Clonació gènica, identificació funcional, anàlisi estructural i d'expressió de la sacarosa sintasa de Cistanche Tubulosa

Resum:La sacarosa sintasa té un paper crucial en la via del metabolisme del sucre de les plantes en catalitzar la producció de difosfat d'uridina (UDP)-glucosa, que serveix com a donant de glicosil bioactiu per a diversos processos metabòlics. En aquest estudi, es va clonar un gen de sacarosa sintasa anomenat CtSusCistanche tubulosa, una medicina tradicional xinesa coneguda per la seva riquesacontingut de diversos glucòsids, basat en els resultats de l'anàlisi del transcriptoma. El marc de lectura oberta de CtSus era de 2 418 pb de llarg que codificava 805 aminoàcids. L'anàlisi de la seqüència va revelar dominis conservats associats a la família de la sacarosa sintasa de les plantes tant a les regions N-terminals com a C-terminals de la proteïna CtSus. L'anàlisi filogenètica va demostrar que CtSus comparteix una estreta relació evolutiva ambsacarosa sintasesd'altres plantes dins del mateix ordre. La identificació funcional de CtSus es va realitzar mitjançant l'acoblament de catàlisi de cèl·lules senceres amb UGT71BD1, un enzim de glicosiltransferasa caracteritzat. Els resultats van mostrar que la introducció de CtSus va millorar significativament la taxa de conversió de la glicosilació catalitzada per UGT71BD1. L'expressió soluble de CtSus a Escherichia coli es va aconseguir encara més mitjançant el vector d'expressió pCold™ TF. L'assaig enzimàtic in vitro va indicar l'activitat de CtSus per catalitzar la formació d'UDP-glucosa en presència de sacarosa i UDP. Els resultats de la reacció en cadena quantitativa de la polimerasa en temps real van mostrar que els patrons d'expressió del gen CtSus en diferents parts de C. tubulosa i els cultius de cèl·lules en suspensió de C. tubulosa sota estrès per sequera es correlacionaven amb els patrons d'acumulació observats per als glucòsids de feniletanol, respectivament. A més, es van explorar els aminoàcids clau i les seves interaccions entre l'enzim i el substrat basant-se en la predicció de l'estructura de proteïnes i els resultats d'acoblament molecular. En general, els nostres resultats identifiquen una sacarosa sintasa CtSus responsable del subministrament del donant actiu de glicosil UDP-glucosa durant la biosíntesi de productes glicòsids a C. tubulosa i també han proporcionat un element gènic que es pot utilitzar en la construcció de soques d'enginyeria per a la producció de productes glicòsids.

Paraules clau: Cistanche tubulosa; sacarosa sintasa; glucòsids; UDP-glucosa; catàlisi enzimàtica

DICHEN CISTANCHE CULTIVA BASES A YUTIAN, HOTAN, XINJIANG

Servei de suport de Wecistanche: el major exportador de cistanche a la Xina:

Correu electrònic:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cistanche tubulosa (Schenk) R. Wightés una planta paràsita herbàcia perenne del gènere Cistanche de la família Orobanchaceae. És un material medicinal tradicional xinès rar i preciós, originari de Xinjiang i Mongòlia Interior. És de naturalesa dolça, salada i càlida, i té les funcions deyang tonificant del ronyó, beneficiant l'essència i la sang, i humitejar els intestins ialleujar el restrenyiment. Es coneix com el "ginseng del desert" [1]. La investigació moderna ho ha trobatCistanche tubulosacontéuna varietat de components químicscom araglicòsids feniletanoides, terpens d'èter iridoidei els seus glucòsids, lignans i els seus glucòsids, èsters d'oligosacàrids, polisacàrids, poliols, oligosacàrids, esterols i els seus glucòsids, glucòsids monoterpenoides, sucres, aminoàcids i olis volàtils [2,3], especialment els compostos de glicòsids són els ingredients actius més importants. Entre ells, els compostos de glicòsids feniletanoides tenen el contingut més alt en el material medicinal original i tenen una àmplia gamma d'activitats farmacològiques com la neuroprotecció i l'anti-envelliment [4]. La biosíntesi dels compostos de glicòsids esmentats anteriorment implica múltiples etapes de reaccions de glicosilació, que són catalitzades perglicosiltransferases a les plantes, i elProvisió de donants actius de glicosilés essencial en aquest procés. Els donants de sucre actius comuns als organismes inclouen el difosfat d'uridina (UDP), el difosfat de timidina (TDP) i el difosfat de guanosina (GDP). Entre ells, la UDP-glucosa és el donant de glicosil actiu més comú a les plantes. No només es pot reconèixer directament per la glucosiltransferasa per catalitzar la reacció de transferència de glucosil, sinó que també es pot utilitzar com a precursor per participar en la síntesi d'altres tipus de donants de glicosil. Per exemple, la UDP-glucosa es pot utilitzar com a substrat per generar UDP-ramnosa sota la catàlisi de 4,6-deshidratasa, 3,5-isomerasa i 4-reductasa[5]; La UDP-glucosa es pot utilitzar com a substrat per catalitzar la síntesi d'UDP-xilosa mitjançant la UDP-glucosa deshidrogenasa i la UDP-xilosa sintasa; La UDP-xilosa es pot catalitzar encara més per la UDP-xilosa epimerasa per generar UDP-arabinosa[6]; La UDP-glucosa i la UDP-galactosa són diastereòmers i es poden convertir entre si mitjançant l'epimerasa[7,8]. Per tant, la síntesi de UDP-glucosa té una influència important en el subministrament de donants de glicosil actius a les plantes i en la modificació de la glicosilació dels metabòlits secundaris.

