Avaluació addicional de Salvia Haenkei com a estratègia innovadora per contrarestar l'envelliment fotogràfic de la pell i restaurar la integritat de la barrera

Siusplau contactaoscar.xiao@wecistanche.comper a més informació

resum:La pell és la barrera essencial del cos humà que realitza múltiples funcions. Els factors endògens, conjuntament amb les agressions externes, afecten contínuament la integritat de la pell, donant lloc a diferents canvis estructurals que influeixen no només en l'aspecte de la pell sinó també en les seves diverses funcions fisiològiques. Les alteracions de les funcions de barrera condueixen a un augment del risc de desenvolupar malalties i reaccions secundaris, per la qual cosa és evident la importància de mantenir la integritat de la barrera epidèrmica i alentir el procés d'envelliment de la pell.creixement del penis de cistancheS'ha identificat recentment el salvia mocador (SH) com un potencial agent antisenescència; el seu extracte és capaç de disminuir el nivell de cèl·lules senescents afectant l'alliberament de ll.1a i reduint la generació d'espècies reactives d'oxigen (ROS). En aquest estudi, l'extracte SH es va provar en una línia cel·lular de queratinòcits humans (HaCaT) exposada a factors d'estrès relacionats amb l'envelliment prematur de les cèl·lules com els radicals lliures i la radiació ultraviolada B. Vam confirmar que SH actua com a carronyador de ROS i vam trobar la seva capacitat per restaurar la integritat de la barrera de la pell reforçant l'estructura del citoesquelet, segellant les unions estretes i augmentant la taxa de migració de les cèl·lules. Tenint en compte aquests resultats, aquest treball esdevé rellevant, identificant el mocador de Salvia com un compost útil per al tractament de la pell anti-envelliment en el rendiment clínic.

Feu clic aquí per saber-ne més

Introducció

Una pell sana i funcional és essencial per protegir la deshidratació i la penetració de diversos contra el 100%, microorganismes, al·lèrgens, irritants i radiacions. L'exposició diària a agents extrínsecs combinada amb alguns factors intrínsecs, com la genètica, el metabolisme cel·lular, les hormones i els processos metabòlics, condueix a l'envelliment natural de la pell [1]. En particular, el fenomen d'envelliment de la pell està molt relacionat amb la radiació ultraviolada, la contaminació, l'ús muscular repetitiu i la gravetat [2, 3]. L'envelliment de la pell, per tant, resulta d'alteracions estructurals i fisiològiques acumulades i de la modulació progressiva de les capes de la pell [2, 4, 5]. Encara que l'envelliment no es considera una condició patològica, sinó un procés biològic i inevitable, la seva correlació amb una varietat de malalties de la pell està ben establerta. Tenint en compte que les malalties de la pell relacionades amb l'edat més rellevants són els trastorns degeneratius, les neoplàsies benignes i malignes, etc., resulta evident la importància de la cura de la pell per tractar o prevenir determinats trastorns cutanis.[6-8]. Actualment, les estratègies anti-envelliment de la pell actuen per revertir els signes dèrmics i epidèrmics de l'envelliment foto/cronològic. Segons els seus enfocaments, es poden classificar de la següent manera: atenció cosmetològica, agents tòpics, procediments invasius, agents sistèmics, factors exògens per evitar l'envelliment, correcció d'estil de vida i hàbits i medicina preventiva [9]. Hi ha dos grups principals d'agents que es poden utilitzar com a components de les formulacions antienvelliment: 1. Reguladors cel·lulars, com el retinol, els pèptids i els factors de creixement, que actuen directament sobre el metabolisme i la producció de col·lagen; 2. Els antioxidants, com les vitamines, els polifenols i els flavonoides, són capaços de reduir la degradació del col·lagen [9].

L'evidència substancial recolza la idea que l'envelliment de la pell és impulsat principalment per les ROS, generades durant el metabolisme de cèl·lules oxidatives endògenes [10,11]. Se sap que l'acumulació de ROS és responsable del dany cel·lular, inclosa la peroxidació lipídica, el dany de proteïnes de membrana i la mutació de l'ADN que condueixen a alteracions estructurals i funcionals de la pell. Amb el pas del temps, les cèl·lules humanes sustenten un augment natural dels nivells de ROS, associat a la pèrdua parcial de les defenses antioxidants. Aquesta condició inevitable es fomenta encara més per la irradiació ultraviolada diària (UVR) que indueix la síntesi de metaloproteinases de la matriu (MMP) i, en conseqüència, la destrucció de col·lagen mediada per MMP [12, 13]. Els estudis in vivo van demostrar la relació causal entre el dany oxidatiu mitocondrial, la senescència cel·lular i els fenotips d'envelliment [10, 14].

