrat l'ampli interès dels altres investigadors sobre el paper de la a-tubulina, la inversió i la DVL-1 durant el desenvolupament del ronyó, la majoria dels estudis anteriors han utilitzat animals o models experimentals in vitro. Pel que sabem, aquest és el primer estudi que havia demostrat l'expressió i la localització de la tubulina a juntament amb la inversió i la DVL-1 en ronyons humans fetals i postnatals, i que havia explorat l'expressió de les proteïnes esmentades al ronyó. malalties, com ara MCDK, FSGS i CNF. També vam analitzar els canvis en la longitud i l'aspecte dels cilis mitjançant microscòpia lluminosa i electrònica, ja que el nostre estudi anterior ja ha indicat que les alteracions ciliars poden estar associades a la cistogènesi en FSGF i CNF [19].
A la via canònica de senyalització Wnt, la unió dels lligands Wnt als receptors recluta Dvl [37]. Els processos de la MET i la via de polaritat cel·lular plana durant les primeres etapes de la morfogènesi renal estan controlats per la senyalització Wnt. Mitjançant la mediació de la via Wnt, els cilis primaris controlen la proliferació cel·lular, la diferenciació i la morfogènesi dels teixits [12] mitjançant l'organització del citoesquelet cel·lular i l'orientació cel·lular, així com l'allargament de l'estructura tubular [2,38]. En el nostre estudi, -tubulina, inversió i DVL-1 estaven presents a les estructures renals i es van colocalitzar no només durant el desenvolupament del ronyó fetal sinó també al teixit renal de l'1.5- i {{9 }}nens d'anys. Aquestes troballes estan d'acord amb l'activació de la via de senyalització Wnt que es va demostrar que ja es va produir durant la tubulogènesi [39]. A més, els nostres resultats han revelat que l'expressió de -tubulina i la inversió estan relacionades recíprocament amb DVL-1 i que mostren una diferència estadísticament significativa entre els seus patrons d'expressió. Això està en correlació amb models experimentals, ja que la mutació de la família de proteïnes Dvl completa en ratolins provoca una manca de procés de gastrulació, mentre que les mutacions que no inclouen tota la família de proteïnes mostren defectes en la col·locació dels cilis nodals juntament amb defectes d'òrgans [40] . Les troballes anteriors van suggerir que la inversió té un paper en la migració cel·lular a Xenopus pronephros. Com que aquest segment es correlaciona amb el bucle dels mamífers de Henle i els túbuls distals, això també podria indicar la importància de la inversió durant el desenvolupament del ronyó en humans [41]. D'acord amb aquesta premissa, estudis anteriors van revelar que la mutació del gen d'inversió podria donar lloc a la nefronoftisi tipus 2, que està mediada per una expressió anormal de DVL-1 [42]. Tot i que el paper del cili primari és controvertit en la regulació de la via de senyalització Wnt, vam trobar que -tubulina es colocalitzava amb inversió i DVL-1 a les mostres de ronyó analitzades. A més, estudis anteriors van assenyalar que el cili primari juntament amb la inversió regula la degradació de Dvl influint en la via de senyalització Wnt [43]. En les malalties renals humanes associades al desenvolupament de quists, s'ha observat una localització i funció anormals dels cilis primaris [19]. De la mateixa manera, el present estudi també va confirmar els canvis morfològics de la formació de cilis primaris en condicions patològiques com CNF, FSGS i MCDK. Els descobriments anteriors van reconèixer que la sobreactivació de la via canònica Wnt després del dany renal condueix a canvis estructurals irreversibles del teixit renal [44]. Per contra, el cili primari va tenir el paper de canviar de la via Wnt canònica a la no canònica per ajudarrenalreparació. A més, es va trobar que la sobreactivació de la via canònica Wnt en el teixit renal trasplantat tenia un valor predictiu positiu cap a la fibrosi renal [45]. Si la via canònica Wnt preval a costa de la no canònica, dóna suport a la teoria de la fibrosi renal com a resultat. Les nostres troballes de tubulina reduïda i expressió d'inversió en CNF i FSGS impliquen inactivitat de la via Wnt no canònica, sobretot perquè ambdues condicions tendeixen a conduir a l'etapa final.malaltia renal.