Els extractes de flors com a colorants multifuncionals a la indústria cosmètica Part 2

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

Molts productes naturals s'utilitzen en els sistemes mèdics tradicionals per tractar l'alleujament dels símptomes del dolor i la inflamació, [61] Per tant, es va investigar l'efecte dels extractes analitzats sobre la inhibició de l'activitat de la lipoxigenasa i la proteïnasa. En el rang de concentracions analitzades (100-500 ug/mL), l'extracte d'aigua CTE va mostrar la capacitat més forta per inhibir la proteïnasa (figura 4) (al 57 per cent per a una concentració de 500 ug/mL). Aquesta activitat es va comparar amb el conegut inhibidor de la proteinasa diclofenac, utilitzat com a control (al voltant del 89 per cent d'inhibició a la concentració més alta provada). Tanmateix, es van obtenir resultats similars per a l'extracte de GGE i KTE (al voltant del 56 per cent i el 53 per cent, respectivament, per a les concentracions més altes). Es va observar una menor inhibició de la proteinasa per als extractes PRE i PGE. En una prova addicional que mesura la capacitat d'inhibir la lipoxigenasa, els extractes aquosos de KTE i CTE mostren els valors més alts (al voltant del 67 per cent i el 64 per cent d'inhibició, respectivament, per a una concentració de 500 ug/mL). També es va utilitzar diclofenac com a control. Els extractes de GGE, PGE i PRE també presenten valors significativament elevats (60 per cent, 57 per cent i 54 per cent, respectivament). També es va observar que la capacitat d'inhibir els enzims LOX i proteïnases depèn de la concentració d'extracte (figura 5).

Estudis anteriors van indicar que molts compostos polifenòlics van contribuir significativament a les activitats antiinflamatòries de molts extractes de plantes[62]. Els estudis han demostrat la implicació de les ROS en el procés inflamatori, i els compostos fenòlics com l'àcid gàl·lic i quínic poden bloquejar el metabolisme de l'àcid araquidònic inhibint l'activitat de l'activitat de la lipoxigenasa, o poden servir com a eliminadors de radicals lliures reactius, que es produeixen durant l'àcid araquidònic. [63]. Els resultats obtinguts per BenSaad et al. indiquen que l'àcid elàgic, l'àcid gàl·lic i la punicalagina A&B aïllats de P. granatum van inhibir la producció d'òxid nítric (NO), prostaglandina E2 (PGE2) i interleucina 6 (IL-6) en lipopolisacàrids (LPS) induïts. RAW 267,4 macròfags. Si aquests compostos funcionen com a únics agents o tenen un efecte sinèrgic encara segueix sent una qüestió [64]. Com que molts flavonoides mostren propietats antiinflamatòries, a causa del seu comportament antioxidant intrínsec, han estat implicats en diversos trastorns inflamatoris.Mètode d'extracció de flavonoides pdf,En particular, la quercetina és la molècula més interessant perquè interfereix amb vies biològiques específiques. A més, els estudis suggereixen que pot reduir el procés inflamatori implicat en diversos models mitjançant diferents mecanismes[65]. En particular, la proteïna quinasa activada per AMP i la via histona/proteïna desacetilasa (AMPK/SIRT1) donen lloc a una gestió de la inflamació més interessant. Així, els activadors AMPK poden reduir la inflamació dels macròfags. La quercetina i altres flavonoides, com a activadors d'AMPK i SIRT1, poden reduir la inflamació interferint amb aquesta via [66]. També s'ha demostrat que la quercetina i els monoglucòsids de quercetina exerceixen un potencial d'inhibició de LOX més alt [67]Nair et al. han demostrat propietats antiinflamatòries de l'extracte de KTE avaluant la presència de flavonols amb la part de quercetina com la manghaslin Qu 3-[2G] ramnosilrutinósida, Qu 3-O-dirhamnòsid i rutina. Aquestes molècules han demostrat una forta inhibició de l'activitat de la COX-2 i la supressió parcial de ROS. En general, els polifenols presents a CTE van mostrar propietats antiinflamatòries en la inflamació induïda per LPS a les cèl·lules de macròfags RAW 264.7 [68].