La senescència cel·lular es defineix com una aturada estable del creixement cel·lular que es produeix a totes les cèl·lules humanes durant l'envelliment [15-17]. Com a resultat d'esdeveniments estressants, com ara la sobreexpressió d'oncogens, la generació de ROS i el dany a l'ADN (per exemple, induït per la UV, en particular per la llum UVB), les cèl·lules poden tornar-se prematurament senescents [18].Beneficis de salsa cistancheEn aquest escenari, sembla evident la importància de desenvolupar estratègies innovadores capaços d'evitar l'acumulació de cèl·lules senescents o matar-les selectivament, contrarestar així l'envelliment i els trastorns associats a l'envelliment. Recentment, hem identificat Salvia hankie (SH), una planta boliviana rica en vitamina B i propietats antioxidants, com un potencial agent antisenescència [18].

L'acumulació de cèl·lules senescents al llarg del temps és ben sabut que és un dels mecanismes més importants a través dels quals els teixits pateixen el procés d'envelliment, que sembla ser provocat principalment per la persistència d'un estat inflamatori típic. De fet, malgrat que les cèl·lules senescents no poden proliferar, posseeixen una alta activitat metabòlica i produeixen de manera eficient diverses molècules proinflamatòries [19]. Mitjançant l'ús d'un model d'epidermis humana de pell (EpiSkin), es va demostrar que l'extracte SH disminueix els nivells de cèl·lules senescents afectant l'alliberament d'ILla i reduint la generació de ROS [18].

En condicions homeostàtiques, la pell és una barrera eficient que protegeix d'agressions externes i factors endògens i regula la pèrdua de líquids, electròlits i proteïnes. Aquesta important tasca s'atribueix principalment a l'epidermis, un epiteli dinàmic i molt estratificat. Els dos components principals de l'epidermis són l'estrat còrni, la capa externa i les unions estretes (TJ), unions intercel·lulars que segellen queratinòcits adjacents a l'estrat granulós [20]. Les adherències cèl·lula-cèl·lula són necessàries per mantenir la integritat de la barrera epidèrmica.dosificació de cistanche tubulosa redditAquesta important funció la compleixen les unions cèl·lula-cèl·lula especialitzades: unions adherents (AJ), desmosomes i unions estretes. Aquestes estructures no només permeten connexions físiques entre cèl·lules, sinó que en general organitzen els elements citoesquelètics i modulen les vies de senyalització implicades en el desenvolupament, l'estructura i la fisiologia dels teixits. Estudis genètics recents van revelar inesperadament un paper no canònic de les proteïnes d'unió, posant de manifest la importància de la diafonia d'unió, les interdependències i la compensació per permetre la robustesa dels teixits [21].

Aquí hem estudiat l'activitat d'un extracte de Salvia haenkei per entendre el mecanisme molecular responsable dels seus efectes protectors sobre l'envelliment foto/cronològic de la pell. Amb aquesta perspectiva, es van utilitzar queratinòcits humans immortalitzats espontàniament (HaCaT) com a model in vitro i es va analitzar el mecanisme d'acció de SH sota un règim basal així com en condicions estressants induïdes per la irradiació H202 i/o UVB.

RESULTATS

Perfil segur de l'extracte SH i propietats antienvelliment L'estrès oxidatiu a la pell té un paper important en el procés d'envelliment i en la patogènesi de diversos trastorns de la pell [22]. Matic et al. ja ha demostrat que l'activitat antisenescència de Salvia haenkei també es correlaciona amb les seves propietats d'eliminació [18]. Aquests efectes protectors es podrien aprofitar per desenvolupar un nou tractament reparador de la pell capaç de preservar la integritat de la barrera. Amb l'objectiu d'investigar profundament les propietats de l'SH, primer es va verificar l'activitat de l'extracte sobre la viabilitat cel·lular i la generació de ROS en el model de cèl·lules HaCaT.