És a dir, es creu que la localització i la funció normals del cili primari podrien ser un factor per mantenir una via Wnt regular i, per tant, un requisit previ per al desenvolupament normal. En canvi, si es millora la via Wnt, pot provocar una proliferació i diferenciació cel·lular desregulada que condueixi a la carcinogènesi [46]. Com s'ha descrit anteriorment, la via canònica Wnt és obligatòria per a l'inici de la MET i la formació de la nefrona, mentre que la seva pertorbació podria provocarrenalhipoplàsia [47]. Els nostres resultats donen suport a aquesta idea en revelar l'expressió més baixa de DVL-1 amb l'expressió més alta de -tubulina en MCDK en comparació amb el control saludable. Aquests resultats poden implicar l'activació més baixa de la via canònica Wnt, que podria ser una causa subjacent per a l'absència de formació de nefrones. En canvi, l'expressió de tubulina més alta amb l'expressió DVL-1 més baixa podria explicar les troballes de múltiples quists, ja que no hi ha elongació organitzada i polarització cel·lular guiada per la via Wnt no canònica. Estudis anteriors també havien demostrat que la inversió inhibeix la via de senyalització canònica de Wnt dirigint-se a Dvl per a la degradació [26]. Es va trobar que aquest pas en la seva interacció era necessari per inhibir la senyalització Wnt canònica en el manteniment de l'allargament i el posicionament tubulars normals. La mutació d'inversió provoca una regulació de la senyalització canònica de Wnt, que posteriorment va provocar una proliferació anormal a les cèl·lules tubulars. S'ha demostrat que aquest pas és crucial en la cistogènesi [42], mentre que l'eliminació de la inversió en ratolins condueix a la malaltia renal poliquística [48]. Segons la teoria derenalcistogènesi, la inversió es considera una "micoproteïna", a causa de la seva localització als cilis primaris enrenalcèl·lules tubulars. En el nostre estudi, els cilis primaris estaven presents a la superfície cel·lular apical de les cèl·lules tubulars en totes les etapes analitzades, mentre que durant les etapes fetals, l'expressió de -tubulina va ser més forta que en el període postnatal.
CISTANCHE MILLORARÀ EL DOLOR RENAL/RENAL
Estudis anteriors han demostrat que la funció dels cilis primaris es pot veure afectada per la desregulació de la tubulina durant el desenvolupament, la qual cosa pot provocar cistogènesi, desenvolupament renal anormal i possible malaltia renal crònica a la infància [31,49]. Això està d'acord amb les nostres troballes de cilis primaris escurçats i dismòrfics observats en MCDK o amb cilis múltiples i extremadament allargats o dislocats que es troben en túbuls dilatats de CNF i FSGS en comparació amb el control sa. Per donar suport al fet que les vies de senyalització Wnt canòniques i no canòniques, regulades pels cilis primaris, es consideren obligatòries per al desenvolupament normal del ronyó, hem trobat una tinció significativament més baixa d'inversió i DVL-1 en MCDK en comparació amb el control saludable. [31,49]. Les diferents dinàmiques del patró d'expressió de -tubulina, inversió i DVL-1 al llarg de diferents fases de desenvolupament renal poden indicar el canvi entre la via de senyalització Wnt canònica i no canònica durant la morfogènesi renal normal. Suggerim que el seu intercanvi determina la transcripció en la via canònica o l'ordre de la migració cel·lular i la polarització durant el desenvolupament del ronyó en una via de senyalització no canònica. El seu equilibri i expressió en totes les estructures renals investigades impliquen el seu paper important en el desenvolupament normal del ronyó. Durant el desenvolupament normal del ronyó (del 13è GW al 38è GW), l'expressió global de -tubulina, inversió i DVL-1 disminueix a mesura que el teixit renal adquireix una morfologia madura. En els teixits renals d'1.5- i 7-any, la tubulina i la inversió van mostrar un lleuger augment de l'expressió que confirma el fet que la via Wnt no canònica roman activa després del naixement. Per contra, DVL-1 persisteix amb un patró d'expressió disminuït, cosa que podria afegir a la conclusió que la via canònica Wnt està silenciada en el teixit renal sa. Com a resultat de les condicions patològiques del ronyó, les cèl·lules epitelials del ronyó podrien reaccionar amb la reaparició de l'EMT i la fibrosi [50] associades a la reactivació de la via canònica Wnt [44]. Per tant, les alteracions de la tubulina, la inversió i la DVL-1 que es troben als ronyons malalts poden ser el mecanisme patològic subjacent i el resultat del canvi de la via Wnt no canònica a la canònica al ronyó en desenvolupament que al·ludeix al canvi entre el ronyó reversible i el ronyó irreversible. dany. A més, canvis en el seu prenatal i postnatalrenalEl patró d'expressió podria estar associat amb un deteriorament de la funció renal en l'edat adulta, donant lloc a malalties congènites i insuficiència renal crònica.