Feu clic aquí per saber-ne més

2.5.Avaluació de citotoxicitat

En la creació de noves matèries primeres cosmètiques, una de les propietats més importants és la seva seguretat d'ús. Les substàncies destinades al seu ús en cosmètica han de ser no tòxiques, especialment en relació amb les cèl·lules de la pell, com els queratinòcits i els fibroblasts. S'han utilitzat dos tipus de proves per determinar la toxicitat dels extractes analitzats sobre cèl·lules HaCaT i BJ.flavonoidesEl primer estudi, mitjançant l'assaig d'absorció de vermell neutre, ens permet avaluar la viabilitat de les cèl·lules tractades amb els extractes analitzats. Aquest colorant entra als lisosomes d'una cèl·lula viva i s'allibera al citoplasma de les cèl·lules mortes. Es va observar (figura 6) que l'extracte CTE té la capacitat més alta per augmentar la proliferació tant de les cèl·lules HaCaT com de les BJ. En comparació amb el control, aquest extracte va aconseguir uns valors aproximadament un 20 i un 40 per cent més alts que el paràmetre provat a la concentració de 250 μL/mL (HaCaT i B】) i 500 μL/mL (cèl·lules BJ), respectivament. L'extracte GGE a concentracions de 100 i 250 μL/mL i l'extracte KTE a la concentració de 500 μL/mL es van caracteritzar per un petit efecte tòxic sobre les cèl·lules BJ. Altres extractes van tenir una influència positiva en la viabilitat d'aquestes cèl·lules. Els extractes de PRE i PGE a una concentració de 100 μL/mL no difereixen significativament del control i van augmentar la proliferació de cèl·lules BJ en un 10-15 per cent en comparació amb el control a la concentració de 250 i 500 μL/ mL. En el cas dels queratinòcits, no es va observar cap disminució de la viabilitat cel·lular. Per als extractes de PGE, PRE i CTE, es va observar un augment de la proliferació amb l'augment de la concentració, mentre que es va demostrar una disminució de la viabilitat cel·lular amb l'augment de la concentració dels extractes de KTE i GGE.

La segona prova realitzada per determinar la citotoxicitat dels extractes provats va ser la prova de resazurina (Alamar Blue). S'ha demostrat (Figura 7) que la viabilitat de les cèl·lules depèn de la concentració de l'extracte amb el qual s'incuben les cèl·lules. En el cas dels fibroblasts, els extractes PRE, PGE i CTE provoquen una major proliferació cel·lular amb un augment de la seva concentració. A la concentració analitzada més alta (500 μL/mL), es va observar una proliferació aproximadament un 20 per cent més alta en comparació amb el control.usos de l'hesperidinaEn el cas dels extractes de KTE i GGE, es va observar una disminució de la viabilitat cel·lular amb un augment de la concentració d'extractes. Aquests extractes van mostrar un petit efecte tòxic sobre BJ a concentracions de 250 i 500 μL/mL. En el cas dels queratinòcits, es va observar un efecte similar dels extractes analitzats sobre les cèl·lules de la pell, però la seva capacitat de proliferació no va ser tan forta com en el cas dels fibroblasts. La capacitat més alta d'augmentar la proliferació de queratinòcits es va observar per a l'extracte de CTE en tot el rang de concentracions analitzades. Es van obtenir valors similars per a l'extracte PRE a una concentració de 250 μL/mL i per a l'extracte PGE a una concentració de 500 μL/mL. L'extracte de KTE va mostrar un efecte tòxic significativament més gran sobre les cèl·lules HaCa que l'extracte de GGE.

Els extractes analitzats no s'han provat àmpliament abans de la seva toxicitat per a les cèl·lules de la pell. Només hi ha pocs estudis de citotoxicitat sobre extractes o els seus principals ingredients actius, especialment cap a cèl·lules cancerígenes. Els autors d'estudis anteriors van indicar que aquests extractes generalment no tenen un efecte tòxic sobre les cèl·lules de la pell i que la seva capacitat d'augmentar la proliferació cel·lular s'atribueix sovint a l'alt contingut de polifenols, antocianines i flavonoides [45,69-73 ]. Alguns autors també van indicar que els components individuals continguts en els extractes poden presentar un efecte tòxic sobre les cèl·lules de la pell, mentre que l'extracte en conjunt no. Ali Hijazi et al. [69] van demostrar que els alcaloides extrets de Punica granatum són tòxics per a les línies cel·lulars normals i cancerígenes, mentre que tot l'extracte és menys tòxic. L'estudi de Nasiri et al. [70] indica que l'extracte de flor de Punica granatum pot ser útil per accelerar el procés de cicatrització de ferides a causa de la seva capacitat per augmentar la proliferació de cèl·lules de la pell. En la nostra investigació anterior [45], es va demostrar que els extractes aigua-etanòlics obtinguts de les plantes analitzades es caracteritzaven per una major capacitat per augmentar la proliferació de cèl·lules BJ, i els extractes de KTE i GGE mostraven un menor efecte tòxic sobre aquestes cèl·lules. .cistanche de l'imperi perdutL'efecte dels extractes d'aigua-etanol sobre les cèl·lules HaCaT va ser similar al dels extractes aquosos purs, però en el cas dels extractes obtinguts amb etanol, es van observar propietats de proliferació lleugerament més favorables que en el cas dels extractes aquosos. Les diferències entre la composició d'ambdós tipus d'extractes analitzats poden provocar diferències en la seva toxicitat. Com es mostra, els extractes d'aigua no són tan rics en ingredients bioactius com els extractes d'aigua-etanol. Les diferències més grans s'observen en el contingut de rutina i isoquercitrina.