Cistanche pot anti-envelliment

L'assaig de viabilitat cel·lular es va realitzar per abordar els possibles efectes citotòxics de l'extracte de Salvia haenkei sobre els queratinòcits. Les cèl·lules HaCaT es van tractar amb extracte SH （0.01-10 ug/ml） durant 24 i 48 hores. La viabilitat cel·lular es va avaluar mitjançant l'assaig d'exclusió del blau tripà. Les figures 1A i 1B mostren que el tractament amb extracte SH no afecta la viabilitat cel·lular confirmant el perfil de seguretat de l'extracte a les cèl·lules HaCaT en les condicions experimentals utilitzades.

L'activitat de l'extracte de Salvia haenkei en la generació de ROS es va analitzar en cèl·lules HaCaT després de 3-24 hores de tractament i abans i després de l'exposició a H2O2.

Els resultats de la figura 2A mostren que SH és capaç de reduir els nivells basals de ROS dins de les cèl·lules, especialment durant les 3-hores de tractament. A més d'un augment significatiu dels nivells de ROS després de l'estimulació amb H-Oz (figura 2C), SH és capaç d'evitar la producció de ROS. L'extracte SH (0,01 ug/ml) va reduir significativament (-25 per cent) la generació de ROS induïda per l'estímul oxidatiu (figura 2B), mostrant un efecte comparable amb el NAC després de 3 hores de tractament. Les 24 hores de tractament amb SH semblen ser un increment més eficaç per contrarestar la ROS, en reduir significativament els nivells de ROS a 1 i 10 ug/ml (figura 2B). Aquests resultats confirmen Salvia haenkei

els efectes antioxidants, com s'ha observat anteriorment [18], mostren un efecte basal antioxidant ja a partir de tractaments curts; l'efecte en la prevenció de l'augment induït per l'estímul oxidatiu és més rellevant per a temps de tractament més llargs.

S'informa que les radiacions ultravioladas indueixen un augment dels nivells intracel·lulars de ROS a la pell humana causant danys i envelliment prematur i altres patologies [23-25]. Per tant, s'ha avaluat l'efecte de l'extracte SH sobre la producció de ROS mediada per UVB. Com era d'esperar, els resultats de la figura 3C mostren un augment significatiu dels nivells de ROS intracel·lulars després de l'estimulació UVB. El tractament amb SH, que indueix una tendència a reduir els nivells basals de ROS dins de les cèl·lules (figura 3A), és capaç d'evitar l'augment induït per l'estimulació UVB (figura 3B). 3 hores de tractament amb SH indueixen una tendència a reduir els nivells de ROS; un tractament amb SH més llarg és més eficaç per contrarestar l'estrès oxidatiu, mostrant una disminució significativa tal com s'informa a la figura 3A. Aquestes dades subratllen l'activitat antioxidant de Salvia haenkei també en l'estrès oxidatiu mediat per UVB.

Com s'ha esmentat, l'evidència creixent suggereix que les cèl·lules senescents s'acumulen a la pell cronològicament i fotoenvellida, contribuint a alteracions i patologies de la pell relacionades amb l'edat [26]. Per tant, es va avaluar l'efecte de Salvia hankie sobre els marcadors de senescència p21 i p27 (que eviten la fosforilació de la proteïna del retinoblastoma (Rb) i amb activitat inhibidora sobre la CDK2-ciclina E, respectivament [27]) després de l'estrès fotogràfic induït per radiació ultraviolada. Els resultats de la figura 4 mostren que la irradiació UVB indueix un augment significatiu dels nivells d'ARNm de p21 i p27 en comparació amb el control no estimulat.cistanche แอ ม เว ย์Una tendència similar en la prevenció de l'augment s'observa a les cèl·lules tractades amb SH. SH 1 ug/ml indueix una reducció significativa dels nivells de p21 en comparació amb el control estimulat amb UVB, mentre que les altres concentracions indueixen una tendència a reduir-se (figura 4A). Els nivells de P27 es redueixen significativament amb el pretractament amb SH 0.01, 0,1 i 10 ug/ml (figura 4B).