La síntesi d'UDP-glucosa a les plantes es pot aconseguir mitjançant la via de la sintasa, la via de la fosforilasa i la via de la cinasa. Entre ells, la sacarosa sintasa pot catalitzar directament la reacció entre UDP i sacarosa per generar UDP-glucosa i fructosa, així com la reacció inversa [9]. En un sentit ampli, la sacarosa sintasa pertany a la subfamília de les glicosiltransferases -4, que inclou una varietat de glicosiltransferases, com la fosfatasa de síntesi de sacarosa, la trehalosa sintasa i la trehalosa fosforilasa [10]. La sacarosa sintasa es va identificar per primera vegada en el germen de blat [11]. Des de llavors, els investigadors han identificat centenars de gens de sacarosa sintasa d'una varietat de plantes com la mongeta mungo (Vigna radiata), l'arròs (Oryza sativa), el blat de moro (Zea mays), la soja (Glycine max) i el préssec (Amygdalus persica). Estan implicats en múltiples processos metabòlics a les plantes, inclòs el transport i la distribució de sacarosa, la síntesi de midó, la síntesi de cel·lulosa i la composició de la paret cel·lular, l'estrès biòtic i abiòtic, etc., i tenen un paper regulador clau en l'assignació de fonts de carboni vegetal [12]. A més, a partir de l'estudi de les funcions fisiològiques, els investigadors també van utilitzar la sacarosa sintasa obtinguda com a element gènic per a la síntesi enzimàtica de compostos glicòsids i van aconseguir resultats ideals. Per exemple, Masada et al. [13] va coexpressar el gen de sacarosa sintasa AtSus-1 d'Arabidopsis thaliana i el gen de glicosiltransferasa CaUGT2 de Catharanthus roseus in vitro, i va utilitzar un sistema enzimàtic dual d'una sola olla per catalitzar la reacció de glicosilació de la curcumina, que va augmentar la rendiment de glucòsid de curcumina per 7 vegades. Al mateix temps, la quantitat de donant de glucosa UDP utilitzada era només una desena part de la quantitat inicial.

Bungaruang et al. [14] van construir un sistema catalític acoblat utilitzant sacarosa sintasa GmSuSy de soja i glicosiltransferasa OsUGT d'arròs. Van aconseguir la modificació de la glicosilació de la nothofagina afegint només una petita quantitat d'UDP (1,0 mmol·L{-1) i sacarosa. En comparació amb la catàlisi enzimàtica única d'OsUGT, la producció de productes de glicosilació va augmentar en tres ordres de magnitud, de μmol·L-1 a mol·L-1.

La riquesa i diversitat de compostos glicòsids de Cistanche tubulosa suggereixen que hauria de contenir una potent sacarosa sintasa relacionada amb la modificació de la glicosilació de metabòlits secundaris, però aquest enzim no s'ha informat en plantes del gènere Cistanche. En aquest article, com a material es va utilitzar Cistanche tubulosa, un material medicinal inclòs a la farmacopea. Mitjançant l'anàlisi del transcriptoma i l'anàlisi comparativa del transcriptoma de diferents parts, es van utilitzar tècniques de biologia molecular per extreure i identificar un gen de sacarosa sintasa CtSus. Es van realitzar anàlisis bioinformàtiques, biotransformació de cèl·lules senceres, expressió i purificació procariotes, anàlisi de l'activitat catalítica d'enzims in vitro i anàlisi d'expressió gènica en diferents parts de Cistanche tubulosa i sistemes de cultiu de teixits vegetals sota estrès per sequera per explorar la funció de CtSus i la seva correlació amb la biosíntesi de compostos glicòsids a Cistanche tubulosa, posant les bases per a l'estudi de la via biosintètica dels compostos glicòsids a Cistanche tubulosa.