Cistanche pot anti-envelliment

2.6.Determinació del Factor de Protecció Solar

Els efectes desfavorables de la radiació UV a la pell es poden revelar tant poc després de l'exposició com fins i tot anys després. La radiació solar té un efecte immunosupressor que accelera el procés d'envelliment de la pell amb totes les conseqüències associades, inclosa l'augment de la carcinogènesi[74]. Les tendències que s'observen actualment indiquen una necessitat creixent de desenvolupar productes caracteritzats no només per un alt nivell de seguretat en l'ús sinó també per la multifuncionalitat, en el sentit que els productes comptaran amb la protecció anti-radiació de la pell amb un àmbit d'acció més ampli que el que s'utilitza fins ara. Algunes substàncies vegetals tenen un paper inestimable en aquest aspecte, que és capaç no només de proporcionar protecció solar sinó també de neutralitzar els efectes negatius ja existents de la radiació solar a la pell [75-77]. La investigació realitzada va demostrar que els extractes de plantes analitzats PRE, PGE, KTE, CTE i GGE es caracteritzen per alts coeficients SPF.

L'anàlisi dels coeficients (SPF) es va realitzar per als extractes d'aigua obtinguts de les plantes esmentades a concentracions de 10 i 50 mg/mL. Per a cada planta investigada, una concentració més alta de l'extracte va donar lloc a un valor de SPF significativament més alt.fracció de flavonoides purificada micronitzada 1000 mg utilitzaLa comparació entre extractes mostra que es van observar els valors més alts de l'SPF per a l'extracte de KTE, que és vàlid per a ambdues concentracions investigades. Una altra observació interessant és que fins i tot a les concentracions més baixes de les investigades, l'extracte de KTE encara presentava un SPF elevat, mentre que els valors d'altres extractes van disminuir notablement. Això queda clar quan analitzem fins a quin punt el resultat de KTE va ser superior al d'altres extractes. Per a la concentració de 50 mg/mL, el SPF va ser més gran en un factor d'1,2 (en comparació amb PGE, CTE) fins al factor de gairebé 1,9 (en comparació amb PRE, GE). El mateix càlcul per a la concentració de 10 mg/mL donarà factors des d'1,4 (en comparació amb PGE) fins a factors del rang 2-3 (en comparació amb CTE, GGE), fins i tot fins a factors com 10 en comparació amb PRE. En centrar-se en l'extracte de KTE, es pot notar que una disminució de la concentració de l'extracte en un factor 5 (des d'un valor de 50 mg/mL fins al valor de 10 mL/mL) provoca una disminució del valor SPF per un factor 3,4. , el que significa que el SPF disminueix més lentament que la concentració. L'anterior mostra que l'extracte de KTE pot ser eficient fins i tot quan s'aplica en concentracions baixes (figura 8).

2.7. Mesures de pèrdua d'aigua transepidèrmica (TEWL) i hidratació de la pell

A causa de l'ampli ventall d'activitats biològica i farmacològica de les matèries primeres vegetals, les substàncies vegetals contingudes en els extractes tenen un impacte significatiu en l'estat de la pell. En particular, estem parlant aquí de la influència dels metabòlits secundaris en l'estat de la nostra pell [78,79].

En la següent etapa de la investigació es van realitzar les anàlisis d'hidratació i TEWL. Es va avaluar l'efecte dels extractes provats sobre la pell. Les mesures es van fer a intervals de dos temps de 60 i 360 min per a la concentració d'extracte de 10 mg/ml. Per a la mesura de TEWL, la major disminució percentual es va mostrar per a l'extracte de PGE, on el valor de control de 13,9 va caure a 8,71, donant lloc a una disminució percentual del 37 per cent. També val la pena analitzar l'extracte KTE des d'aquesta perspectiva, ja que aquest va ser el que presentava els valors SPF més alts. Per a l'extracte KTE, el valor de control TEWL va disminuir fins al valor de 10,22, el que significa una disminució del 26 per cent (figura 9A).

Tanmateix, en el cas de la segona mesura de l'instrument, es va demostrar que els extractes analitzats provoquen un augment de la humitat en relació a la mostra de control, tant després dels 60 com després dels 360 min.

Com a resultat de les anàlisis, es va trobar que els extractes analitzats de PRE, PGE, KTE, CTE i GGE augmenten la hidratació de la pell (figura 9B). Es va observar un augment de les propietats hidratants juntament amb un augment de la concentració de l'extracte en els preparats. Les propietats hidratants més fortes s'han observat per als extractes PRE i PGE que equivalen al 32 per cent i al 29 per cent després de 60 min i equivalen al 21 per cent i al 22 per cent després de 360 ​​min. Tanmateix, s'ha trobat el nivell més baix d'hidratació de la pell per a l'extracte de KTE que equival al 18 per cent després de 60 min i prop del 3 per cent després de 360 ​​min.

2.8. Anàlisi de l'aplicació

2.8.1. Determinació dels paràmetres de color dels extractes

A causa del seu color natural, els ingredients actius de les flors vegetals es poden utilitzar com a colorants naturals en molts productes comercials, com ara cosmètics i aliments. Es va realitzar una anàlisi del color dels extractes obtinguts (taula 5).

Es va trobar que els extractes PRE, KTE i CTE tenen el potencial més alt com a pigments cosmètics naturals. Tanmateix, es van observar els valors de croma més alts (C*) per a CTE. A partir del valor del paràmetre de grau h, es va comprovar que és el color groc d'aquest extracte el que s'observa i és visible a ull nu. En el cas dels extractes de KTE i PRE, malgrat el valor C* baix (2,8), el color d'aquests extractes es pot veure clarament a ull nu i es va especificar com a vermell-violet per a PRE i blau-violeta per a l'extracte de KTE. Els extractes d'aigua de PGE i GGE eren de color vermellós i lleugerament ataronjat, i els valors de croma obtinguts estaven al nivell d'1,3. Per a aquest color, aquests valors no eren significativament perceptibles a simple vista.