També s'ha establert que les cèl·lules senescents afecten negativament el microambient secretant una barreja proinflamatòria de quimiocines, citocines, hormones de creixement i proteases, coneguda com a fenotip secretor associat a la senescència (SASP) [28]. Els resultats de la figura 5 mostren que l'estimulació UVB indueix un augment significatiu dels nivells d'ARNm ILla (A), IL6 (B) i IL18 (C) respecte al control no estimulat. El pretractament amb SH presenta una forta activitat per contrarestar l'augment dels nivells de citocines. Com es mostra a la figura 5A, SH 10 ug/ml va disminuir significativament els nivells d'ILla; l'augment d'IL6 es contraresta significativament per SH 0.01, 0,1 i 10 ug/ml (figura 5B), mentre que totes les concentracions provades poden reduir significativament els nivells d'IL18 (figura 5C). Manteniment de la barrera cutània Tenint en compte els resultats anteriors sobre una línia cel·lular epitelial, es va avaluar l'efecte de l'extracte SH sobre diverses proteïnes i processos implicats en el manteniment de la barrera cutània i la reparació del dany tissular.

Expressió de Sirtuin-1

Diversos estudis in vitro van informar que les radiacions UVB indueixen una disminució dels nivells de proteïna Sirtuinl (SIRT1) dels fibroblasts humans, cosa que indica la implicació de SIRT1 en el dany mediat per UVB [29]. Per tant, l'efecte de l'extracte de Salvia haenkei sobre l'expressió de proteïnes Sirtuinl es va avaluar mitjançant un assaig de western blot (figura 6). Com era d'esperar, l'estimulació UVB va induir una disminució significativa de l'expressió de la proteïna SIRTI a les cèl·lules HaCaT. Per tant, es va investigar l'activitat de l'extracte de SH als nivells de SIRT1. Curiosament, els resultats mostren que 1 ug/ml d'extracte SH, en comparació amb el control, va induir un augment de l'expressió de SIRTl (més un 40 per cent) en condicions basals, cosa que indica un efecte estimulant potencial sobre els nivells de SIRT1. Com era d'esperar, l'estimulació UVB indueix una reducció significativa dels nivells de SIRT1. Els resultats mostren que el pretractament amb 0,01 ug/ml d'extracte SH presenta un efecte millorant en els nivells de Sirtuin 1, en comparació amb el control tractat amb UVB.

Assaig de cicatrització de ferides

Els queratinòcits són els principals constituents de l'epidermis i proporcionen una barrera entre l'organisme i el medi ambient. Per tant, la seva proliferació i migració tenen un paper clau en el manteniment d'una barrera eficaç i en la cicatrització de ferides després de lesions [30, 31). Així, es va avaluar l'efecte de SH sobre la migració de cèl·lules HaCaT. Les imatges de la figura 7A mostren que el tractament amb SH condueix a una reducció del gruix de la rascada que indica un efecte sobre la migració de cèl·lules HaCaT. La figura 7B informa de la construcció del quimograma de la velocitat de migració de les cèl·lules HaCaT; Les imatges mostren un augment de la migració cel·lular depenent de la concentració. El gràfic de la figura 7C indica un augment significatiu de la velocitat de migració cel·lular després de 4-8 hores de tractament amb 0,01 ug/ml d'extracte SH. L'augment màxim s'aconsegueix en l'interval de 8-12 hores, on la velocitat de les cel·les de velocitat de migració cel·lular és d'uns 165 per cent respecte al control. Aquestes dades, com els resultats obtinguts sobre la proliferació cel·lular, indiquen que la concentració més baixa d'extracte SH és capaç d'induir un augment de la velocitat de migració cel·lular no relacionada amb un fenotip hiperproliferatiu.

Manteniment d'unions estretes

A més de l'estrat corni, les unions estretes (TJ) juguen un paper important en la integritat de la pell, actuant com a barrera per a l'aigua i els soluts, i estan implicades en la diferenciació, proliferació, polaritat cel·lular i processos de transducció de senyals de les cèl·lules. Estudis recents van demostrar que la llum UV altera l'expressió i la localització de proteïnes individuals de l'estructura TJ, que al seu torn altera la funció de barrera de la pell [32].

Per avaluar l'efecte de l'extracte de Salvia haenkei com a possible agent protector contra la interrupció del TJ, es va mesurar l'expressió d'ocludina mitjançant immunocitoquímica després de l'exposició a la radiació UVB. Les imatges de les figures 8A i 8B mostren que el tractament amb ambdues concentracions de SH indueix un augment de l'expressió de proteïnes d'ocludina, afavorint la formació d'unions útils per al manteniment de la integritat de la barrera epidèrmica. Com era d'esperar, després de l'exposició a la radiació UVB, les cèl·lules mostren un anell de membrana irregular i no definit (figura 8A). El tractament amb SH, especialment a la concentració més alta, preserva la morfologia de la membrana mantenint l'estructura comparable al control no estimulat. L'extracte SH afavoreix el reforç de la unió i prevé el dany induït per l'exposició UVB, mantenint la funcionalitat de la barrera cutània.

