El metabolisme del glutatió contribueix a la inducció de la immunitat entrenada

Resum:

El sistema immunitari innat mostra característiques de memòria heteròloga, que es caracteritzen per respostes més fortes a un repte secundari. Aquest fenomen anomenat immunitat entrenada es basa en el reconnectat epigenètic i metabòlic de les cèl·lules immunitàries innates. Com que la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) s'ha associat amb el fenotip d'immunitat entrenat, vam plantejar la hipòtesi que l'augment dels nivells de ROS i la principal molècula redox intracel·lular de glutatió tenen un paper en la inducció de la immunitat entrenada. Aquí mostrem que la inhibició farmacològica de ROS en un model in vitro d'immunitat entrenada no va influir en la resposta cel·lular; la modulació dels nivells de glutatió va reduir la producció de citocines proinflamatòries en monòcits humans. Es va trobar que els polimorfismes de nucleòtids únics (SNP) en gens implicats en el metabolisme del glutatió estaven associats amb canvis en la capacitat de producció de citocines proinflamatòries després d'una immunitat entrenada.

A més, les concentracions plasmàtiques de glutatió es van associar positivament amb la producció ex vivo d'IL-1, un biomarcador d'immunitat entrenada, produïda per monòcits d'individus vacunats amb BCG. En conclusió, el metabolisme del glutatió està implicat en la inducció de la immunitat entrenada, i es garanteixen estudis futurs per explorar les seves conseqüències funcionals en malalties humanes.

La immunitat humana és molt important perquè ens protegeix de malalties i infeccions. El sistema immunitari és un sistema complex format per moltes cèl·lules, teixits i òrgans diferents. Treballen junts per tractar diversos patògens dins i fora. A la investigació, vam trobar que el polisacàrid de Cistanche deserticola i el verbascòsid poden millorar l'activitat dels enzims del cor i el teixit cerebral i enfortir la cavitat abdominal. La funció fagocítica de les cèl·lules i la resposta de proliferació dels limfòcits tenen efectes evidents en la millora de la immunitat.

Feu clic al producte suplementari cistanche deserticola

Paraules clau:

glutatió; immunitat entrenada; macròfags; metabolisme; memòria immune innata.

1. Introducció

Fins fa poc, es pensava que la immunitat adaptativa era l'únic component de la defensa de l'hoste caracteritzat per la capacitat de retenir la memòria, adaptant les respostes de les cèl·lules T i B a un antigen específic.

Tanmateix, un nombre creixent d'investigacions recents també ha atribuït característiques de la memòria heteròloga al sistema immunitari innat, un procés anomenat immunitat entrenada [1]. Els monòcits exposats durant un curt període a Candida albicans, el component de la paret cel·lular dels fongs -glucan, o fins i tot estímuls estèrils com a lipoproteïnes de baixa densitat oxidades (ox-LDL), mostren una producció millorada de citocines proinflamatòries després d'una estimulació secundària no relacionada molt després del s'ha eliminat l'estímul inicial [2, 3].

A més, estudis epidemiològics han demostrat que la vacunació del Bacillus Calmette-Guérin (BCG) contra la tuberculosi augmenta la funció antimicrobiana de les cèl·lules immunitàries innates, induint posteriorment una protecció inespecífica contra infeccions no relacionades i disminuint la mortalitat per totes les causes [4].

La immunitat entrenada està arrelada en canvis epigenètics que modulen l'accessibilitat dels gens de la resposta proinflamatòria per a la maquinària transcripcional de la cèl·lula. El recablejat epigenètic en cèl·lules immunitàries innates entrenades va acompanyat de canvis metabòlics que promouen vies com la glucòlisi, la fosforilació oxidativa i la biosíntesi del colesterol [5,6]. Els metabòlits derivats d'aquestes vies són molècules de senyalització i cofactors que al seu torn poden modular l'activitat dels enzims modificadors de la cromatina. El glutatió (GSH) és el principal antioxidant que preserva l'equilibri redox intracel·lular i s'ha suggerit que contribueix als canvis epigenètics [7].

A més, els estímuls que indueixen una immunitat entrenada, com ara BCG i oxLDL, augmenten la producció d'espècies reactives d'oxigen (ROS) dels macròfags després de l'estimulació secundària [8–10]. Vam plantejar la hipòtesi que l'augment de l'activitat metabòlica dels macròfags entrenats també augmentaria els nivells de ROS i modularia el GSH, que al seu torn influiria en la força de les respostes immunes entrenades.

2. Materials i Mètodes

2.1. Aïllament de cèl·lules mononuclears de sang perifèrica humana (PBMC) i monòcits

Es van obtenir abrics buffy de donants sans després d'un consentiment informat per escrit (Sanquin Blood Bank, Nijmegen, Països Baixos). L'aprovació ètica es va obtenir de la CMO Arnhem-Nijmegen (NL32 357.091.10). L'aïllament es va realitzar mitjançant centrifugació de densitat diferencial sobre Ficoll-Paque (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Regne Unit). Posteriorment, es va realitzar l'aïllament dels monòcits amb una centrifugació de gradient de densitat Percoll hiperosmòtica (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) i es va rentar una vegada amb solució salina freda tamponada amb fosfat (PBS) sense pirogens. Les cèl·lules es van tornar a suspendre i posteriorment es van cultivar en medi modificat holandès RPMI 1640 (Invitrogen, Waltham, MA, EUA) complementat amb gentamicina 5 µg/mL (Centraform, Etten-Leur, Països Baixos), Glutamax 2 mM (Gibco, Waltham, MA, EUA). ), i piruvat 1 mM (Gibco). Per garantir la màxima puresa, els monòcits aïllats amb Percoll es van deixar adherir a plaques de fons pla de poliestirè (Corning, Sigma-Aldrish, Nova York, NY, EUA) durant 1 h a 37 ◦ C 5 per cent de CO2 i després es van rentar una vegada amb PBS calent.