2.8.2. Determinació dels paràmetres de color dels cosmètics a partir dels extractes

En els darrers anys, hi ha hagut una forta necessitat de desenvolupar nous colorants d'origen natural, especialment en la indústria alimentària i cosmètica. En comparació amb els colorants obtinguts sintèticament, poden tenir un menor impacte negatiu sobre la salut humana i el medi ambient [80]. Els extractes obtinguts es van utilitzar en la formulació d'un líquid desmaquillant micel·lar model. En cada formulació, es van utilitzar en una concentració de l'1 per cent. Els resultats dels paràmetres de color dels cosmètics model es presenten a la taula 6.

Es va observar que l'addició d'extractes d'aigua a l'1 per cent de PRE, PGE, CTE i GGE va influir significativament en el color del desmaquillant. Cada mostra era clarament visible a ull nu en color. L'extracte PRE va canviar el color del cosmètic a taronja, i l'extracte PGE, CTE i GGE el van canviar a groc.

La possibilitat d'utilitzar els extractes analitzats com a colorants potencials es confirma pels valors relativament elevats de △Desmaquillant amb extracte/desmaquillant base, que indica un canvi significatiu en el color dels cosmètics model amb l'addició de l'extracte en comparació. a la mostra base (sense afegir els extractes). Les dades de la literatura [73] mostren que si els valors d'AE són superiors a 5, el color és percebut per la vigília nua i percebut com un efecte de color. Per als desmaquillants que contenen extractes PRE, KTE i CTE, es van obtenir els valors AE de 8,83, 9,17 i 8,14, respectivament. En el cas dels productes amb extractes de PGE i GGE, no es va observar cap influència significativa en l'extracte sobre el color de la preparació. Els valors d'AE estan en l'interval de 2.51-2.82. Això significa que la diferència de color només és perceptible per a un observador experimentat [80, 81].

3. Materials i Mètodes

3.1. Material vegetal i procediment d'extracció

El material vegetal utilitzat en la investigació van ser flors seques de P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. i G.globosa L., que s'obtenien de la botiga d'herbes local. . El procés d'extracció es va realitzar en un bany d'ultrasons (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berlín, Alemanya), que es va dur a terme mitjançant el mètode descrit per Yang et al.[82]. Es van utilitzar 10 grams de flors seques i 100 g d'aigua per preparar extractes d'aigua de les plantes provades. El procés es va dur a terme durant 20 minuts a temperatura ambient. A continuació, els extractes obtinguts es van recollir i es van filtrar tres vegades a través de paper de filtre Whatman No. 1. Després de la filtració, els extractes es van evaporar a pressió reduïda a 40 graus. Es va preparar una solució de reserva a la concentració de 100 mg/ml a partir dels extractes secs i es va emmagatzemar a la foscor a 4 graus fins a una anàlisi posterior. S'utilitzen les següents abreviatures: PRE—Extracte de Papaver rhoeas, PGE—Extracte de Punica granatum, GGE—Extracte de Gomphrena globosa, CTE—Extracte de Carthamus tinctorius, KTE—Extracte de Clitoria ternatea.