Expressió filagrina

L'efecte de l'extracte de Salvia haenkei sobre l'expressió de proteïnes de filagrina (FLG) es va avaluar mitjançant immunocitoquímica. La filagrina és una proteïna estructural fonamental en el desenvolupament i manteniment de la barrera cutània. Els resultats de les figures 9A i 9B mostren un augment depenent de la concentració de l'expressió de la proteïna filagrina després del tractament durant 24 hores amb extracte SH. A més, l'expressió de la proteïna F-actina indica una distribució regular de les cèl·lules, després del tractament amb SH, que condueix a una continuïtat estructural ben organitzada de la barrera epitelial. Aquestes dades indiquen que l'SH té un impacte beneficiós sobre la barrera de la pell, millorant l'expressió de filagrina, que és essencial per a la correcta formació i funció de la pell.

Expressió de la metal·loproteinasa

L'exposició de la pell a les radiacions ultravioletes indueix deterioraments a la matriu extracel·lular (ECM) que provoquen arrugues, flacciditat i laxitud de la pell, les principals característiques de l'envelliment de la pell. Les metaloproteinases de matriu (MMP) són les principals responsables de la degradació dels components de l'ECM com el col·lagen, l'elastina, la fibronectina i els proteoglicans [33].quant cistanche prendreUn gran nombre d'estudis subratllen que l'exposició de la pell a la irradiació UV indueix una regulació positiva de diferents MMP, afectant l'aspecte i la salut de la pell [34-37].

Els resultats de la figura 10 mostren que la radiació UVB augmenta l'expressió d'ARNm de la gelatinasa MMP-2 que degrada els col·lagens de la membrana basal i els col·lagens estructurals desnaturalitzats [38]. El tractament amb SH és capaç de reduir significativament els nivells d'ARNm de MMP-2 (SH 0.01-0.1-10 ug/ml） indicant l'activitat de l'extracte de SH en el manteniment de la integritat estructural de la pell, danyada per l'estrès fotogràfic.

DISCUSSIÓ

L'envelliment de la pell és l'efecte acumulat de factors intrínsecs i extrínsecs que condueixen a una disminució de la pell, induint aprimament, rigidesa i pèrdua de flexibilitat. La pell és la primera barrera entre l'organisme i el medi, per la qual cosa el manteniment de la seva integritat funcional i anatòmica és fonamental. A més dels processos naturals d'envelliment i les condicions relacionades amb l'envelliment com la diabetis, la menopausa, etc., els factors extrínsecs poden concórrer a afectar l'estructura de la pell; en particular, els fotodanys, la contaminació o els factors d'estil de vida (tabaquisme, dieta, estrès emocional, etc.) poden dificultar l'estructura i les funcions de la pell [39,40]. Els queratinòcits són els components principals de l'epidermis, proporcionant la base cel·lular de la barrera més externa; en aquest treball, la línia cel·lular de queratinòcits humans HaCaT ha estat exposada a factors d'estrès, com els radicals lliures i la radiació ultraviolada B, per imitar l'envelliment natural de la pell, alterant així la funció de barrera. El mocador de salvia s'ha identificat recentment com un potencial agent antisenescència que suggereix la seva possible aplicació en l'envelliment de la pell i els trastorns relacionats amb l'envelliment de la pell; per tant, es va investigar profundament l'efecte d'un extracte d'aquesta planta sobre els paràmetres relacionats amb l'envelliment de la pell, el manteniment de la integritat de la pell i les condicions fisiològiques. Es creu que la producció d'espècies reactives d'oxigen o radicals lliures a través de processos metabòlics endògens normals o UVR i contaminació contribueix als processos d'envelliment de la pell. La pell és vulnerable a una varietat de reaccions redox, i l'equilibri redox és essencial per al manteniment de l'homeòstasi de la pell. Les baixes concentracions de ROS exerceixen activitats fisiològiques, però els nivells més elevats d'aquestes espècies estan implicats en l'activació de vies que donen lloc a una major degradació del col·lagen, acumulació d'elastina, activació de metaloproteases que degraden la matriu, etc. [41]. A més, les ROS tenen un paper important en processos patològics com l'envelliment, la inflamació, les lesions i la patogènesi de diverses malalties de la pell com la psoriasi i el vitiligen [42]. Curiosament, s'ha demostrat que l'extracte de Salvia haenkei redueix els nivells de ROS en condicions basals, condicions d'estrès oxidatiu i condicions d'estrès induïdes per la irradiació UVB, cosa que indica un efecte protector potencial contra les alteracions mediades per ROS [22].