2.2. Model d'immunitat entrenat in vitro

Els monòcits adherents es van cultivar tal com es va descriure anteriorment [11]. Breument, es van sembrar 105 monòcits en plaques 96-de fons pla (Greiner, Kremsmünster, Àustria) i es van incubar amb 1 µg/mL de glucà o 5 µg/mL de vacuna BCG (InterVax, Toronto, ON, Canadà) a RPMI amb un 10 per cent de sèrum humà agrupat. -1,3-(D)-glucan (-glucan) de Candida albicans va ser amablement proporcionat pel professor David Williams (College of Medicine, Johnson City, TN, EUA).

Quan s'indica, les cèl·lules es van preincubar amb {{0}}, 5 µM difenileniodonium (DPI), 50 µM a-tocoferol (AT) (Sigma-Aldrich), 0,5 µM àcid ascòrbic (AA), 1 mM N-acetil cisteïna (NAC) (Sigma-Aldrich) o 100 µM DL-butionina sulfoximina (BSO) (Sigma-Aldrich) durant 1 h abans de l'addició de glucà. Després de 24 h, les cèl·lules es van rentar una vegada amb PBS calent i es van deixar diferenciar en RPMI complementat amb sèrum humà agrupat al 10 per cent durant 5 dies. El medi es va refrescar el dia 3 de cultiu. El dia 6, els macròfags es van reestimular amb 10 ng/mL de lipopolisacàrid d'Escherichia coli (LPS; serotip 055: B5, Sigma-Aldrich) durant 24 hores addicionals.

2.3. Quantificació d'espècies reactives d'oxigen (ROS).

Els monòcits/macròfags es van cultivar durant 2 h, 24 h o 6 dies, es van rentar, es van separar amb PBS fred i es van incubar amb 5 µM H2DCFDA (Life Technologies, Waltham, MA, EUA) en PBS durant 30 min a 37 ◦C. Les cèl·lules es van analitzar mitjançant citometria de flux (CytoFlex, Beckman Coulter, Brea, CA, EUA). L'anàlisi de dades es va realitzar mitjançant el programari Kaluza 2.1. Els agregats cel·lulars es van tancar en funció de l'alçada de dispersió cap endavant (FSC) versus la trama de l'àrea FSC i la població de monòcits / macròfags es va tancar segons FSC i dispersió lateral (SSC). Les dades es presenten com a mitjana ± SEM i s'analitzen amb la prova de Friedman seguida de les proves de comparacions múltiples de Dunn. Un valor p inferior a 0,05 es va considerar estadísticament significatiu, tal com s'indica amb asteriscs (* p <0,05).

2.4. Dades de seqüenciació d'ARN de monòcits humans estimulats in vitro

L'anàlisi de l'expressió gènica dels monòcits exposats in vitro a -glucan es va realitzar mitjançant dades d'ARN-seq publicades anteriorment [12]. Breument, els PBMC es van aïllar mitjançant centrifugació a Ficoll-Paque (GE Healthcare). Els monòcits es van purificar mitjançant selecció negativa amb comptes per a cèl·lules positives CD3 plus (cèl·lules T), CD19 plus (cèl·lules B) i CD56 plus (cèl·lules NK) (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanya). Les cèl·lules es van cultivar seguint el model d'immunitat entrenat in vitro descrit i es van exposar a 5 µg/mL de glucà. Els monòcits es van recollir a les 4 hores i 24 hores després de l'exposició. Els gens relacionats amb la resposta antioxidant i el metabolisme del glutatió es van extreure de la llista de gens significativament dinàmics (p <0,05, FC > 2,5, RPKM > 1) en el model d'immunitat entrenat in vitro de monòcits a macròfags. Les dades es presenten com el log10 de la relació entre monòcits tractats amb -glucan i monòcits no estimulats.

2.5. Quantificació del glutatió

L'anàlisi quantitativa del glutatió intracel·lular reduït (GSH) i oxidat (GSSG) es va realitzar mitjançant l'espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) tal com es va descriure anteriorment [13].

Breument, es va eliminar el medi de creixement i les cèl·lules cultivades es van rentar amb PBS calent (37 ◦ C) i es van apagar amb nitrogen líquid per aturar el metabolisme. Les cèl·lules es van raspar posteriorment de les plaques i es van extreure amb una solució freda (-80 ◦C) de metanol/cloroform/aigua, 8,1:0,9:1 (vol/vol/vol) . Els extractes es van mantenir congelats en gel sec durant almenys 30 min i posteriorment es van centrifugar durant 20 min a 18,{{1{{30}}}}× g a −4 ◦C. El pellet de proteïnes es va mantenir per a la quantificació de proteïnes mentre que els sobrenedants que contenien els metabòlits intracel·lulars s'assecaven sota un corrent suau de nitrogen i es van preparar mostres de RMN dissolent el material sec amb 0,22 ml de tampó fosfat 0,15 M (pH 7,4) en aigua deuterada que contenia 0,05. mM trimetilsilil propionic-d4-sal de sodi com a estàndard intern per a la referència i quantificació de RMN. Es va recollir un espectre de RMN 1D 1H per a cada mostra en una RMN Bruker Avance II de 14,1 T (600 MHz per a 1H), utilitzant la seqüència de polsos noesygppr1d (Topspin v3.0, Bruker Biospin Ltd, Karlsruhe, Alemanya). Tots els espectres es van processar i importar a Chenomx RMN suite 8.4 (Chenomx NMR suite, v8.0, Edmonton, AB, Canadà) per a la quantificació del glutatió.