4. Materials i Mètodes
4.1. Mostres humanes
Es van recollir mostres de teixit renal fetal després de la pèrdua de l'embaràs els dies 14, 15, 16, 22 i 38 GW al Departament de Ginecologia i Obstetrícia del Centre Hospitalari Universitari de Split. Tot el material fetal adquirit va ser examinat per un patòleg, i només es van utilitzar teixits sense signes d'anomalies, maceracions o mort intrauterina i amb cariograma normal. Els registres mèdics de les mares es van examinar abans de la recollida de mostres i, en cas de problemes de salut que podrien influir en el resultat de l'embaràs, els teixits renals van ser exclosos de l'estudi. La maduresa es va determinar per la circumferència del cap, la circumferència abdominal i la longitud del fèmur [51] en correlació amb els calendaris menstruals dels pacients. Es van recollir mostres de teixit renal d'1,5- i 7-any després de morts accidentals. Les mostres es van obtenir al Departament de Patologia del Centre Hospitalari Universitari de Split. Les mostres dels teixits renals displàstics multiquístics (MCDK) es van obtenir després de la pèrdua de l'embaràs, la glomeruloesclerosi segmentària focal (FSGS) i la síndrome nefròtica de tipus finlandès (CNF) a causa de la nefrectomia. Tot el material adquirit va ser examinat i avaluat per un patòleg, que va classificar els diagnòstics. El protocol d'estudi va ser aprovat pel Comitè d'Ètica de la Facultat de Medicina de la Universitat de Split (20 de maig de 2016) d'acord amb la Declaració d'Hèlsinki i les seves actualitzacions (núm. de classificació: 003-08/16-03/0001, número de registre: 2181-198-03-04-16-0024, 20 de maig de 2016) [52].
4.2. Immunohistoquímica
La fixació de la mostra de teixit recollida es va processar amb un 4% de paraformaldehid en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) durant 24 h a 22 ◦ C. Després de la deshidratació en etanol al 100 per cent, les mostres es van incrustar en parafina, tal com es va descriure anteriorment [53]. Les mostres es van tallar en seccions de 5 µm de gruix mitjançant un micròtom i posteriorment es van muntar en portaobjectes de microscopi. Per verificar la preservació del teixit, cada 10a secció es va tenyir amb hematoxilina i eosina [54]. La feminització de part i la immunohistoquímica es van realitzar tal com es va descriure anteriorment [2,55,56]. Després d'esbandir en PBS, les diapositives de microscopi es van incubar durant la nit amb anticossos primaris en una cambra humida a 22 ◦ C (sistema de tinció de diapositives StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Els anticossos primaris utilitzats van ser anticossos monoclonals anti-tubulina alfa de conill (dilució 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, Regne Unit), anticossos anti-inversió policlonal de conill (dilució 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, Regne Unit), DVL monoclonal de ratolí. Anticòs -1 (dilució 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) i anticossos policlonals anti-tubulina gamma de conill (per tal de verificar la tinció primària específica dels cilis amb alfa- tubulina, dilució 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, Regne Unit). Després d'esbandir amb PBS, es van administrar anticossos secundaris durant una hora tal com s'indica: ruc anti-conill IgG H&L, Alexa Fluor 488 (dilució 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, Regne Unit) i cabra anti-ratolí IgG H&L, TRITC (dilució). 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, Regne Unit) 4',6-diamidino-2-diclorhidrat de fenilindol (DAPI) es va utilitzar per a la tinció dels nuclis i després d'una incubació de 2-min, es va fer servir diapositives es van rentar amb PBS i es van sobreposar amb medi de muntatge i cobertors. La tinció inespecífica es va prevenir mitjançant l'ús de bloc de proteïnes (ab64226; Abcam, Cambridge, Regne Unit) abans de l'aplicació d'anticossos primaris. Com a control negatiu, es va realitzar una prova de preadsorció, mentre que es va comprovar l'especificitat dels anticossos secundaris ometent els anticossos primaris dels procediments de tinció.
4.3. Microscòpia electrònica
Fixació deronyóEls teixits es van realitzar en un 4% de paraformaldehid durant 24 h, seguit de la fixació posterior en un 1% de tetròxid d'osmi durant 1 h. El procés de deshidratació es va realitzar amb etanol sèrie i es va acabar amb la incrustació en resina LX 112 [22]. Les seccions primes d'un micròmetre es van tenyir amb blau de toluidina i es van estudiar per seleccionar seccions ultrafines. Les seccions ultrafines amb un gruix de 0,05 micròmetres es van examinar després de la tinció amb acetat d'uranil i citrat de plom. Per obtenir les microfotografies es va utilitzar el microscopi JEOL 1200 EX.
4.4. Anàlisi genètica
Com es va descriure anteriorment [19], utilitzant leucòcits de la sang perifèrica, es va extreure ADN genòmic. Es va trobar una mutació homozigota sense sentit en el gen NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg) que va confirmar el diagnòstic de síndrome nefròtica congènita de tipus finlandès (CNF) [57].