En suport de l'efecte antienvelliment observat anteriorment del mocador de Salvia, en aquest treball, vam evidenciar la capacitat de l'extracte SH per reduir la senescència en els queratinòcits estimulats per la radiació UVB. Els resultats mostren que SH és capaç de reduir l'expressió gènica dels marcadors de senescència p21 i p27, que són estimulats per la radiació UVB. Curiosament, l'extracte de SH mostra una activitat prometedora per reduir la resposta inflamatòria fomentada pel fotodany a les cèl·lules, mitjançant la reducció de la transcripció de les interleucines. A més, hem demostrat de manera intrigant que l'extracte de Salvia haenkei va induir l'expressió de la proteïna Sirtuinl no només després de l'estrès, sinó també en condicions basals, mostrant una activitat prometedora per frenar els processos d'envelliment. S'ha demostrat que la família de la sirtuïna, i en particular la SIRT1, té un paper en l'envelliment-fotoenvelliment, especialment mitjançant la inhibició de les MMP i la degradació posterior del col·lagen; múltiples estudis van subratllar el seu paper protector en el fotoenvelliment mediat per UVB. S'ha demostrat que compostos naturals com la juglona (5-hidroxi-1,4-naftalendiona) restauren SIRT1 als nivells normals després del tractament amb UVB, cosa que suggereix que SIRTI podria tenir un paper en la prevenció de la carcinogènesi induïda per UVB. [29]. Els nostres resultats també indiquen la possible implicació de les sirtuïnes en el procés de reparació després de l'estrès UVB i el seu paper en el manteniment de l'homeòstasi de l'epidermis.

Els trastorns inflamatoris comuns de la pell, com la dermatitis atòpica i la psoriasi, així com els processos d'envelliment, presenten una funció de barrera disminuïda, i la resposta de les cèl·lules epidèrmiques a la ruptura de la barrera pot agreujar, mantenir o fins i tot iniciar aquestes condicions. Els resultats d'aquest treball van revelar una forta capacitat de l'SH per restaurar la integritat de la barrera cutània mitjançant la modulació de diverses proteïnes implicades en aquests processos. En particular, es va observar que l'estimulació de la transcripció d'ocludina i filagrina indicava una acció de reforç de les adherències entre cèl·lules. La deficiència de filagrina hereditària i adquirida afecta la barrera epidèrmica, alterant l'organització de

filaments de queratina del citoesquelet i l'estructura de l'embolcall cornificat de la pell [43]. A més, els defectes en l'expressió FLG indueixen una disminució del nombre de grànuls de queratohialina, una caiguda marcada de la concentració de factor hidratant natural (NMF) i l'alcalinització del pH de la pell [44]. A més, les alteracions de les proteïnes claudines i ocludines, que pertanyen a les proteïnes Tight junctions (TJs), estan ben descrites pel que fa als processos d'envelliment. Els TJ són els responsables de segellar l'espai intercel·lular entre les cèl·lules epitelials, per formar una barrera funcional i estan implicats en la proliferació i diferenciació cel·lular [45]. S'ha demostrat que l'extracte de Salvia haenkei millora l'expressió de filagrina i preserva la localització de l'ocludina a les membranes cel·lulars, deteriorada per les radiacions UVB. Una activitat addicional de l'extracte SH en el manteniment de la pell sana s'ha demostrat per la seva capacitat de reduir la transcripció de metaloproteinases matricials 2(MMP-2), estimulada per la radiació UVB. La regulació a l'alça de les MMP facilita l'envelliment i les patologies de la pell, degradant el col·lagen i l'elastina causant deficiències a la matriu extracel·lular (ECM) [33, 38], per la qual cosa val la pena una reducció d'aquestes proteïnases en el context de l'envelliment de la pell.