3.2. Determinació de compostos bioactius per HPLC-UV-ESI-MS

Els extractes obtinguts es van analitzar per determinar els seus principals compostos bioactius mitjançant un HPLC (DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, EUA), acoblat amb un espectròmetre de masses (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Canadà), equipat amb una font d'ionització per electrospray (ESI) i una massa trampa d'ions quadripols triple analitzador. La separació cromatogràfica es va aconseguir amb un sistema de fase inversa de gradient. A més, es va comprar a Phenomenex una columna cromatogràfica de 100 × 4,6 mm Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A amb cadenes laterals d'isobutil i amb una fase estacionària de tapa final TMS utilitzada amb una columna de protecció de composició similar i es va mantenir a 30 graus. . Es va utilitzar un sistema de dissolvent binari que comprenia un 0,1 per cent (o / v) d'àcid fòrmic aquós com a dissolvent A i metanol com a dissolvent B es va utilitzar en mode gradient durant 19,1 min del temps d'execució. Les condicions d'elució aplicades van ser les següents: 0,0-15,0 min 25-100 per cent B,15.0-17,0 min 100 per cent B,17.0-17,1 min 100-25 per cent B,17.1-19.1 min 25 per cent B. El cabal de la fase mòbil era de 0,6 ml/min i el volum d'injecció era de 10 μL. L'eluent es va controlar mitjançant un espectròmetre de masses d'ions electrospray (ESI-MS) en mode d'ions negatius i es va escanejar des de m/z 20 fins a 1000 Da. Per a l'anàlisi de quantificació, el detector de triple quadripol MS funcionava en mode d'exploració de monitorització de reaccions múltiples (MRM). Es van determinar experimentalment les condicions òptimes de l'analitzador de massa i la selecció d'ions de producte per a compostos individuals. Amb aquesta finalitat, es van introduir solucions estàndard de compostos investigats (1 ng/mL) en la composició de la fase mòbil mitjançant una bomba d'infusió que funcionava amb lliurament constant de mostres. Després d'assegurar-se que es va seleccionar l'ió precursor correcte, es van optimitzar el potencial de desclustering (DP), el potencial d'entrada (EP), el potencial de sortida de la cel·la de col·lisió (CXP) i l'energia de col·lisió (CE) per a cada transició MRM (taula S1). Es van controlar dues transicions MRM, una per a la quantificació i una altra per a la confirmació. Els paràmetres MS es van establir de la següent manera: temperatura capil·lar de 600 C, gas de cortina a 35 psi, gas nebulitzador a 60 psi i gas d'assecat a 50 psi. Es va aplicar la tensió de font en mode d'ionització negativa -4500 V per a la determinació de compostos bioactius. El nitrogen es va utilitzar com a gas de cortina i col·lisió. L'anàlisi de dades es va processar amb el programari Analyst 1.5.1. La identificació dels compostos seleccionats es va fer mitjançant la massa molecular i el fragment d'entrades d'anions de cada compost individual i es va confirmar mitjançant la fragmentació MS2. Es van determinar les identitats de nou compostos juntament amb la seva fórmula química, els ions moleculars desprotonats i els ions de fragments característics per a cada pic individual. Es van quantificar sis compostos a partir de la corba de calibratge generada mitjançant àrees pics de les transicions MRM més intenses dels estàndards analítics. La linealitat de la resposta del detector per a compostos quantificats es va demostrar mitjançant la injecció d'estàndards de calibratge a vuit nivells de concentració que van des de 0,01 ug/ml fins a 2ug/ml. Les corbes de calibratge eren lineals amb els coeficients de correlació (R) superiors a 0,99. En cas que les mostres no caiguessin en el rang lineal del detector CMS, les mostres es van diluir.

Els estàndards analítics d'àcid quínic, àcid gàl·lic, àcid cafeic, àcids cafeoilquínics (CQA, dos isòmers:3- i 5-CQA) i quercetina es van comprar a Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA ). Tots els estàndards utilitzats eren de grau analític (2 superior o igual al 99 per cent de puresa).

Es van preparar solucions estàndard pesant i dissolent amb precisió 20 mg de cada estàndard en 10 mL de metanol de grau LC-MS per donar una concentració de 2 mg/mL. Dilucions en sèrie de 2,{{1{0}} ug/mL, 1,5 ug/mL, 1,0 ug/mL, 0,5 ug/mL,0 A continuació, es van fer 0,1 ug/mL, 0,05 ug/mL, 0,02 ug/mL i 0,01 ug/mL amb una solució de metanol de grau LC-MS. El límit de quantificació (LOQ) es va definir com a 0,01 ug/ml.

L'assaig LC-MS/MS es va realitzar per triplicat. Les dades obtingudes es van presentar com a mitjanes ± desviacions estàndard.

3.3. Determinació de propietats antioxidants

3.3.1.ABTS· més Assaig d'eliminació

Primer, es va preparar la solució ABTS barrejant 19, 5 mg d'ABTS i 3, 3 mg de persulfat de potassi amb 7 ml de tampó fosfat (pH =7.4) i es va dissoldre durant 16 h a la foscor. Aleshores, la solució es va diluir fins a l'absorbància a un nivell d'aproximadament 1.0. Les absorbances es van mesurar a la longitud d'ona 入=734 nm. A continuació, es van barrejar 20 mL d'extractes de KTE, PGE, PRE, CTE i GGE (10.100.250.500 ug/mL) amb 980 mL de solució ABTSe ​​més diluïda i després es van incubar durant 10 min a la foscor. En el següent pas, es va mesurar l'absorbància de les mostres preparades a 入=734 nm mitjançant un espectrofotòmetre UV/VIS Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). L'aigua destil·lada es va utilitzar com a blanc. L'ABTS més l'eliminació es va calcular a partir de l'equació (1):

on: As—absorbància de la mostra; Ac: absorbència de la mostra de control. Les mesures es van realitzar per triplicat per a cada mostra extreta. El procediment va ser descrit per Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2.Assaig d'eliminació de radicals DPPH

La capacitat dels extractes per eliminar els radicals lliures es va dur a terme mitjançant el mètode descrit per Brand-Williams et al. [84]. Es basa en l'ús del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil （DPPH）. En primer lloc, es van barrejar 33 μL de solucions aquoses d'extractes a concentracions de 100 ug/mL amb 167 μL de solució de metanol de DPPH (4 mM) i es van transferir a una placa de 96-pou, després es van barrejar agitant. Després, es va mesurar l'absorbància de les mostres a una longitud d'ona de 517 nm. Les mesures es van fer cada 5 minuts durant 30 minuts en un espectrofotòmetre UV-VIS Filter Max入=5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Es van realitzar tres rèpliques independents per a cada extracte. Es va utilitzar aigua amb una solució de DPPH com a control. La capacitat antioxidant es va expressar com a percentatge d'inhibició de DPPH mitjançant l'equació (2):

on: As—absorbància de la mostra; Ac: absorbència de la mostra de control. Les mesures es van realitzar per triplicat per a cada mostra extreta.