CISTANCHE MILLORARÀ LA INFECCIÓ RENAL/RENAL
4.5. Anàlisi de dades
L'anàlisi de la secció es va realitzar en un microscopi de fluorescència FL mitjançant 3 canals de fluorescència FL (Olympus BX51, Tòquio, Japó). Les imatges van ser capturades per la càmera digital DP71 (Olympus, Tòquio, Japó) amb un augment d'alta potència (×40). Només elrenalL'escorça que contenia túbuls contornejats proximals (pct), túbuls contornejats distals (dct) i glomèruls (g) van ser d'interès. Les imatges van ser processades pel programari ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, Instituts Nacionals de Salut dels EUA, Bethesda, MD, EUA, https://imagej.nih.gov/ij/ (accedit el 15 d'octubre de 2018), 1997–2021. ) i Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Califòrnia, EUA) per a una avaluació posterior. Abans del recompte de cèl·lules, es va utilitzar l'eina ImageJ de canals dividits. Després, la foto microscòpica d'immunofluorescència original es va restar pel canal vermell o verd (segons quin era el canal original) mitjançant l'eina de calculadora d'imatges ImageJ per evitar la fuita del senyal. Els valors per sota del nivell llindar 50 es van considerar negatius. Hem comptat els senyals immunoreactius en cèl·lules d'almenys 20 estructures (pct, dct o g) per etapa o nombre global positiu de cèl·lules per microfoto de displàstic multiquístic.ronyóteixit, FSGS i CNF. Vam classificar les cèl·lules com a positives si el senyal d'immunofluorescència s'acumulava a qualsevol nivell de la membrana, el citoplasma o el nucli per sobre del valor 50 mesurat al programari ImageJ mitjançant l'ordre de llindar. Les cèl·lules negatives es van classificar com a cèl·lules amb l'absència de cap immunoreactivitat. Dos investigadors independents van analitzar les dades.
4.6. Anàlisi semiquantitativa
La intensitat del senyal de tinció de -tubulina, inversió i DVL-1 va ser avaluada per dos investigadors independents mitjançant el programari ImageJ. La intensitat global del senyal es va mesurar després que la imatge s'hagi configurat en tipus 8-bit; després, es va avaluar la intensitat de la tinció del marcador en 20 pct, dct i g mesurant l'àrea delineada de l'estructura. Si els resultats entre els avaluadors eren diferents, un tercer investigador independent va aclarir el dubte. La intensitat màxima del senyal per a -tubulina va ser de 84,125 ± 3,214 SD, per a la inversió de 71,50 ± 2,715 SD i per a DVL-1 80,916 ± 1,875 SD. La saturació més alta del color del senyal a les fotografies del microscopi es va marcar com a 3 (66,66-99,99 per cent de la intensitat total de la imatge del senyal), seguida de 2 (33,33-66,66 per cent) per a la intensitat intermèdia del senyal i 1 (0,33 per cent -33,33 per cent) per a baixa intensitat del senyal (taula 1.).
4.7. Anàlisi estadística
Per a la determinació de les diferències entre etapes i estructures, es va fer la prova Kruskal–Wallis, seguida de la post hoc de Dunn amb el programari GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego Califòrnia, EUA, www.graphpad.com (consultat el 15 d'octubre). 2018.)). El nombre de cèl·lules positives es va expressar en percentatge com a valor mitjà ± desviació estàndard (SD), mentre que la significació estadística es va reconèixer a p <0, 05.="" el="" nombre="" d'estructures="" analitzades="" va="" ser="" de="" 4200="" en="" 35="" mostres,="" amb="" un="" nombre="" total="" de="" 135.256="" cèl·lules="" comptades.="" hem="" utilitzat="" 2-way="" anova="" amb="" la="" prova="" post="" hoc="" de="" sidak="" per="" provar="" les="" diferències="" en="" l'expressió="" de="" -tubulina,="" inversió="" i="" dvl-1="" en="" diferents="" etapes="" de="" desenvolupament.="" per="" estudiar="" l'expressió="" de="" proteïnes="" pel="" que="" fa="" al="" temps="" de="" desenvolupament,="" hem="" utilitzat="" la="" regressió="" lineal.="" es="" va="" utilitzar="" l'anova="" unidireccional="" seguit="" de="" la="" prova="" post="" hoc="" de="" tukey="" per="" explorar="" les="" diferències="" en="" l'expressió="" de="" -tubulina,="" inversió="" i="" dvl-1="" en="">ronyóteixit en comparació amb teixits de MCDK, FSGS i CNF. Les diferències en l'expressió de proteïnes entre MCDK, FSGS i CNF es van investigar amb 2-way ANOVA seguit de la prova post hoc de Sidak. Es va utilitzar l'ANOVA unidireccional seguida de la prova post hoc de Tukey per avaluar les diferències en la longitud dels cilis i l'alçada de les cèl·lules epitelials del PCT entre el control sa i el patològic.ronyóteixits. Les dades es van mostrar com a valor mitjà ± desviació estàndard (SD) amb la diferència estadística reconeguda a p <>