Els efectes positius del tractament amb SH observats en aquest estudi sobre els paràmetres moleculars de la pell més comuns es van confirmar també per un assaig clínic recent, realitzat en una cohort de cinquanta dones caucàsiques d'entre 45 i 60 anys [46]. El pañuelo de salvia s'ha administrat en una formulació de crema i es van avaluar diversos paràmetres, com ara l'envermelliment i l'elasticitat de la pell, la profunditat de les arrugues i el potencial antioxidant, tant per avaluacions clíniques com instrumentals, així com per autoavaluació dels subjectes. Els resultats d'aquest estudi revelen l'eficàcia de l'SH per millorar el deteriorament de la pell quan s'aplica diàriament en un context d'envelliment moderat de la pell. De fet, després de 84 dies d'aplicació, la pell de les dones va resultar més elàstica i presentava un menor nombre de zones vermelles i arrugues menys profundes. A més, l'estudi demostra un augment progressiu de la capacitat antioxidant de la pell després de l'aplicació diària de la crema [46].

Com a refugi protector del cos de l'entorn extern, la pell està constantment exposada a possibles lesions i, per tant, la cicatrització de ferides és un procés essencial per a la supervivència de tots els organismes. Tenint en compte la capacitat provada de l'SH per mantenir una pell sana i sense taques, vam suposar que aquest extracte també podria ajudar a millorar la regeneració de la pell en ser útil en la reparació de lesions cutànies. Així, finalment es va considerar l'activitat SH sobre la migració dels queratinòcits, sent un pas clau per restaurar la barrera cutània després de les lesions. El tractament amb extracte de SH va revelar una activitat interessant capaç d'augmentar la velocitat de migració de HaCaT, demostrant un fort efecte en el restabliment de la lesió epitelial després de les lesions. Com que la migració és un element crític en el procés de cicatrització de ferides, les nostres dades, tenint en compte també l'activitat no hiperproliferativa de l'extracte, indiquen un efecte potencial dels extractes de SH per contrarestar més ràpidament l'efecte d'una lesió a la barrera cutània, reduint el risc de infeccions.

Les nostres dades assenyalen l'extracte de Salvia haenkei com un compost útil per ajudar al restabliment de la barrera o per amortir la resposta a l'estrès epidèrmic. Simultàniament amb l'assaig recent en humans, aquest treball proporciona més informació sobre els mecanismes implicats en l'efecte positiu de l'extracte sobre l'envelliment de la pell.

Aquest treball, en suport dels treballs anteriors [18, 46], identifica d'una manera més peculiar el mecanisme molecular vinculat a l'eficàcia del mocador de Salvia en la modulació dels paràmetres de la pell, subratllant la rellevància del mocador de Salvia com a agent atractiu útil per a l'anti-envelliment. i trastorns de la pell relacionats amb l'envelliment.

MATERIALS I MÈTODES Cultiu cel·lular i irradiació UVB

Les cèl·lules HaCaT (queratinòcits humans immortalitzats espontàniament) es van cultivar en medi Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) d'alta glucosa complementat amb sèrum boví fetal al 10% (Life-Technologies, Waltham, MA, EUA), glutamina 2 mM, penicil·lina 100 U/ml i 100 ug/ml estreptomicina (Lonza, Basilea, Suïssa). Les cèl·lules es van mantenir sota una atmosfera humidificada d'un 5% de CO2 a l'aire i es van incubar a 37 graus.

Quan el protocol experimental ho sol·licitava, les cèl·lules es van exposar a una radiació UVB de 30 KJ/m², subministrada per una làmpada UVB PL-S de banda estreta de Philips Medical. Per evitar l'absorció de llum pel medi de cultiu de teixits, es va eliminar abans de la irradiació i es va substituir per DMEM FBS i sense fenol vermell, seguint el protocol d'irradiació [47]. Després de la irradiació UVB, les cèl·lules es van alimentar amb un medi de creixement fresc o es van utilitzar per a experiments seguint el protocol.