Materials i mètodes

Materials Es van recollir plantes fresques de Cistanche tubulosa de la ciutat de Hotan, Xinjiang, Xina, i la identificació biològica la va realitzar el professor Tu Pengfei de la Universitat de Pequín; el nostre grup de recerca va establir el sistema de cultiu de cèl·lules en suspensió de Cistanche tubulosa en una fase inicial [15]; E. coliFast-T1 es va comprar a Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.; E. coli BL21 (DE3) es va comprar a Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; Els vectors pCold™ I i pCold™ TF es van comprar a Bio-Tech (Beijing) Co., Ltd.; El control de la glucosa UDP es va comprar a Xi'an Qiyue Biotechnology Co., Ltd., i els substrats d'esculina i resveratrol es van comprar a Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.

DICHEN CISTANCHE CULTIVA BASES A HOTAN, XINJIANG

Extracció d'ARN i síntesi d'ADNc L'ARN es va extreure d'acord amb les instruccions del kit de plantes OMEGA RNA (Cat R6827-01, Omega Bio-Tek). Es van utilitzar electroforesi en gel d'agarosa i espectrofotòmetre Nanodrop 2000 per detectar la puresa, la concentració i la integritat de l'ARN. Les mostres d'ARN qualificades es van transcriure inversament mitjançant el kit de transcripció inversa TransScript® OneStep gDNA Removal i cDNA Synthesis SuperMix (Cat AT311-02, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.) per sintetitzar la primera cadena d'ADNc.

Extracció de gens de sacarosa sintasa i clonació de gens CtSus La seqüència d'aminoàcids de l'Arabidopsis thaliana sacarosa sintasa AtSus1 identificada funcionalment (número d'accés GenBank: AED92894.1)[16] es va utilitzar com a plantilla. Els gens de la sacarosa sintasa es van seleccionar a partir de les dades del transcriptoma de C. tubulosa mitjançant l'alineació local de la seqüència Blastp, combinada amb l'anotació del gen del transcriptoma, l'anàlisi FPKM (abundància d'expressió gènica) i l'anàlisi comparativa de les dades del transcriptoma. Es van dissenyar cebadors específics a partir de la informació de la seqüència del gen candidat proporcionada per les dades del transcriptoma de segona generació de C. tubulosa (taula 1). L'ADNc de C. tubulosa es va utilitzar com a plantilla i l'amplificació per PCR del gen objectiu es va realitzar mitjançant un enzim PCR d'alta fidelitat (Cat P505-d1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.). El producte d'amplificació per PCR es va purificar mitjançant el kit FastPure Gel DNA Extraction Mini (Cat DC201-01, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.) i després es va clonar segons el kit de clonació ràpida (Cat C112-01, Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.) es va connectar amb el vector de clonació pCE2 TA/Blunt-Zero segons les instruccions de funcionament, es va transferir a cèl·lules competents Fast-T1 i es va cultivar durant la nit a 37 graus. El plasmidi es va extreure i es va enviar a Beijing Liuhe BGI Genomics Co., Ltd. per a la identificació de la seqüenciació.

Taula 1 Seqüència de nucleòtids dels cebadors utilitzats en aquest estudi. qPCR: reacció quantitativa en cadena de polimerasa en temps real

Anàlisi bioinformàtica de la sacarosa sintasa CtSus de Cistanche tubulosa

Es va utilitzar el programari en línia ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) per analitzar les propietats fisicoquímiques de la proteïna; es va utilitzar el programari en línia TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}.0/) per predir l'estructura transmembrana de la proteïna; es va utilitzar el programari en línia SOPMA (https://npsa-rabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) per predir l'estructura secundària de la proteïna; es va utilitzar el programari en línia SMART (http://smart.embl.de/) per predir el domini conservat de la seqüència d'aminoàcids de la proteïna; es va utilitzar el programari DANMAN per comparar les seqüències d'aminoàcids de CtSus amb les de sacarosa sintases d'altres espècies; L'arbre filogenètic es va construir mitjançant l'anàlisi de clúster mitjançant el mètode d'unió de veïns mitjançant el programari MEGA11, amb una repetició d'arrencada d'1,000 vegades.