3.3.3.Detecció de nivells intracel·lulars d'espècies reactives d'oxigen (ROS)

Per determinar la capacitat dels extractes analitzats per generar la producció intracel·lular d'espècies reactives d'oxigen en cèl·lules HaCaT i BJ, es va utilitzar un colorant fluorogènic H, DCFDA. Aquest compost té la capacitat d'entrar a les cèl·lules per difusió passiva, on és desacetilat per esterases intracel·lulars a un compost no fluorescent. Si a la cèl·lula hi ha espècies reactives d'oxigen, aquest compost es transforma en DCF altament fluorescent. Per determinar el nivell intracel·lular de ROS en HaCaTs i BJ, les cèl·lules es van sembrar en plaques de 96-pous. A continuació, es van cultivar cèl·lules en una incubadora durant 24 h. El medi DMEM es va eliminar i es va substituir per 10 μM H2DCFDA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) dissolt en medi DMEM sense sèrum. Les cèl·lules HaCaT i BJ es van incubar a H, DCFDA durant 45 min i després es van incubar amb els extractes a les concentracions∶ de 100, 250 i 500 ug/mL. Les cèl·lules tractades amb peròxid d'hidrogen (H2O2) 1 mM es van utilitzar com a controls positius. Les mostres de control eren cèl·lules no tractades amb els extractes provats. La fluorescència DCF es va mesurar cada 90 min mitjançant un lector de microplaques FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific) a una excitació màxima de 485 nm i espectres d'emissió de 530 nm [85].

3.4. Avaluació de la inhibició de les metalopeptidases de matriu

3.4.1.Determinació de l'activitat antielastasa

Per determinar la possibilitat d'inhibir la metaloproteinasa de la matriu, l'elastasa dels neutròfils (NE), es va aplicar un kit fluoromètric (Abcam, ab118971). La prova es va dur a terme d'acord amb les instruccions adjuntes al kit i amb el procediment descrit per Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Les anàlisis es van realitzar en una placa de pou 96-estàndard amb un fons pla clar. Per a l'anàlisi es van utilitzar extractes de plantes en una concentració de 100 i 250 ug/mL. Inicialment, es van preparar solucions enzimàtiques NE, un substrat NE i un control inhibidor (SPCK) segons les instruccions. Es va afegir una solució de NE diluïda a tots els pous i després es van afegir mostres de prova, el control inhibidor i el control enzimàtic (Assay Buffer) als pous posteriors. Després, les mostres es van barrejar i es van incubar a 37 graus durant 5 minuts. Mentrestant, es va preparar una barreja de reacció barrejant el tampó d'assaig i el substrat NE. La barreja es va afegir a cada pou i es va barrejar bé. La fluorescència es va mesurar immediatament a la longitud d'ona d'excitació 入{=400 nm i l'emissió 入=505 nm mitjançant un lector de microplaques (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) La capacitat d'inhibir l'activitat NE de l'anàlisi analitzat les mostres es van calcular a partir de l'equació (3):

El resultat final va ser la mitjana aritmètica de tres mesures independents.

3.4.2. Determinació de l'activitat anti-col·lagenasa

Per avaluar la capacitat dels extractes obtinguts per inhibir l'activitat de la col·lagenasa, es va aplicar un kit fluoromètric (Abcam, Cambridge, UK, ab211108). La prova es va dur a terme d'acord amb les instruccions adjuntes al kit i amb el procediment descrit per Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Les anàlisis es van realitzar en una placa de pou 96-estàndard amb un fons pla clar. Per a l'anàlisi es van utilitzar extractes de plantes en una concentració de 100 i 250 ug/mL. Primer, la col·lagenasa (COL) es va dissoldre en un tampó d'anàlisi de col·lagenasa (CAB). A continuació, les mostres analitzades es van afegir a COL i CAB. Les mostres de control d'inhibidors es van preparar barrejant l'inhibidor de col·lagenasa (1,10-fenantrolina (80 mM) amb col·lagenasa i tampó CAB. Es van preparar pous de control enzimàtic barrejant COL diluït amb CAB. El tampó CAB es va utilitzar com a control de fons. Després, les mostres es van incubar a temperatura ambient durant 15 min.Es va preparar una mescla de reacció barrejant el substrat de col·lagenasa amb CAB.La mescla de reacció preparada d'aquesta manera es va afegir a totes les mostres analitzades i es va barrejar a fons. Després es va mesurar la fluorescència a un longitud d'ona d'excitació de 490 nm i emissió de 520 nm La mesura es va realitzar en mode cinètic durant 60 min a 37 C. La capacitat d'inhibir l'activitat COL dels extractes obtinguts es va calcular mitjançant l'equació (4):