Viabilitat cel·lular: assaig d'exclusió del blau tripà Es van sembrar 35 cèl·lules x10³ en plaques de 12 pous i, després d'una incubació durant la nit, es van exposar a diferents concentracions d'extracte hidroetanòlic de Salvia haenkei segons protocols experimentals. L'extracte ha estat proporcionat amablement per IBSA Farmaceutici Italia (Lodi, Itàlia) i presenta un contingut d'àcid rosmarínic marcador de 0,6 per cent p/p per HPLC. Després del tractament, les cèl·lules es van rentar, es van separar amb un 0, 25 per cent de tripsina -0, 2 per cent d'EDTA i es van suspendre en blau de tripà (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) en una proporció l: I en una solució mitjana. Les cèl·lules es van comptar amb un hemocitòmetre de cambra Burker.

Assaig de fluorescència ROS

La ROS es va quantificar mitjançant 2', 7'-diclorofluoresceïna-diacetat (Hz-DCF-DA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA), tal com es va descriure anteriorment [48]. Breument, les cèl·lules (5x10') es van sembrar en plaques 96-pous, es van deixar adherir durant la nit i després es van exposar a l'extracte SH durant 3 o 24 hores. Es va utilitzar N-acetilcisteïna 5mM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) com a control positiu.

Per a la condició d'estrès oxidatiu, el nivell de ROS es va mesurar després de l'addició de 50 μM Hz-DCF-DA en absència o presència d'H2Oz [48]. La intensitat de fluorescència de DCF es va mesurar a l'excitació de 485 nm-emissió de 535 nm, mitjançant un lector de plaques multietiqueta VICTOR X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA).

Per a l'avaluació dels nivells de ROS en condicions d'estrès UVB, el protocol es va modificar lleugerament, incubant cèl·lules en solució de tractaments SH - 50 μM Hz-DCF-DA en PBS. Després de 25 minuts d'incubació a 37 graus, la placa es va exposar a radiacions UVB i es va mesurar immediatament la intensitat de fluorescència DCF a una excitació de 485 nm-emissió de 535 nm, utilitzant un lector de plaques multietiqueta VICTOR X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA).

Microscòpia d'immunofluorescència

Es van sembrar 10x104 cèl·lules sobre cobertors de vidre recoberts prèviament amb col·lagen en plaques de 24-pous, es van deixar unir durant la nit i es van tractar amb extracte SH segons el protocol. Per a la detecció de proteïnes -catenina i ocludina, les cèl·lules es van exposar a radiació UVB, tal com es descriu al protocol anterior. Després de la irradiació, les cèl·lules es van alimentar amb un medi de creixement fresc o es van utilitzar per experimentar seguint el protocol. Per a l'assaig d'immunofluorescència, 4 hores després de la irradiació UVB, les cèl·lules es van rentar, es van fixar amb un 4% de formaldehid, es van permeabilitzar amb un 0,1% de Tritó X-100 en PBS i es van tacar durant 1 hora a 37 graus amb diferents anticossos específics de proteïnes: anti-ocludina monoclonal de ratolí (Invitrogen Life Technologies, Waltham, MA, EUA), anti-filagrina de ratolí (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). Després del rentat de PBS, les cèl·lules es van incubar amb anticossos secundaris/isotiocianat de fluoresceïna (Alexa Fluor 488 anti-ratolí o Alexa Fluor 536 anti-conill immunoglobulina G, Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Waltham, MA, EUA) i amb fal·loidina durant 1 hora a temperatura ambient. Després de 10 minuts de tractament amb RNasa, els cobreobjectes es van muntar sobre portaobjectes de vidre utilitzant Mowiol 40-88 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) i es van afegir iodur de propidi. Les imatges es van adquirir mitjançant un microscopi confocal LSM 800, augment 60X, programari ZN 2.1 Blue Edition (Carl Zeiss, Jena, Alemanya) i es van quantificar mitjançant el programari ImageJ.

Anàlisi estadística

L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant GraphPad Prism versió 7.02 per a Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Llevat que s'indiqui el contrari, els resultats es presenten com a mitjana més SEM. Es va utilitzar la prova t de Student i els valors de p<0.05 were="" considered="" statistically="">

Abreviatures

AJ:unió adherent; ECM: matriu extracel·lular;FLG: filagrina; Hz-DCF-DA: 2',7'-diclorofluoresceïna-diacetat; H2Oz: peròxid d'hidrogen; MMP: metaloproteinasa de matriu; NAC: N-acetilcisteïna; NMF:factor; ROS: oxigen reactiu hidratant natural

espècies; SIRTl: Sirtuinl; SH: mocador de Salvia; TJ: unió estreta; UVB: radiació ultraviolada B.

Aquest article està extret de www.aging-us.com