Totes les concentracions es van normalitzar a la massa total de proteïnes de cada mostra. Aquest últim es va quantificar dissolint el pellet de proteïna en tampó (1:1, 1% SDS: 8M Urea (0.25M Tris pH:8)) amb sonicació. A continuació, es va mesurar la concentració de proteïnes mitjançant el kit d'assaig de proteïnes PierceTM BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) segons el seu manual.

2.6. Models d'immunitat entrenats in vitro i in vivo per a l'anàlisi genètica i metabòlica

En el model in vitro, els monòcits adherents es van incubar amb medi de cultiu només com a control negatiu, 2 µg/mL de -1, 3-(D)-glucan o 5 µg/mL BCG (cohort 300BCG). : soca BCG-Bulgaria, Intervax, Canadà), durant 24 h a 37 ◦ C en presència d'un 10 per cent de sèrum humà agrupat. El dia 6, les cèl·lules es van tornar a estimular durant 24 h amb 200 µL RPMI o LPS 10 ng/mL (serotip 055: B5; Sigma-Aldrich).

En el model in vivo, els adults sans es van vacunar amb una dosi estàndard de 0,1 ml de BCG per via intradèrmica a la part superior del braç esquerre, i es va recollir sang abans i 14 i 90 dies després de la vacunació. En cada visita, es van estimular 5 × 105 PBMC amb Staphylococcus aureus mort per calor (106 CFU/mL) o es van deixar sense estimular a 37 ◦ C amb un 5 per cent de CO2. Les citocines secretades es van mesurar en ambdós models després de 24 h d'estimulació i es va utilitzar l'augment de la resposta de les citocines induïda pels estímuls d'entrenament com a mesura per a la immunitat entrenada [14].

2.7. Anàlisi genètica

L'anàlisi genètica es va realitzar mitjançant una cohort d'individus sans d'origen europeu occidental del Projecte de genòmica funcional humana [15]. La cohort 300BCG està formada per 325 adults dels Països Baixos (44% homes i 56% dones, rang d'edat de 18 a 71 anys). L'estudi va ser aprovat pel comitè d'ètica local CMO regió Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16. Les mostres d'ADN d'individus (n=325) es van genotipar mitjançant el xip SNP disponible comercialment, Infinium Global Screening Array MD v1.0 d'Illumina. L'òptica 0.7.0 amb la configuració predeterminada es va utilitzar per a la trucada de genotips [16]. Es van excloure les mostres amb una taxa de trucada inferior o igual a 0,99, així com les variants amb un equilibri de Hardy-Weinberg (HWE) inferior o igual a 0,0001 i una freqüència d'al·lel menor (MAF) inferior o igual fins a 0,001. Les cadenes de variants es van alinear i es van identificar amb el panell de referència del genoma 1000 mitjançant Genotype Harmonizer [17]. A continuació, vam imputar les mostres al servidor d'imputació de Michigan utilitzant el consorci de referència humà (HRC r1.1 2016) com a panell de referència i vam filtrar variants genètiques amb un R2 < 0,3 per a la qualitat d'imputació i MAF < 5 per cent. [18], donant lloc a uns 4 milions de polimorfismes d'un sol nucleòtid (SNP) per al seguiment de mapes QTL. Es van obtenir dades de genotip i citocines sobre respostes immunes entrenades in vitro per a un total de 267 individus de la cohort de 300 BCG. Es van excloure tres mostres a causa de l'ús de medicaments (de les quals una es va identificar com a valor atípic genètic) i una mostra es va deure a l'aparició de diabetis tipus 1 durant l'estudi.

En primer lloc, es va prendre el canvi de plec de la producció de citocines entre cèl·lules entrenades i no entrenades com a mesura de la magnitud de la resposta immunitària entrenada. Després de la comprovació de qualitat de la distribució de citocines i després d'excloure els valors genètics atípics, vam mapejar els canvis de plecs transformats en registre de la producció de citocines a les dades del genotip mitjançant un model de regressió lineal amb l'edat i el sexe com a covariables per corregir les distribucions del canvi de plec de la producció de citocines. Hem utilitzat un tall de p <9, 99 × 10−3 per identificar associacions suggeridores de loci de trets quantitatius (QTL) que afecten les respostes immunes entrenades. Utilitzant el model d'immunitat entrenat in vivo, es van obtenir dades tant de genotip com de citocines per a un total de 296 individus.

A més dels valors atípics descrits per al mapeig de QTL in vitro, es van excloure 18 individus vacunats al vespre, donant lloc a 278 mostres abans del mapeig de QTL. En primer lloc, es van transformar els nivells de citocines en brut i es van prendre les proporcions de producció de citocines entre les visites com el canvi de plec de la producció de citocines. El canvi de plec de la producció de citocines es va mapar a les dades del genotip mitjançant un model de regressió lineal amb l'edat i el sexe com a covariables. Hem utilitzat un tall de p <9, 99 × 10−3 per identificar associacions suggeridores de QTL que afecten les respostes immunes entrenades. El paquet R Matrix-eQTL es va utilitzar per al mapeig de citocines QTL [19].

2.8. Anàlisi Metabolòmica

Els nivells de metabòlits d'individus de la cohort de 300 BCG es van mesurar abans de la vacunació amb BCG. Les característiques metabòliques van ser mesurades i anotades per General Metabolics (Zuric, Suïssa) mitjançant l'espectrometria de massa de temps de vol d'injecció de flux (injecció de flux TOF-M) [20]. Els metabòlits no dirigits es van anotar segons la base de dades de metabòlits humans (HMDB). Totes les mesures metabolòmiques es van realitzar per duplicat i es va calcular el valor mitjà per a cada mostra per metabòlit. Es va realitzar una anàlisi de correlació de Spearman sobre metabòlits i canvis de plecs de citocines ex vivo sobre les respostes abans de la vacunació. Per provar la relació entre els nivells de glutatió i els SNP d'interès identificats en l'anàlisi genètica, es va realitzar una anàlisi de regressió lineal amb edat i sexe inclosos com a covariables per a cada SNP.