3.5. Determinació de propietats antiinflamatòries

3.5.1. Inhibició de la desnaturalització de proteïnes

L'activitat inhibidora de la proteinasa dels extractes PRE, PGE, KTE, CTE i GGE es va realitzar segons el mètode de Sakat et al.[87], que va ser modificat per Gunathilake et al.[88]. Breument, la solució de reacció (2 ml) constava d'1 ml d'1 per cent de tripsina en tampó Tris-HCl de 2{{10}} mM (pH7,4) i 1 ml de mostra de prova ({{17} },02 mL extracte 0,980 mL aigua). La solució es va incubar (37 graus durant 5 min), i després es va afegir 1 ml de caseïna al 0, 8 per cent (p/v) i la barreja es va incubar més durant 20 min. Al final de la incubació, es van afegir 2 ml d'àcid perclòric al 70 per cent per completar la reacció. La mescla es va centrifugar i es va mesurar l'absorbància del sobrenedant a 210 nm contra el tampó com a blanc. La solució tampó fosfat es va utilitzar com a control. El percentatge d'inhibició de la desnaturalització de proteïnes es va calcular mitjançant la fórmula següent:

on A1= absorció de la mostra de control i A2= absorció de la mostra de prova.

3.5.2. Inhibició de l'activitat de la lipoxigenasa

La capacitat dels extractes obtinguts per inhibir l'activitat de la lipoxigenasa es va determinar mitjançant el mètode descrit per Sarvesvaran et al. 【89】. Primer, 10 μL d'extractes de plantes en diferents concentracions (100, 250 i 500 ug/mL) es van barrejar en una placa de 96-pou amb 160 μL de PBS 100 mM i 20 μL de solució de lipoxigenasa de soja (167 U/). ml）. Les mostres es van incubar a 25 graus durant 10 minuts i després d'aquest temps es van afegir 10 μL d'àcid linoleic sòdic per iniciar la reacció. A continuació, es va mesurar l'absorbància de les mostres a 234 nm durant un període de 3 minuts cada minut mitjançant un lector de microplaques FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). El diclofenac es va utilitzar com a control positiu. El percentatge d'inhibició de l'activitat de la lipoxigenasa es va calcular a partir de l'equació (6):

on: Com és l'absorbància de la mostra provada, Ac és l'absorbància del control negatiu.

El resultat final va ser la mitjana aritmètica de tres mesures independents.

3.6. Anàlisi de citotoxicitat

3.6.1. Cultiu cel·lular

En aquest estudi, es van utilitzar dues línies cel·lulars de la pell: queratinòcits humans normals (HaCaT) i fibroblasts (BJ). Els HaCaT es van obtenir del CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Alemanya) i BJ de la American Type Culture Collection ( Manassas, VA, EUA). Les cèl·lules es van cultivar a la modificació del medi d'àguila de Dulbecco (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, EUA) amb piruvat de sodi, L-glutamina i alt contingut de glucosa (4,5 g/L). El medi també es va enriquir amb un 10% de sèrum fetal boví (Gibco, Waltham, MA, EUA) i un 1% amb antibiòtics (100 U/mL de penicil·lina i 1000 ug/mL d'estreptomicina, Gibco) per evitar la contaminació microbiana. Les cèl·lules es van cultivar en una incubadora a 37 graus en una atmosfera humidificada amb un 95 per cent d'aire i un 5 per cent de diòxid de carboni.

3.6.2.Assaig blau Alamar

Després que les cèl·lules cultivades (HaCaT i BJ) haguessin arribat a la confluència desitjada, es va aspirar el medi DMEM als matràs de cultiu. Les cèl·lules unides a la part inferior es van rentar dues vegades amb solució salina tamponada amb fosfat estèril. La capa cel·lular es va separar amb tripsina i després les cèl·lules es van col·locar en un medi DMEM fresc. Les cèl·lules es van xapar en 96-plaques de fons pla (VWR, Radnor, PE, EUA) i després d'unir-les a la part inferior de les plaques, les cèl·lules es van tractar amb extractes (100, 250 i 500 ug/mL). Les cèl·lules es van incubar durant 24 h.

La prova de citotoxicitat es va realitzar amb l'assaig Alamar Blue (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Països Baixos). Després de la incubació, es va afegir una solució de resazurina a una concentració de 60 uM als pous, després es van col·locar les plaques en una incubadora a 37 graus durant 2 h. Passat aquest temps, s'ha mesurat la fluorescència (入=570nm). Cada concentració d'extracte es va realitzar en tres rèpliques.

3.6.3. Assaig d'absorció de vermell neutre

L'assaig d'absorció de vermell neutre és la segona prova que s'utilitza per determinar la citotoxicitat de PRE, PGE, KTE, CTE i GGE. Primer, es van preparar96-plaques de fons pla tal com es descriu a la secció anterior. Després de 24 h d'exposició de les cèl·lules als extractes, es van aspirar i substituir per colorant vermell neutre (40 ug/mL) i incubar durant 2 h. Passat aquest temps, les cèl·lules es van rentar amb solució salina tamponada amb fosfat. En el següent pas, es va afegir tampó decolorant (150 μL) als pous. A continuació, es va determinar l'absorció de dve vermell neutre mesurant la densitat òptica (OD) a 540 nm. Cada concentració d'extracte es va realitzar en tres rèpliques.