Anàlisi d'expressió de CtSus a diferents parts de Cistanche tubulosa i sota estrès per sequera

Els primers PCR quantitatius de fluorescència en temps real per a CtSus i el gen de referència interna DNAj es van dissenyar mitjançant el programari DNAMAN [17] (Taula 1). El nivell d'expressió relativa del gen CtSus en cèl·lules en suspensió de Cistanche tubulosa a diferents parts de Cistanche tubulosa i sota estrès per sequera es va analitzar mitjançant PCR quantitativa de fluorescència en temps real. L'anàlisi quantitativa de PCR de fluorescència en temps real es va realitzar mitjançant el kit TransStart® Top Green qPCR SuperMix (Cat AQ131-01, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.). El programa d'amplificació va adoptar un mètode de dos passos: 94 graus durant 30 s; 94 graus durant 5 s, 60 graus durant 30 s, repetit durant 40 cicles; es va executar amb el sistema de detecció de PCR en temps real Bio-Rad CFX Connect™ (Bio-Rad Laboratory, Hercules, CA, EUA). El mètode 2–ΔΔCT es va utilitzar per analitzar l'expressió relativa del gen CtSus en diferents grups experimentals. GraphPadPrism 9 es va utilitzar per a l'anàlisi de significació i per dibuixar un gràfic de barres.

Construcció del vector d'expressió procariota i expressió heteròloga del gen CtSus A partir dels resultats de la seqüenciació gènica, es van dissenyar primers específics que contenien braços d'homologia vectorial i llocs de restricció (taula 1) per a l'amplificació per PCR. El gen objectiu CtSus es va construir en vectors d'expressió pET-28a, pET-24b, pCold™ I i pCold™ TF mitjançant la tecnologia de clonació perfecta mitjançant ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (CatC115-01 , Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.). Els plasmidis dels vectors d'expressió recombinants construïts amb èxit es van extreure i es van transformar en cèl·lules competents en expressió d'Escherichia coli Transetta (DE3). Les cèl·lules es van cultivar en medi líquid LB que contenia 50 µg·mL-1 sulfat de kanamicina (amb pET-28a i pET-24b com a vectors d'expressió) o 1{{ 22}}0 µg·mL-1 ampicil·lina (amb pCold™ I i pCold™ TF com a vectors d'expressió) i 50 ug·mL-1 cloramfenicol, respectivament, a 37 graus i 200 r·min{{ 15}} amb agitació fins que el valor A600 de la solució bacteriana va arribar a 0.4-0.6. Afegiu isopropil-beta-Dtiogalactopiranòsid (IPTG) a una concentració final de 0,5 mmol·L-1 per induir l'expressió de proteïnes. Incubar en un agitador de temperatura constant a 23 graus (amb pET-28a i pET-24b com a vectors d'expressió) o 15 graus (amb pCold™ I i pCold™ TF com a vectors d'expressió), 180 r· min-1 durant 16 h (amb pET28a i pET-24b com a vectors d'expressió) o 24 h (amb pCold™ I i pCold™ TF com a vectors d'expressió), després recull els bacteris per centrifugació.

Tampó de lisi (20 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0,5 mol·L{-1 NaCl, 20 mmol·L{{10} Es va afegir imidazol, glicerol al 3%, 100 mmol·L-1 fluorur de fenilmetilsulfonil, 1 mg·mL{-1 lisozima, pH 7,4) i les cèl·lules es van trencar durant 8 min i es van centrifugar. Es van prendre el sobrenedant i el precipitat respectivament. El sobrenedant es va adsorbir per la columna d'afinitat HisTrap FF (Cat 17531901, Cytiva) plena amb farciment de flux ràpid de Ni Sepharose 6 per adsorbir la proteïna objectiu que contenia l'etiqueta His. Després de l'elució amb diferents concentracions d'imidazol, es va prendre cada fracció per a la detecció de SDS-PAGE (electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida). Les fraccions que contenien la proteïna objectiu es van combinar, es van concentrar per centrifugació i es van dessalar mitjançant un tub d'ultrafiltració (Millipore) i es van emmagatzemar en tampó [que conté 50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7, 5), 0, 2 mol·L{{ 30}}NaCl, 1 mmol·L-1 ditiotreitol, 3% glicerol] per a reaccions posteriors de catàlisi enzimàtica in vitro.

Catàlisi de cèl·lules senceres CtSus El plasmidi pCold™ I-CtSus i el plasmidi d'expressió pET-28a-UGT71BD1[18] de la glicosiltransferasa UGT71BD1, que havia estat identificat anteriorment pel grup de recerca, es van transformar simultàniament en l'expressió competent. E. coli Transetta (DE3). Es van seleccionar bacteris recombinants positius que contenien els gens CtSus i UGT71BD1 i es van inocular en medi LB (medi de creixement) que contenia 50 ug·mL-1 sulfat de kanamicina, 100 ug ·mL-1 ampicil·lina i 50 ug·mL{-1 cloramfenicol en una proporció d'1:100 (V/V). El cultiu es va cultivar a 37 graus fins que el valor A600 de la solució bacteriana va ser de 0,4-0,6, i després es va afegir IPTG a una concentració final d'1 mmol·L-1. El cultiu es va continuar a 15 graus i 180 r·min-1 durant 24 h. El cultiu es va centrifugar a 4 graus i 4 000 r·min-1. Recull les cèl·lules. Inoculeu les cèl·lules recollides al medi M9 (medi de fermentació) en una proporció de 40 ml de medi de cultiu per gram de bacteris i afegiu-hi 75 μmol·L-1 sacarosa i 25 μmol·L-1 aesculetina (1) o resveratrol (2) substrats als grups de reacció. Continuar agitant el cultiu durant 24 h, centrifugar a 4000 × g, 4 graus durant 30 min, afegir metanol per trencar el precipitat per ultrasons, afegir 2 vegades el volum de metanol al sobrenedant, centrifugar a 4000 × g, 4 graus durant 30 min, Agafeu el sobrenedant i combineu-lo, evaporeu el dissolvent a pressió reduïda, torneu a dissoldre's en metanol, filtreu-lo a través de la membrana del filtre de 0,22 μm i detecteu el producte de reacció mitjançant un cromatògraf líquid d'alt rendiment Agilent 1260. Es va utilitzar CAPCELL PAK C18 COLUMN (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) com a columna analítica, aigua àcid fòrmic al 0,1% (A) i metanol (B) com a fase mòbil i el gradient d'elució va ser: {{61 }} min, 30%-90% B; 25-27 min, 90%-100% B; 27-33 min, 100% B. Els paràmetres de l'espectrometria de masses eren modes d'ions positius i negatius i exploracions completes MS1, MS2 i MS3 automàtiques de diverses etapes.

Detecció de l'activitat catalítica de l'enzim CtSus in vitro La proteïna recombinant obtinguda per la cromatografia d'afinitat de columna HisTrap FF esmentada anteriorment es va sotmetre a l'eliminació de l'etiqueta terminal mitjançant el Factor Xa. El sistema de digestió enzimàtica va ser el següent: la proteïna recombinant es va ajustar a una concentració d'1 mg·mL-1, i es va afegir 1 μL de Factor Xa a 50 μL de la proteïna recombinant en un tampó de 20 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8,0), 100 mmol·L-1 NaCl i 2 mmol·L-1

CaCl2 a 23 graus durant 6 h. El sistema de reacció era d'100 μL. El producte del sistema de digestió enzimàtica es va sotmetre a la separació de proteïnes secundàries mitjançant cromatografia d'afinitat HisTrap FF per obtenir la proteïna diana amb eliminació d'etiquetes per a reaccions posteriors de catàlisi enzimàtica in vitro. El sistema de reacció enzimàtica va ser el següent: 10 mmol·L-1 UDP, 100 mmol·L-1 sacarosa, 50 mmol·L{-1 MgCl2, 60 ug de proteïna CtSus, Tris-HCl (pH 7.0) complementat amb 100 μL, va reaccionar en un bany d'aigua a 30 graus durant 6 h, i els mètodes d'anàlisi de posttractament i HPLC es van dur a terme tal com es descriu a la referència [19].

La predicció de l'estructura tridimensional i l'anàlisi de l'acoblament molecular de la proteïna CtSus es va utilitzar AlphaFold2 per predir l'estructura tridimensional de la proteïna CtSus [20]. La molècula de lligand es va hidrogenar i es va carregar mitjançant el programari AutoDock Tools 1.5.6. La butxaca d'unió al substrat es va obtenir mitjançant l'alineació amb la proteïna plantilla AtSus1 (PDBID 3S28). Les cadenes laterals dels residus d'aminoàcids al voltant de la cavitat es van establir per ser flexibles.

El quadre de la quadrícula es va establir a 40 × 40 × 40 Å3 i l'espaiat de la quadrícula era de 0,375 Å. L'acoblament molecular es va realitzar a AutoDock Vina [21]. Es va utilitzar el programari PyMOL 2.0 per visualitzar el model amb la millor afinitat (kcat·mol-1

).

Anàlisi estadística Es va utilitzar GraphPad Prism 9 per a l'anàlisi estadística. Les dades experimentals es van expressar com a mitjana ± desviació estàndard. La prova t es va utilitzar per a la comparació entre dos grups i es va utilitzar l'anàlisi unidireccional de la variància per a la comparació entre diversos grups. La diferència es va considerar estadísticament significativa quan P < 0,05.