2.9. Quantificació i anàlisi de citocines

La producció de citocines es va determinar mitjançant kits ELISA comercials per a IL{{{0}}, IL{-6 i TNF (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) seguint les instruccions del fabricant. Les dades es presenten com a mitjana ± SEM i s'analitzen amb ANOVA de mesures repetides bidireccionals seguit de les proves de comparacions múltiples de Sidak. Un valor p inferior a 0,05 es va considerar estadísticament significatiu, tal com s'indica amb asteriscs (* p <0,05).

3. Resultats

3.1. - La immunitat entrenada induïda per glucà i BCG desencadena una producció sostinguda d'espècies reactives d'oxigen

L'augment de l'alliberament de ROS s'ha descrit anteriorment com una característica del fenotip d'immunitat entrenat [21]. Els monòcits exposats a -glucan o BCG durant 2 h i 24 h presenten un augment de ROS. Curiosament, aquest augment es va mantenir i es va presentar després de 5 dies de repòs en medis de cultiu (figura 1A). Els nivells de ROS millorats van acompanyats de canvis transcripcionals de diferents gens antioxidants en monòcits exposats a -glucan durant 24 h (figura 1B). La superòxid dismutasa mitocondrial SOD2 i diferents molècules que contenen tiol estan regulades a l'alça, és a dir, les peròxid reductases dependents de la tioredoxina 1-6 (PRDX 1-6) i la sulfiredoxina 1 (SRXN1). També s'augmenta l'expressió de la tioredoxina (TXN) i la tioredoxina reductasa (TXNRD), eliminadors de ROS rellevants que contenen tiol.

Figura 1. L'augment dels nivells de ROS dels monòcits entrenats no contribueix a la seva millora en la producció de citocines proinflamatòries. (A) Nivells de ROS a les 2 h, 24 h i 6 dies després de l'exposició dels monòcits a -glucan i BCG (n=6/9 donants, agrupats a partir de 2/3 d'experiments independents. Prova de Fridman la prova de comparacions múltiples de Dunn) . (B) Nivells d'expressió dels gens implicats en la defensa antioxidant en monòcits exposats a -glucan durant 24 h en comparació amb cèl·lules no estimulades. L'expressió es presenta com a log10(proporció). TNF i IL-6 produïts per macròfags entrenats amb -glucan després d'un pretractament d'1 h amb (C) 0,5 µM DPI (n=6 donants, agrupats a partir de 2 experiments independents) i (D ) 1 mM NAC, 50 µM AT o 0,5 µM AA (n=6 donants, agrupats a partir de dos experiments independents, ANOVA bidireccional, prova de comparacions múltiples de Sidak). (mitjana ± SEM, * p <0,05).

Tanmateix, ni la inhibició del principal productor de ROS NADPH oxidasa amb difenileniodonium (DPI) ni l'addició de les molècules antioxidants -tocoferol (AT) i àcid ascòrbic (AA) abans de la incubació amb -glucan, van modular l'augment de la resposta dels macròfags. En els macròfags exposats a la secreció de -glucan, TNF i IL-6 24 h després que la reestimulació de LPS no es va modificar per aquest enfocament farmacològic (figura 1C, D).

Tanmateix, l'exposició només a DPI va augmentar la producció d'IL-6 després de l'estimulació de LPS. (Figura 1C). El pretractament amb l'eliminador general de ROS N-acetil cisteïna (NAC) va provocar una disminució de la producció de TNF i IL-6 en comparació amb les cèl·lules exposades només al glucà (figura 1D). En conjunt, mostrem que l'augment de la producció de ROS té un paper menor en l'augment de la producció de citocines de la immunitat entrenada induïda per glucans. A més, la immunitat entrenada que manté els nivells augmentats de ROS es podria aliar amb la modulació del glutatió antioxidant cel·lular, ja que NAC no només és un eliminador de ROS, sinó que també pot actuar com a precursor de la síntesi de glutatió.

3.2. El metabolisme del glutatió influeix en les respostes immunes entrenades

Els monòcits exposats a -glucan durant 24 h mostren nivells més alts de la forma oxidada de glutatió (GSSG), que és pels nivells més alts de ROS trobats en aquest moment (figura 2A). Després del període de repòs, la forma reduïda de glutatió (GSH) tendeix a augmentar en macròfags entrenats, sense alteració de les concentracions de la forma oxidada.

Figura 2. Els nivells de glutatió es modulen amb l'exposició a -glucans. (A) Nivells intracel·lulars de glutatió reduïts i oxidats als monòcits després d'una exposició de 24 hores amb 1 µg/ml de glucà i 5 dies després del període de repòs (n=4 donants, agrupats a partir de dos experiments independents). (B) Expressió de gens implicats en el metabolisme del glutatió en monòcits exposats a -glucan durant 4 h i 24 h. L'expressió es presenta com a log10(proporció). (C) TNF i IL-6 produïts per macròfags entrenats amb -glucan després d'un pretractament d'1 h amb 100 µM de BSO (donants n=9, agrupats a partir de tres experiments independents, * p < 0, 05 ANOVA bidireccional) , proves de comparacions múltiples de Sidak) (mitjana ± SEM).

Els gens que codifiquen per a les subunitats de l'enzim limitador de la velocitat glutamat cisteïna lligasa (GCLC i GCLM) mostren una expressió més gran a les 4 h després de l'estimulació amb glucans en comparació amb els monòcits control. La glutatió reductasa (GSR), la glutatió peroxidasa 7 (GPX7) i els enzims de la família de la glutaredoxina (GLRX, 2, 5) també estan regulats a l'alça en el punt de temps de 24 h (figura 2B), cosa que suggereix no només un augment de la síntesi, sinó també un augment de la síntesi. taxa de reciclatge de glutatió. La inhibició farmacològica de l'activitat de GCL amb butionina sulfoximina (BSO) abans de l'exposició a glucans condueix a una disminució de la producció d'IL-6 després de la reestimulació de LPS (figura 2C). Així, la modulació exògena dels nivells de glutatió, ja sigui la suplementació mitjançant l'addició del precursor NAC, o la seva disminució mitjançant el bloqueig de l'enzim GCL amb BSO, va esmorteir el -glucan va augmentar la resposta a l'estimulació secundària.

Per investigar més si la variació genètica dels gens implicats en el metabolisme del glutatió influeix en la immunitat entrenada, es va realitzar un mapeig QTL mitjançant una cohort de 325 individus sans. Hem provat si els SNP comuns amb una freqüència d'al·lel menor (MAF) > 0.05 en gens rellevants per al metabolisme del glutatió estaven associats amb canvis en la capacitat de producció de citocines proinflamatòries dels monòcits després de l'entrenament in vitro de -glucan i BCG (Figura 3A, C).

De la mateixa manera, també es va avaluar l'impacte d'aquestes variants genètiques en la immunitat entrenada in vivo induïda per la vacunació BCG de 278 individus sans (figura 3B, C). Diversos SNP dins d'una finestra de 250 kb de gens implicats en el metabolisme del glutatió es van associar de manera suggeridora (valor p < 9,99 × 10−3) amb la regulació a l'alça de la secreció d'IL-1, TNF i IL-6 després de l'entrenament. (Figura 3A, B).

A la mateixa cohort, vam mesurar els metabòlits plasmàtics implicats en el metabolisme del glutatió abans de la vacunació amb BCG. Els SNP identificats a les anàlisis in vitro i in vivo es van associar significativament amb les concentracions de glutatió circulants (valor p < 0.05) (figura 3D). A més, vam trobar una associació positiva entre la concentració de glutatió plasmàtic i la producció ex vivo d'IL-1 90 dies després de la vacunació amb BCG després de l'exposició in vitro a l'estímul heteròleg Staphylococcus aureus (figura 3E). La regulació positiva de la producció d'IL-1 mitjançant la vacunació BCG també s'associa positivament amb la concentració circulant d'altres metabòlits implicats en el metabolisme del glutatió, com la metionina, la cisteïna, el glutamat i la glicina (figura 3E). En general, els gens implicats en el metabolisme del glutatió que contenen QTL per a respostes heteròlogues innates, a LPS (figura 3A) o a S. aureus (figura 3B) i la correlació entre els nivells sèrics de glutatió i la producció d'IL-1 ex vivo, tots dos apunten a un paper d'aquesta via en l'establiment d'una immunitat entrenada.

Figura 3. El glutatió s'associa amb característiques d'immunitat entrenades. Mapa de calor dels valors p d'associació (p < 9,99 × 10-3) entre els SNP mapeats a gens implicats en el metabolisme del glutatió i la magnitud de la capacitat de producció de citocines per part de monòcits entrenats in vitro amb (A)-glucan i BCG (n=251 voluntaris sans per IL-6 i n=238 voluntaris sans per TNF ) i (B) respostes d'entrenament de BCG in vivo (n {{10}} voluntaris sans). (C) Gràfic de caixa del SNP de valor p més baix per anàlisi (rs7768134, rs35568915). (D) Gràfics de caixa que mostren els nivells plasmàtics de glutatió (corregits per edat i sexe) estratificats per genotip per a rs2233294 (GPX3) i rs10136944 (GLRX5, n=302). El valor p de cada SNP es deriva d'un model de regressió lineal amb el SNP d'interès com a variable independent i el glutatió (corregit per edat i sexe) com a variable dependent. (E) Correlacions de Spearman entre metabòlits circulants a la línia de base implicats en el metabolisme del glutatió versus canvis de vegades de les respostes IL-6, IL-1 i TNF induïdes per S. aureus derivats de PBMC, mesurades als 14 o 90 dies després Vacunació amb BCG en comparació amb la línia inicial (n=297 voluntaris sans). La taula presenta el rho de Spearman per a cada correlació, i les correlacions en vermell destaquen correlacions positives significatives (* p < 0, 05, ** p < 0, 01). La correlació entre la concentració de glutatió i el canvi de plec de la producció d'IL-1 als 90 dies en comparació amb el dia 0 es dóna com a exemple en un gràfic de dispersió.

4. Discussió

Els macròfags són cèl·lules plàstiques que adapten el seu fenotip a diferents estímuls ambientals. Els macròfags entrenats es basen en un metabolisme d'alta energia, amb un augment de la glucòlisi, el cicle de TCA i la fosforilació oxidativa, per generar una resposta amb una producció de citocines proinflamatòries millorades [6,22].

A més de la producció de citocines, l'explosió oxidativa amb una producció ràpida de ROS augmenta en macròfags entrenats amb BCG reestimulats [8]. Els neutròfils esplènics aïllats de ratolins tractats amb BCG també mostren una major producció de ROS [23]. D'acord amb la taxa metabòlica augmentada i l'augment de la capacitat de muntar una explosió oxidativa, vam observar que els monòcits i els macròfags exposats a -glucan o BCG presenten un augment de la producció basal de ROS. Un augment similar de l'alliberament de ROS es va informar anteriorment en monòcits entrenats amb oxLDL [9]. ROS té funcions efectores en l'eliminació de patògens, però també pot mediar la transducció del senyal [24]. La inhibició farmacològica de l'enzim productor de ROS NOX o el tractament amb molècules antioxidants -tocoferol i àcid ascòrbic no va eliminar el -glucan augmentar la producció de citocines. No obstant això, el NAC eliminador de ROS va inhibir la producció de TNF millorat per -glucan, cosa que indica un possible paper de les ROS en la immunitat entrenada.

Curiosament, el NAC no només és una molècula antioxidant, sinó que també actua com a precursor del glutatió, la principal molècula antioxidant endògena. Hi ha dos sistemes redox cel·lulars principals, els nucleòtids de piridina, com NAD plus /NADH, i els sistemes tiol, que inclouen el glutatió i les tioredoxines. La relació NAD més / NADH augmenta de manera sostinguda en els monòcits exposats al glucan després del període de diferenciació en macròfags entrenats [22], de manera similar al que informem per als nivells de ROS. Aquí mostrem que les concentracions de GSH també es modulen en la immunitat entrenada.

El més sorprenent és que la concentració de la forma reduïda amb GSH només es millora en macròfags entrenats diferenciats, mentre que els nivells de GSSG oxidat són estables. Això suggereix que els macròfags entrenats han augmentat les reserves de GSH, que a diferència de NAD més / NADH no s'associen amb la producció sostinguda de ROS. La contribució del metabolisme del glutatió a la immunitat entrenada es reforça encara més amb l'anàlisi genètica i metabòlica d'una cohort d'individus sans (300BCG). Es va trobar que els polimorfismes genètics comuns dins dels gens relacionats amb GSH influeixen en la magnitud de la producció de citocines sobre la immunitat entrenada in vitro i in vivo (p <9, 99 × 10−3). A més, es va trobar que dos d'aquests loci QTL, GPX3 a chr5 i GLRX5 a chr14, estaven associats amb les concentracions plasmàtiques de GSH (p <0, 05).

El GSH és una molècula antioxidant, però també se sap que regula l'expressió gènica mitjançant diferents mecanismes epigenètics. GSH participa en modificacions post-traduccionals, tal com s'observa en la S-glutationilació de la histona de la proteïna del nucleosoma H3, i està alimentat per la via de la metionina que finalment condueix a la producció de s-adenosil metionina (SAM). Al seu torn, SAM és el principal donant de metil utilitzat per a la metilació d'ADN i histones [7]. El fumarat del metabòlit del cicle TCA s'acumula en macròfags entrenats i el seu derivat monometil fumarat indueix un fenotip d'immunitat entrenat [5]. En els astròcits, l'exposició aguda al derivat del fumarat de dimetil esgota el GSH intracel·lular però augmenta el GSH total en moments posteriors [25]. La immunitat entrenada està ancorada per modificacions epigenètiques que confereixen memòria a llarg termini [26]. L'augment del contingut de GSH observat aquí dels macròfags entrenats podria facilitar el recablejat epigenètic necessari per a l'establiment de la memòria immune innata.

Aquí, mostrem que la modulació farmacològica del glutatió i l'estat redox de la cèl·lula disminueixen la resposta heteròloga del macròfag, tal com es veu per l'efecte de BSO o NAC sobre la producció de citocines millorada amb glucans. A més, en una cohort d'individus sans, el metabolisme del GSH s'associa amb trets d'immunitat entrenats. Els mecanismes d'immunitat entrenats que es configuren pel metabolisme del GSH encara s'han d'explorar més, però la possible implicació dels paisatges metabòlics i epigenètics fa que aquest centre metabòlic sigui una via emocionant per investigar en estudis futurs. Aquests coneixements contribueixen a desentranyar el cablejat metabòlic i epigenètic de la immunitat entrenada, permetent una millor comprensió de l'impacte immune innat sobre la salut i la malaltia. En definitiva, una millor comprensió ajudarà a identificar nous objectius de la teràpia en malalties caracteritzades per la desregulació dels processos immunitaris innats.

Contribucions de l'autor:

Conceptualització: AVF i JD-A.; metodologia: AVF, VACMK, VM i JCA-B., MAG; anàlisi formal: AVF, VACMK, VM i JCA-B.; investigació AVF, JCA-B., SK, LCJdB, SJCFMM, VPM i BN; cura de dades: AVF, VACMK, VM i BN; redacció—preparació de l'esborrany original, AVF; redacció: revisió i edició: tots els coautors; supervisió: MAG, MGN i JD-A.; Adquisició de finançament: MAG i MGN Tots els autors han llegit i han acceptat la versió publicada del manuscrit.

Finançament:

JD-A. compta amb el suport de l'Organització dels Països Baixos per a la Recerca Científica (subvenció VENI 09150161910024). MGN. compta amb el suport d'una beca ERC Advanced Grant (833247) i una beca Spinoza de l'Organització dels Països Baixos per a la Recerca Científica. AVF compta amb el suport de la Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT, beca Ph.D. PD/BD/135449/2017). JCAB compta amb el suport d'una beca del Departament Administratiu de Ciència, Tecnologia i Innovació, COLCIENCIAS, a Colòmbia (Convocatòria 756/2016). BN compta amb el suport d'una beca d'investigador NHMRC (Austràlia) (APP1173314).

Declaració de la Junta de Revisió Institucional:

L'estudi 300BCG va ser aprovat pel comitè d'ètica local CMO regió Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16.

Declaració de consentiment informat:

Es va obtenir el consentiment informat de tots els subjectes implicats en l'estudi, segons l'aprovació del comitè d'ètica Arnhem-Nijmegen (núm. 2010-104).

Declaració de disponibilitat de dades:

Les dades de seqüenciació d'ARN presentades en aquest estudi estan disponibles al NCBI Gene Expression Omnibus amb el número d'adhesió GSE85243.

Agraïments:

Els autors volen donar les gràcies a tots els voluntaris per participar en l'estudi 300BCG.

Conflictes d'interès:

MGN és un fundador científic de TTxD. La resta d'autors no declaren cap conflicte d'interessos. Els finançadors no van tenir cap paper en el disseny de l'estudi; en la recollida, anàlisi o interpretació de dades; en la redacció del manuscrit, o en la decisió de publicar els resultats.

Referències

1. Netea, MG; Domínguez-Andrés, J.; Barreiro, LB; Chavakis, T.; Divangahi, M.; Fuchs, E.; Joosten, LAB; van der Meer, JWM; Mhlanga, MM; Mulder, WJM; et al. Definició de la immunitat entrenada i el seu paper en la salut i la malaltia. Nat. Reverent Immunol. 2020, 20, 375–388. [Ref creuat]

2. Quintin, J.; Saeed, S.; Martens, JHA; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Ifrim, DC; Logie, C.; Jacobs, L.; Jansen, T.; Kullberg, BJ; Wijmenga, C.; et al. La infecció per Candida albicans ofereix protecció contra la reinfecció mitjançant la reprogramació funcional dels monòcits. Cell Host Microbe 2012, 12, 223–232. [Ref creuat]

3. Bekkering, S.; Quintin, J.; Joosten, LA; Van Der Meer, JW; Netea, MG; Riksen, la lipoproteïna de baixa densitat oxidada NP indueix la producció de citocines proinflamatòries a llarg termini i la formació de cèl·lules d'escuma mitjançant la reprogramació epigenètica dels monòcits. Arter. Tromb. Vasc. Biol. 2014, 34, 1731–1738. [CrossRef] [PubMed]

4. Benn, CS; Netea, MG; Selin, LK; Aaby, P. A Small Jab-A Big Effect: immunomodulació inespecífica per vacunes. Tendències Immunol. 2013, 34, 431–439. [Ref creuat]

5. Arts, RJW; Novakovic, B.; ter Horst, R.; Carvalho, A.; Bekkering, S.; Lachmandas, E.; Rodrigues, F.; Silvestre, R.; Cheng, SC; Wang, SY; et al. La glutaminòlisi i l'acumulació de fumarats integren programes immunometabòlics i epigenètics en la immunitat entrenada. Metab cel·lular. 2016, 24, 807–819. [CrossRef] [PubMed]

6. Keating, S.; Groh, L.; van der Heijden, C.; Rodríguez, H.; Dos Santos, J.; Fanucchi, S.; Okabe, J.; Kn, H.; van Puffelen, J.; Helder, L.; et al. La lisina metiltransferasa Set7 regula la plasticitat en la fosforilació oxidativa necessària per a la immunitat entrenada induïda pel beta-glucà. Cell Rep. 2020, 31, 107548. [CrossRef] [PubMed]

7. García-Giménez, JL; Romá-Mateo, C.; Pérez-Machado, G.; Peiró-Chova, L.; Pallardó, FV Paper del glutatió en la regulació dels mecanismes epigenètics en la malaltia. Radic Lliure. Biol. Med. 2017, 112, 36–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Bekkering, S.; Blok, BA; Joosten, LAB; Riksen, NP; Van Crevel, R.; Netea, MG Model experimental in vitro d'immunitat innata entrenada en humans. Clin. Vacuna Immunol. 2016, 23, 926–933. [Ref creuat]

9. Sohrabi, Y.; Lagache, SMM; Schnack, L.; Godfrey, R.; Kahles, F.; Bruemmer, D.; Waltenberger, J.; Findeisen, HM L'estrès oxidatiu dependent de mTOR regula la immunitat innata induïda per oxLDL en monòcits humans. Davant. Immunol. 2019, 9, 3155. [CrossRef] [PubMed]

10. Van Der Heijden, CDCC; Keating, ST; Groh, L.; Joosten, LAB; Netea, MG; Riksen, NP L'aldosterona indueix una immunitat entrenada: el paper de la síntesi d'àcids grassos. Cardiovasc. Res. 2020, 116, 317–328. [Ref creuat]

11. Domínguez-Andrés, J.; Arts, RJW; Bekkering, S.; Bahrar, H.; Blok, BA; de Bree, LCJ; Bruno, M.; Bulut, Ö.; Debisarun, PA; Dijkstra, H.; et al. Inducció in vitro de la immunitat entrenada en monòcits humans adherents. STAR Protocol. 2021, 2, 100365. [CrossRef] [PubMed]

12. Novakovic, B.; Habibi, E.; Wang, S.-Y.; Arts, RJW; Davar, R.; Megchelenbrink, W.; Kim, B.; Kuznetsova, T.; Kox, M.; Zwaag, J.; et al. -El glucà inverteix l'estat epigenètic de la tolerància immunològica induïda per LPS. Cèl·lula 2016, 167, 1354–1368.e14. [Ref creuat]

13. Kostidis, S.; Addie, RD; Morreau, H.; Mayboroda, OA; Giera, M. Anàlisi quantitativa de RMN del metabolisme intra i extracel·lular de cèl·lules de mamífers: un tutorial. Anal. Chim. Acta 2017, 980, 1–24. [Ref creuat]

14. Koeken, VACM; de Bree, LCJ; Mourits, VP; Moorlag, SJCFM; Caminar, J.; Cirovic, B.; Arts, RJW; Jaeger, M.; Dijkstra, H.; Lemmers, H.; et al. La vacunació amb BCG en humans inhibeix la inflamació sistèmica de manera dependent del sexe. J. Clin. Investig. 2020, 130, 5591–5602. [Ref creuat]

15. Projecte de Genòmica Funcional Humana. Disponible en línia: http://www.humanfunctionalgenomics.org/site/ (consultat el 19 d'abril de 2021).

16. Shah, TS; Liu, JZ; Floyd, JAB; Morris, JA; Wirth, N.; Barrett, JC; Anderson, CA OptiCall: un robust algorisme de trucada de genotips per a variants rares, de baixa freqüència i comunes. Bioinformàtica 2012, 28, 1598–1603. [Ref creuat]

17. Deelen, P.; Bonder, MJ; Van Der Velde, KJ; Westra, HJ; Winder, E.; Hendriksen, D.; Franke, L.; Swertz, MA Harmonitzador de genotips: alineació automàtica de cadena i conversió de format per a la integració de dades de genotip. BMC Res. Notes 2014, 7. [CrossRef]

18. McCarthy, S.; Das, S.; Kretzschmar, W.; Delaneau, O.; Fusta, AR; Teumer, A.; Kang, HM; Fuchsberger, C.; Danecek, P.; Sharp, K.; et al. Un panell de referència de 64.976 haplotips per a la imputación de genotips. Nat. Genet. 2016, 48, 1279–1283. [Ref creuat]

19. Shabalin, AA Matrix eQTL: anàlisi eQTL ultra ràpida mitjançant operacions de matriu grans. Bioinformàtica 2012, 28, 1353–1358. [Ref creuat]

20. Fuhrer, T.; Heer, D.; Begemann, B.; Zamboni, N. Perfil de metabolomes de massa precís i d'alt rendiment d'extractes cel·lulars mitjançant espectrometria de masses d'injecció de flux i temps de vol. Anal. Chem. 2011, 83, 7074–7080. [Ref creuat]

21. Kalafati, L.; Kourtzelis, I.; Schulte-schrepping, J.; Verginis, P.; Mitroulis, I. L'entrenament immunitari innat de la granulopoiesi promou l'activitat antitumoral. Cel·la 2020, 183, 771–785.e12. [Ref creuat]

22. Cheng, SC; Quintin, J.; Cramer, RA; Shepardson, KM; Saeed, S.; Kumar, V.; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Martens, JHA; Rao, NA; Aghajanirefah, A.; et al. La glucòlisi aeròbica mediada per MTOR i HIF-1 -com a base metabòlica per a la immunitat entrenada. Science 2014, 345, 1250684. [CrossRef]

23. Moorlag, SJCFM; Rodríguez-Rosales, YA; Gillard, J.; Fanucchi, S.; Theunissen, K.; Novakovic, B.; de Bont, CM; Negishi, Y.; Fok, ET; Kalafati, L.; et al. La vacunació BCG indueix la reprogramació funcional a llarg termini dels neutròfils humans. Cell Rep. 2020, 33. [CrossRef]

24. Forrester, SJ; Kikuchi, DS; Hernandes, MS; Xu, Q.; Griendling, KK Espècies d'oxigen reactives en senyalització metabòlica i inflamatòria. Circ. Res. 2018, 122, 877–902. [Ref creuat]

25. Brennan, MS; Matos, MF; Li, B.; Hronowski, X.; Gao, B.; Juhasz, P.; Rodes, KJ; L'escannevin, el fumarat de dimetil RH i el fumarat de monoetil presenten efectes diferencials sobre l'activació de KEAP1, NRF2 i l'esgotament del glutatió in vitro. PLoS ONE 2015, 10, e0120254. [Ref creuat]

26. Kaufmann, E.; Sanz, J.; Dunn, JL; Khan, N.; Mendonça, LE; Pacis, A.; Tzelepis, F.; Pernet, E.; Dumaine, A.; Grenier, J.-C.; et al. BCG educa les cèl·lules mare hematopoètiques per generar immunitat innata protectora contra la tuberculosi. Cel·la 2018, 172, 176–190.e19. [Ref creuat]

Anaisa V. Ferreira 1,2,* , Valerie ACM Koeken 1,3,4 , Vasiliki Matzaraki 1 , Sarantos Kostidis 5 , Juan Carlos Alarcon-Barrera 5 , L. Charlotte J. de Bree 1 , Simone JCFM Moorlag 1 , Vera P Mourits 1, Boris Novakovic 6,7, Martin A. Giera 5, Mihai G. Netea 1,8 i Jorge Domínguez-Andrés.

1 Departament de Medicina Interna i Radboud Center for Infectious Diseases (RCI), Radboud University Nijmegen Medical Center, 6500 HB Nijmegen, Països Baixos;

Valerie.Koeken@radboudumc.nl (VACMK); Vasiliki.Matzaraki@radboudumc.nl (VM);

Charlotte.deBree@radboudumc.nl (LCJdB); Simone.Moorlag@radboudumc.nl (SJCFMM);

Vera.Mourits@radboudumc.nl (VPM); Mihai.Netea@radboudumc.nl (MGN).

2 Instituto de Ciências Biomèdicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4050-313 Porto, Portugal.

3 TWINCORE, una empresa conjunta entre el Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI) i la Hannover Medical School (MHH), 30625 Hannover, Alemanya.

4 Center for Individualized Infection Medicine (CiiM), Departament de Biologia Computacional per a Individualized Infection Medicine, una empresa conjunta entre el Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI) i la Hannover Medical School (MHH), 30625 Hannover, Alemanya.

5 Centre de Proteòmica i Metabolòmica, Centre Mèdic de la Universitat de Leiden (LUMC), 2333 ZA Leiden, Països Baixos; s.kostidis@lumc.nl (SK); jcalarcon_barrera@lumc.nl (JCA-B.);m.a.giera@lumc.nl (MAG)

6 Epigenetics Research, Murdoch Children's Research Institute, Parkville, VIC 3052, Austràlia;boris.novakovic@mcri.edu.au.

7 Departament de Pediatria, Universitat de Melbourne, Melbourne, VIC 3052, Austràlia.

8 Departament de Genòmica i Immunoregulació, Institut de Ciències Mèdiques i de la Vida (LIMES), Universitat de Bonn, 53115 Bonn, Alemanya.

* Correspondència: anaisa.validoferreira@radboudumc.nl (AVF); Jorge.dominguezandres@radboudumc.nl (JD-A.); Tel.: més 31-2436-16636 (JD-A.).

For more information:1950477648nn@gmail.com