3.7. Determinació del factor de protecció solar (in vitro)

El factor de protecció solar (SPF) es va determinar mesurant l'absorbància d'una solució aquosa d'extractes en concentracions de 10 ug/mL i 50 ug/mL, dins del rang de longitud d'ona de 290 a 320 nm a intervals de 5-nm. A partir dels resultats obtinguts, el SPF es va calcular a partir de l'equació de Mansur [90]: on∶ EE（λ）—espectre d'efecte eritemàtic, I（入）—espectre d'intensitat solar, ABS（入）—absorbància del producte de protecció solar, CF— factor de correcció（=10）, E（N）×I（λ）: es van utilitzar valors determinats per Sayre [91].

3.8. Mesures de pèrdua d'aigua transepidèrmica (TEWL) i hidratació de la pell

Les mesures de TEWL i d'hidratació de la pell es van realitzar mitjançant una sonda TEWAmeter TM 300 i una sonda Corneometer CM 825 connectades a un adaptador MPA (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Alemanya). Cinc voluntaris van participar en l'estudi. Al seu avantbraç pell, es van marcar sis àrees (2 × 2 cm de mida) Es va aplicar una quantitat de 0,2 mL dels extractes de plantes provats en cinc llocs, el sisè lloc va ser el control (no tractat amb cap mostra). Després de 60 i 360 min. , es va prendre el nivell d'hidratació i les mesures de TEWL El resultat final va ser la mitjana aritmètica (de cada voluntari) de cinc mesures independents (hidratació de la pell) i 20 mesures (TEWL).

3.9.Preparació de cosmètics model (desmaquillant) que contenen extractes

Es va preparar un model de cosmètica (desmaquillant). Tots els components utilitzats estaven en línia amb els requisits EcoCert i COSMOS. La formulació es mostra a la taula 7.

El producte es va produir barrejant els ingredients (del punt 1 al punt 6) a temperatura ambient fins a obtenir un líquid homogeni. En l'últim pas, es va ajustar el pH de la formulació. El desmaquillant es va dividir en porcions. Es va afegir una quantitat de l'1 per cent de les solucions de reserva de l'extracte a cada porció i es va barrejar a fons.

3.10.Determinació dels paràmetres de color d'extractes i cosmètics (desmaquillants) que contenen extractes

Es van provar mostres d'extractes i cosmètics amb extractes a temperatura ambient, 48 h després de la seva preparació. Per avaluar els paràmetres de color (coordenades CIELAB). El sistema CIELAB va ser definit per la Comissió Internacional d'Il·luminació l'any 1978. Es basa en tres atributs de color: L*, a*,b, on L* és una variable de brillantor proporcional al valor del sistema Munsell, i a* i b* són coordenades cromàtiques. Les coordenades a* i b* indiquen posicions als eixos vermell/verd i groc/blau, respectivament ( més a=vermell, -a=verd; més b=groc, - b =blau).

A partir de les dades obtingudes: L*, a* i b*, es van calcular els següents paràmetres de color: croma (C*) i tonalitat (h). S'han utilitzat les equacions següents:

4. Conclusions

A partir dels resultats obtinguts, es pot concloure que els extractes de plantes provats mostren diverses característiques positives, gràcies a les quals es poden utilitzar en la producció de cosmètics com el seu ingredient segur i bioactiu. S'ha demostrat que aquestes plantes són una font rica en polifenols, la qual cosa els confereix propietats antioxidants. PRE va mostrar la millor capacitat per eliminar els radicals lliures, probablement perquè conté la majoria de polifenols en comparació amb altres plantes. PGE i PRE van mostrar la millor capacitat per reduir la producció de ROS a les cèl·lules. A més, les plantes no mostren cap activitat citotòxica. Tots els extractes provats van mostrar un efecte inhibidor sobre els enzims elastasa i col·lagenasa, amb P. granatum i GGE amb el major efecte inhibidor. Això pot indicar que aquestes plantes es poden utilitzar en cosmètica com a substàncies que frenen els processos d'envelliment. A més, els resultats obtinguts indiquen que aquestes plantes tenen propietats antiinflamatòries. En aquest cas, CTE i KTE semblaven ser els millors. KTE i PGE van mostrar un efecte protector contra la radiació UV, fins i tot a concentracions baixes. A concentracions més altes, totes les plantes tenien un efecte protector UV. A més, les plantes tenen un efecte positiu en la hidratació de la pell i redueixen la pèrdua d'aigua transepidèrmica. Els extractes PRE, KTE i CTE es poden utilitzar com a colorants efectius en productes cosmètics. El líquid model per a desmaquillar que contenia els extractes esmentats anteriorment es va caracteritzar per un color intens i estable en el temps. El color dels cosmètics amb extractes de PGE i GGE només pot ser observat per observadors experimentats, i no difereixen significativament de la mostra cosmètica en blanc, sense l'addició de l'extracte. Tenint en compte tots els resultats obtinguts, es pot concloure que Papaver rhoeas, Clitoria ternatea i Carthamus tinctorius es poden utilitzar amb èxit com a fonts de colorants grocs, taronges, blaus i morats en la producció de cosmètics que siguin segurs d'utilitzar i, a més, tindrà un efecte positiu sobre la pell.

Aquest article està extret de Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules